XX人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室sop文件匯編細(xì)菌室操作程序文件

1、內(nèi)江市第六人民醫(yī)院作業(yè)指導(dǎo)書內(nèi)內(nèi)江江市市第第六六人人民民醫(yī)醫(yī)院院檢檢驗(yàn)驗(yàn)科科微生物室微生物室微生物室微生物室微生物室微生物室 sopsopsopsopsopsop 文件匯編文件匯編文件匯編文件匯編文件匯編文件匯編（第四版）（第四版） 編制：編制： 審核：審核： 批準(zhǔn)：批準(zhǔn)： 生效日期：二零一二年一月一日生效日期：二零一二年一月一日內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 1 -1. 細(xì)菌室人員崗位職責(zé).22. 細(xì)菌室工作人員管理規(guī)定及報(bào)告時(shí)間.43. 標(biāo)本采集及保存要求74. 顯微鏡檢查法操作規(guī)程95. 細(xì)菌室標(biāo)本操作流程116. 細(xì)菌室形態(tài)檢查操作規(guī)程1

2、37. 細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其他實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程188. 細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程239. 支原體培養(yǎng)、鑒定、計(jì)數(shù)及藥敏操作規(guī)程2510. 血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程2711. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程2912. 創(chuàng)傷和外科感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程3113. 下呼吸道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程3214. 消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程3415. 尿路感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程3516. 膿汁及病灶分泌物細(xì)菌檢驗(yàn)操作規(guī)程3617. 生殖系統(tǒng)標(biāo)本的處理3818. 超廣譜 內(nèi)酰胺酶（esblsesbls）檢.4019. 消毒滅菌效果監(jiān)測(cè).4120. 環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè).4221. 采樣及檢查原則 .4322

3、. 各部位的消毒.48文件編碼jyk-sop001文件名稱細(xì)菌室人員崗位職責(zé)執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.02.01內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 2 -細(xì)菌室人員崗位職責(zé)1、上班后先搞好室內(nèi)衛(wèi)生、核查各個(gè)培養(yǎng)箱、冰箱的工作溫度是否在設(shè)定的范圍內(nèi)，并做好記錄。2、檢查各種培養(yǎng)基及試劑的庫(kù)存量，做好需配制培養(yǎng)基或購(gòu)買試劑的交班工作。3、接收樣本：核對(duì)各樣本號(hào)與申請(qǐng)單聯(lián)號(hào)是否一致，如不一致馬上與病房聯(lián)系以便作出相應(yīng)的處理，如退單或重送樣本等，并做好聯(lián)系情況的記錄。核查各送檢樣本是否符合要求。 痰液樣本：先看外觀、再直接涂片鏡檢，低倍鏡下見白細(xì)胞25 個(gè)，10上皮細(xì)胞25 個(gè)，上皮細(xì)胞

4、 10 每個(gè)視野，為合格痰液。 無(wú)菌體液樣本：檢查各種無(wú)菌體液樣本的盛放器皿是否符合要求。 容易干燥的樣本：對(duì)一些容易干燥的樣本如大便、咽拭子、膿液拭子、泌尿生殖道 拭子等是否已經(jīng)干燥。對(duì)不符合要求的樣本必需與臨床聯(lián)系，以便作出相應(yīng)處理，方法如聯(lián)號(hào)不符的樣本。做好記錄。對(duì)符合的樣本進(jìn)行原始單的登記。7、樣本編號(hào)：對(duì)符合的樣本作出編號(hào)，普通細(xì)菌培養(yǎng)：痰液、咽拭子、血液增菌培養(yǎng)、內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 5 -尿液、胸、腹水、腦脊液、膽汁、膿液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培養(yǎng)。在各種培養(yǎng)基上及申請(qǐng)單上編號(hào)的同時(shí)均需明確標(biāo)明接種日期。樣本接種： 血液、骨髓、腹水、關(guān)節(jié)液等：血平

5、板、mac 痰液、咽拭子、腦脊液分別接種：血平板、巧克力平板、麥康凱平板； 尿液接種：血平板、巧克力平板、mac；各種無(wú)菌體液、膿液、泌尿生殖道分泌物接種：血平板；巧克力平板；大便致病菌：接種 ss 平板、麥康凱平板；分泌物的淋球菌培養(yǎng)接種：巧克力平板；支原體培養(yǎng)+藥敏，按說明書接種支原體專用培養(yǎng)瓶；對(duì)以上接種樣本的當(dāng)前編號(hào)應(yīng)記錄于登記本上。此外對(duì)痰液在接種的同時(shí)應(yīng)對(duì)其沉渣進(jìn)行革蘭染色，如有細(xì)菌和或何種細(xì)菌為主即刻的向臨床發(fā)出第一級(jí)初級(jí)報(bào)告，并做好記錄。8、對(duì)一些不適合用儀器檢測(cè)藥敏的細(xì)菌，改用標(biāo)準(zhǔn)的 k.b 法進(jìn)行檢測(cè)。碰到異常的耐藥模式應(yīng)及時(shí)上報(bào)組長(zhǎng)，如碰到耐萬(wàn)古霉素的葡萄球菌、糞腸球菌，

