蝦青素生物合成代謝工程研究進(jìn)展

1、蝦青素生物合成代謝工程研究進(jìn)展 摘要 蝦青素是一種具有極強(qiáng)生物抗氧化性的酮式類胡蘿卜素，在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面有著極廣闊的應(yīng)用前景。目前生物技術(shù)法為蝦青素的主要生產(chǎn)方法。本文以蝦青素生產(chǎn)所涉及的關(guān)鍵酶、代謝途徑及其改造為對象，系統(tǒng)綜述了蝦青素生產(chǎn)所涉及的代謝工程技術(shù)及其最新研究進(jìn)展，并探討了將來的發(fā)展前景。 關(guān)鍵詞 蝦青素；代謝工程；進(jìn)展 中圖分類號 ts201文獻(xiàn)標(biāo)識碼a 文章編號1673-7210（2008）07（b）-029-02 蝦青素是一種非維生素a源的酮式類胡蘿卜素。近年來的藥理學(xué)和生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蝦青素具有極強(qiáng)的生物抗氧化性，此外，還具有促進(jìn)抗體產(chǎn)生、增強(qiáng)免疫力以及抗紫外線輻射

2、等作用，因而在醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)業(yè)、化妝品等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。 目前，蝦青素的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、蝦殼類提取、生物技術(shù)法。由于化學(xué)合成工藝復(fù)雜，而且蝦殼類廢棄物中蝦青素的含量低，因此生產(chǎn)成本均較高。生物技術(shù)法研究最廣泛的是利用紅發(fā)夫酵母和雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素，其研究大量集中在高產(chǎn)菌株的選育、廉價培養(yǎng)基的利用、培養(yǎng)條件的優(yōu)化和產(chǎn)物提取等方面，近幾年來，如何通過代謝工程提高生物合成蝦青素逐漸成為研究熱點。由于蝦青素在生物體內(nèi)合成的主要化學(xué)途徑及代謝過程已基本上被詳細(xì)描述，且編碼蝦青素合成路線中不同酶的基因已經(jīng)從細(xì)菌、植物、藻類和真菌的細(xì)胞中克隆出來1，這為采用代謝工程技術(shù)構(gòu)建工程菌種和優(yōu)

3、化蝦青素合成代謝網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外已有研究者開始采用代謝工程手段進(jìn)行蝦青素菌種的構(gòu)建和代謝途徑的調(diào)控，并取得了較大的進(jìn)展，本文對此進(jìn)行了綜述，并探討了其發(fā)展前景。 1蝦青素的代謝途徑 由于蝦青素是一種次生類胡蘿卜素，因此其在微生物細(xì)胞內(nèi)的合成步驟較多且較復(fù)雜。最初對類胡蘿卜素合成途徑的研究是從細(xì)菌和海洋細(xì)菌開始的。從已報道的蝦青素生物合成途徑來看，基本上可將其分為兩個階段，第一階段是合成-胡蘿卜素，第二階段是-胡蘿卜素經(jīng)氧化（酮基化）和羥基化形成蝦青素2。 第一階段即-胡蘿卜素的合成過程中，紅發(fā)夫酵母與雨生紅球藻的主要差別就是-胡蘿卜素合成的關(guān)鍵物質(zhì)異戊烯焦磷酸(ipp)的合成途徑不同

4、。紅發(fā)夫酵母與其他酵母一樣通過甲羥戊酸途徑合成異戊烯焦磷酸。而關(guān)于雨生紅球藻合成異戊烯焦磷酸的途徑原來認(rèn)為也是通過甲羥戊酸途徑，然而1993年rohmer等3用c-13-nmr標(biāo)記實驗發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌細(xì)胞中異戊烯焦磷酸可以由3-磷酸甘油醛和丙酮酸兩種前體物質(zhì)合成后，schwender等4和lichtenthaler5又分別發(fā)現(xiàn)綠藻和植物細(xì)胞也是通過此途徑，即非甲羥戊酸途徑合成異戊烯焦磷酸，即以丙酮酸為起始物，經(jīng)過與3-磷酸甘油醛(gap)反應(yīng)而合成異戊烯焦磷酸。 第二階段由-胡蘿卜素合成蝦青素的過程中合成路線也分為兩條：第一條路線是從-胡蘿卜素氧化（酮基化）開始，經(jīng)過海膽酮(echinenone)、

5、雞油菌黃質(zhì)(canthaxanthin)，4，4-二酮基-3-羥基-胡蘿卜素等中間物質(zhì)合成蝦青素。第二條路線是-胡蘿卜素首先羥基化形成-隱黃質(zhì)(-cryptoxanthin)，然后經(jīng)玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)和3，3-二羥基-4-酮基-胡蘿卜素等中間物質(zhì)合成蝦青素6。這兩條可能的路線本質(zhì)在于-胡蘿卜素是先酮基化還是先羥基化。雨生紅球藻合成蝦青素的過程中，-胡蘿卜素羥基化的中間產(chǎn)物-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)能減少或降低其酮基化產(chǎn)物的形成7，但這與雨生紅球藻的蝦青素含量較高的事實相矛盾，因此我們推斷雨生紅球藻合成蝦青素的合成路線是第一條。而紅發(fā)夫酵母中目前哪一條是主要路線還沒有結(jié)論。 現(xiàn)在已經(jīng)從細(xì)菌