6、耐泰能的大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬等。并加做特殊的藥敏紙片，并改用紙片法加以比較。9、對(duì)一些特殊細(xì)菌，如嗜血桿菌、棒狀桿菌、李斯特菌屬等用相應(yīng)的鑒定條進(jìn)行鑒定，用相應(yīng)的手工實(shí)驗(yàn)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，操作嚴(yán)格參照說明書。10、對(duì)所完成的各種發(fā)向臨床的微生物學(xué)報(bào)告單，要認(rèn)真檢查，并給上行政班的人員核查，確認(rèn)一切無(wú)錯(cuò)后，方能發(fā)出。11、做好菌種的保存，對(duì)一些難得的菌株、標(biāo)準(zhǔn)菌株等要定期移種，一般二周一次，并做好移種記錄。定期做好本室所用各種鑒定藥敏試條的質(zhì)控，一周一次(或每個(gè)批號(hào)一次)，做好記錄。12、檢查本崗位各種培養(yǎng)基及試劑的庫(kù)存量，做好需配制培養(yǎng)基或購(gòu)買試劑的交班工作。對(duì)需購(gòu)買的試劑、平板、培

7、養(yǎng)基、染色液以及需配置的培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)交班。13、工作完成后注意對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒、室內(nèi)進(jìn)行消毒。離開科室前交好班。二、行政上班人員二、行政上班人員1、上班后首先搞好室內(nèi)衛(wèi)生。2、將臨床室的培養(yǎng)標(biāo)本拿回。3、對(duì)有新到崗的實(shí)習(xí)或進(jìn)修人員時(shí)，應(yīng)認(rèn)真交代本崗位的一切事宜并且認(rèn)真作好帶教工作。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 6 -4、涂片染色：抗酸染色嚴(yán)格按照操作規(guī)程，漂浮法涂片痰液樣本，胸腹水、尿液、腦脊液等取沉淀涂厚片，自然干燥后固定，按說明書染色后鏡檢。5、臨床標(biāo)本細(xì)菌或門診標(biāo)本 g-雙球菌涂片，應(yīng)用滾動(dòng)式涂片法從波片一端涂向另一端，反復(fù)幾次，火焰固定后進(jìn)行革蘭染色。6、每天必須消

8、毒平板、基礎(chǔ)培養(yǎng)基等用于常規(guī)醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)或 k.b 藥敏試驗(yàn)；另外根據(jù)具體情況即時(shí)準(zhǔn)備好各種中和劑、無(wú)菌瓶等，對(duì) 48 小時(shí)的空氣培養(yǎng)出報(bào)告，同時(shí)注意是否有致病菌、菌落數(shù)是否超標(biāo)。7、檢查本崗位各種培養(yǎng)基及試劑的庫(kù)存量，做好需配制培養(yǎng)基或購(gòu)買試劑的交班工作。對(duì)需購(gòu)買的試劑、平板、培養(yǎng)基、染色液以及需配置的培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)交班。8、工作完成后注意對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒、室內(nèi)進(jìn)行消毒。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 7 -文件編碼jyk-sop003文件名稱標(biāo)本采集及保存要求執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01標(biāo)本采集及保存要求1、總則：用于細(xì)菌培養(yǎng)的標(biāo)本在收集時(shí)應(yīng)注意嚴(yán)格無(wú)菌操作和及時(shí)

9、送檢，檢測(cè)后標(biāo)本應(yīng)妥善保存。2、臨床標(biāo)本的采集2.1、下呼吸道分泌物(痰液)令患者早上起床后用清水瀨口，不要刷牙，立即從下部呼吸道咳出第一口痰，吐在無(wú)菌塑料痰盒中，及時(shí)送檢。2.2、尿液(中段尿)護(hù)理人員協(xié)助采取中段尿約 3ml 入無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。2.3、糞便：取有粘液、膿血部分的糞便置無(wú)菌塑料盒中及時(shí)送檢。2.4、眼、耳、鼻、喉拭子：將棉拭子沾取少許無(wú)菌生理鹽水(如沾取的太多，可在無(wú)菌生理鹽水瓶壁上擠去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒懸于無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。2.5、膿液：用沾有生理鹽水的棉拭子沾取膿液，要盡量多取一些，然后將棉拭置于無(wú)菌塑料盒中，及時(shí)送檢。2.6、血液：

10、2.6.1、凡懷疑菌血癥和敗血病的患者，采血培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，應(yīng)盡量選擇抗菌素在體內(nèi)濃度最低時(shí)采血，應(yīng)在病人第二次使用抗菌素之前采集血培養(yǎng)標(biāo)本。當(dāng)然在病人發(fā)熱或寒顫時(shí)采集也可。2.6.2、成人每次采血 510m1，小兒采血 23ml；2.6.3、嚴(yán)格消毒病人采血部位和血培養(yǎng)瓶口，抽一定量血液后，無(wú)菌注入血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕輕搖勻，2.6.4、從抽血到接種入瓶，動(dòng)作要快，防止血液凝固，同時(shí)要及時(shí)送檢。2.7、穿刺液：胸腹水、心包液、關(guān)節(jié)腔液、鞘膜積液，嚴(yán)格無(wú)菌抽取后，注入含肝素抗凝的無(wú)菌試管中，輕輕顛倒試管 10 余次，使肝素與穿刺液混勻達(dá)到抗凝的目的，或直接無(wú)菌注入

11、血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)及時(shí)送檢。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 8 -2.8、膽汁：由專科醫(yī)生以無(wú)菌方法取引流液 10m1 注入無(wú)菌塑料盒內(nèi)。2.9、腦脊液：以無(wú)菌方法取腦脊液 35ml，置無(wú)菌試管內(nèi)，常溫保存送檢，如只做培養(yǎng)可直接無(wú)菌注入血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，及時(shí)送檢。2.10、生殖器官標(biāo)本：陰道、子宮頸及前列腺等分泌物應(yīng)由醫(yī)師采集，收集于無(wú)菌塑料盒內(nèi)送檢。如疑為淋病奈瑟菌感染，做培養(yǎng)檢查時(shí)，采集的標(biāo)本應(yīng)床旁接種并及時(shí)放入孵箱培養(yǎng)。2.11、燒傷標(biāo)本：以無(wú)菌棉拭子直接采取多個(gè)部位創(chuàng)面的膿汁分泌物放入無(wú)菌塑料盒中。2.12、支原體(解脲、人型)培養(yǎng)+藥敏的標(biāo)本采集2.12.1、支原體對(duì)干、熱抵抗力差

12、，標(biāo)本采集后應(yīng)盡快接種支原體運(yùn)送培養(yǎng)基送檢。2.12.2、男性：用細(xì)的無(wú)菌棉拭子沾取無(wú)菌鹽水少許深入尿道口內(nèi) 22.53、臨床標(biāo)本的保存3.1、細(xì)菌室標(biāo)本原則上要求及時(shí)送檢、及時(shí)處理，不得保存。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 9 -文件編碼jyk-sop004文件名稱顯微鏡檢查法操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01顯微鏡檢查法操作規(guī)程顯微鏡檢查是細(xì)菌鑒定工作中的一重要手段，有助于細(xì)菌的初步鑒別，同時(shí)對(duì)下一步鑒定工作起著重要的指導(dǎo)作用。有時(shí)通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。顯微鏡檢查有不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法兩種。

13、1、不染色標(biāo)本的檢查：不染色標(biāo)本主要用于檢查細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。1.1、壓滴法：用接種環(huán)取細(xì)菌懸液 2 環(huán)，置于清潔載玻片中央，覆上蓋玻片，于高倍鏡下觀察。制片時(shí)菌液要適量，不可有氣泡，不可外溢。1.2、懸滴法：取潔凈的凹窩載玻片及蓋玻片各 1 塊，將凹孔四周的平面上涂上一層凡士林，取一環(huán)菌液置蓋玻片中央，將凹窩載玻片的凹面向下，對(duì)準(zhǔn)于蓋玻片的液滴上，然后迅速翻轉(zhuǎn)玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片使之與凹孔邊緣粘緊。鏡下觀察時(shí)先低倍后高倍，不可壓碎蓋玻片。有動(dòng)力的細(xì)菌可見細(xì)菌從一處移到另一處，無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動(dòng)而無(wú)位置的改變。螺旋體由于菌體纖細(xì)、透明，需用暗視野顯微鏡觀察其形態(tài)、活動(dòng)。2、染色標(biāo)本

14、檢查法；通過對(duì)標(biāo)本的制片及染色，能觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性以及莢膜、芽胞、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步鑒定。2.1、快速革蘭染色法2.1.1、操作見試劑說明書2.1.2、結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。2.1.3、注意事項(xiàng)：染色關(guān)健在于涂片和脫色，涂片不宜過厚，固定不宜過熱，脫色不宜過度，菌齡為 1824 小時(shí)為佳。2.2、抗酸染色法2.2.1、操作見試劑說明書2.2.2、結(jié)果：抗酸桿菌呈紅色。2.2.3、注意事項(xiàng)：每一張玻片只能涂一份標(biāo)本且不能在染色缸中染色，以免造成不同標(biāo)本間的交互污染從而導(dǎo)致陰陽(yáng)性結(jié)果混淆，脫色時(shí)間寧長(zhǎng)勿短，至無(wú)紅色液體流下為止。內(nèi)江市第六人