6、、真菌、植物中克隆到大量類胡蘿卜素生物合成基因。一般采用crt加英文大寫字母表示類胡蘿卜素生物合成基因，但最近新發(fā)現(xiàn)的基因基本取酶英文名稱縮寫。 2蝦青素代謝工程 2.1外源蝦青素合成基因的導(dǎo)入 以不能合成蝦青素的大腸桿菌、藍(lán)藻、酵母等可以在人為控制下快速增殖的微生物體為受體，表達(dá)蝦青素的一系列合成酶基因，使其實現(xiàn)合成酶的組成型高效表達(dá)，目前已有人從事這方面的工作8。例如，產(chǎn)朊假絲酵母(candida utilis)細(xì)胞內(nèi)積累麥角固醇但不能合成類胡蘿卜素，但可以引入外源基因，同時轉(zhuǎn)化crtebiyzw，并在產(chǎn)朊假絲酵母中表達(dá)，合成了蝦青素9。 另外，也可以采用植物作為受體來表達(dá)蝦青素合成基因。

7、山東省花生研究所通過與中國科學(xué)院海洋所的合作研究，克隆得到了控制蝦青素生物合成的關(guān)鍵酶基因-胡蘿卜素羥化酶基因(crtz)ay187011和-胡蘿卜素酮化酶基因(crtw)ay387656，建立了crtz和crtw高效表達(dá)的二元載體系統(tǒng)并將其轉(zhuǎn)入花生，通過代謝工程使蝦青素在花生種皮中高效表達(dá)。 2.2蝦青素代謝途徑的改造 除了將外源蝦青素合成基因?qū)氡旧聿缓铣晌r青素的受體以外，也可以采用本身可以合成蝦青素的雨生紅球藻或紅發(fā)夫酵母等為代謝工程的受體， 通過改變蝦青素合成酶的數(shù)量、活力以及調(diào)控機(jī)制，實現(xiàn)蝦青素的高效表達(dá)10。 國外已有很多研究者開始對紅發(fā)夫酵母采用代謝工程手段進(jìn)行菌種的構(gòu)建。通過克

8、隆其他微生物的類胡蘿卜素合成基因來改良紅發(fā)夫酵母轉(zhuǎn)化體系，定向基因改造其蝦青素合成途徑。將crtyb轉(zhuǎn)化到紅發(fā)夫酵母中，并使其過量表達(dá)，結(jié)果表明-胡蘿卜素和海膽酮的產(chǎn)量大大增加，蝦青素的含量沒有增加，說明在這些重組菌株中，氧化反應(yīng)是限速步驟。八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因crti在紅發(fā)夫酵母中的高效表達(dá)表現(xiàn)為單環(huán)類胡蘿卜素（例如torulene和3-羥-3，4-二脫氫-，-胡蘿卜素-4-酮）的增加和雙環(huán)類胡蘿卜素（例如-胡蘿卜素、海膽酮和蝦青素）的減少，說明此酶過量表達(dá)的結(jié)果是導(dǎo)致分支代謝嚴(yán)重影響主干代謝，也說明通過代謝通量和代謝流的分析，可以采用相應(yīng)的基因操作手段來改造蝦青素的生物合成途徑，降低

9、其他副產(chǎn)物的形成，例如通過增強(qiáng)蝦青素代謝途徑的通量或者切斷其他分支代謝產(chǎn)物等的合成途徑等都有助于提高蝦青素的合成。alvarez等11的新研究發(fā)現(xiàn)，從紅發(fā)夫酵母中克隆出編碼新的細(xì)胞色素p450羥化酶的基因crts，轉(zhuǎn)化到蝦青素合成能力受阻的紅發(fā)夫酵母菌株后，使其恢復(fù)了合成能力。已有的研究均表明，蝦青素合成途徑中的代謝流可以通過改變類胡蘿卜素合成酶中特定酶的數(shù)量和活力來進(jìn)行控制，因此各種目的產(chǎn)物的產(chǎn)量也可以采用相應(yīng)的方法來增加。 3問題與展望 傳統(tǒng)的菌種選育可以在一定程度上提高細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量，但隨機(jī)性大、方向性差。目前，雖然代謝工程在構(gòu)建工程菌生產(chǎn)蝦青素方面取得了一定的成效，但這些設(shè)計策略主

10、要是針對單基因或幾個基因進(jìn)行遺傳修飾，往往不能顯著改變整個代謝途徑的通量。轉(zhuǎn)基因加速了相應(yīng)酶催化限速反應(yīng)，促進(jìn)了蝦青素合成，但同時也可能導(dǎo)致其他代謝途徑失衡，發(fā)生紊亂。因此在將來的進(jìn)一步研究中，若能轉(zhuǎn)入可進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)的調(diào)控子單元，則可以根據(jù)代謝中間產(chǎn)物量調(diào)控基因表達(dá)，減少由于代謝失衡造成的負(fù)面影響，這種模式具有較廣闊的前景?？傊?，隨著研究的深入，人類將通過微生物代謝工程技術(shù)，創(chuàng)造出合理、經(jīng)濟(jì)的蝦青素細(xì)胞工廠。 參考文獻(xiàn) 1armstrong ga. eubacteria show their ture colors: genetics of carotenoids pigment biosyn

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