15、民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 10 -2.3、阿爾培異染顆粒染色法：2.3.1、初染：涂片上滴加第一液染劑(甲苯胺藍(lán)和孔雀綠的乙醇溶液)，染 35 分鐘，水洗。2.3.2、復(fù)染：第二液染劑(碘化鉀溶液)染 1 分鐘，水洗。自然干燥后鏡檢。2.3.3、結(jié)果：菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色。2.3.4、注意事項(xiàng)：玻片要清潔，染料需新鮮配制，無(wú)沉淀物。注意與標(biāo)本中的其他雜質(zhì)相區(qū)別。3、壓片鏡檢，主要觀察細(xì)菌在組織中的分布。4、墨汁負(fù)染鏡檢：背景著色而菌體不著色的染色法，用以觀察新型隱球菌的寬厚莢膜等。5、鞭毛染色鏡檢，觀察細(xì)菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的數(shù)量，在非發(fā)酵菌的鑒定中是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。

16、6、暗視野鏡檢：觀察一些較微小且有一定結(jié)構(gòu)的微生物，如鉤端螺旋體的鉤狀及螺旋的形態(tài)等。7、制動(dòng)試驗(yàn)的直接鏡檢，在標(biāo)本加入抗血清，觀察動(dòng)力是否被抑制，如霍亂弧菌的制動(dòng)試驗(yàn)等。8、熒光鏡檢，用標(biāo)有熒光素的物質(zhì)與檢材中的微生物特異結(jié)合產(chǎn)生熒光的特點(diǎn)而對(duì)微生物作出鑒定。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 11 -文件編碼jyk-sop005文件名稱細(xì)菌室標(biāo)本操作流程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01細(xì)菌室標(biāo)本操作流程1、標(biāo)本的接受1.1、標(biāo)本接受的時(shí)間：原則上全天任何時(shí)間均可。1.2、標(biāo)本的接受：接受標(biāo)本者要認(rèn)真核對(duì)標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)本與檢驗(yàn)單要求是否相符以及標(biāo)本的質(zhì)量等。1.3、把接受的

17、標(biāo)本編號(hào)。2、臨床標(biāo)本的接種2.1、檢驗(yàn)?zāi)康臑榧?xì)菌培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)的各臨床標(biāo)本的培養(yǎng)基選擇2.1.1 標(biāo)本類型 培養(yǎng)基 血 血培養(yǎng)瓶 中段尿 血平板、麥康凱平板、巧克力平板 腦脊液 血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板 穿刺液 血培養(yǎng)瓶、血平板、麥康凱平板、巧克力平板 膽汁 血平板、巧克力平板、麥康凱平板 呼吸道標(biāo)本 血平板、麥康凱平板、巧克力平板 糞便標(biāo)本 ss 平板、mac 平板和血平板 病灶分泌物 血平板、巧克力平板、麥康凱平板2.1.2、生殖器標(biāo)本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗(yàn)項(xiàng)目接種相應(yīng)的平板及操作：淋球菌培養(yǎng)接種淋球 菌平板；念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基：支原體培養(yǎng)則按支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程操作；作普通

18、細(xì)菌培養(yǎng)，則接種血平板和巧克力平板；衣原體抗原檢測(cè)的按衣原體抗原檢 測(cè)的操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)。2.2、接種的方法：中段尿標(biāo)本無(wú)菌取 10ul，在血平板的中間做垂直劃線，然后分離劃線。其他際本做分區(qū)劃線。2.3、檢驗(yàn)?zāi)康臑檎铱顾釛U菌的按找抗酸桿菌的操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)。3、所接種的平板必須寫上標(biāo)本的編號(hào)和接種的日期，然后根據(jù)要求進(jìn)行培養(yǎng)。4、標(biāo)本的培養(yǎng)條件、溫度、時(shí)間內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 12 - 平板 培養(yǎng)條件、溫度、c02 濃度、時(shí)間 血平板 孵箱、3537、1824 小時(shí)巧克力平板 孵箱、3537、1824 小時(shí) 淋球菌平板 孵箱、3537、1824 小時(shí) 沙保羅平板 孵

19、箱、2831、2436 小時(shí) 其他的平板 孵箱、3537、1824 小時(shí)5、根據(jù)生長(zhǎng)在平板上的細(xì)菌菌落形態(tài)、菌落涂片、染色、鏡檢等來(lái)綜合判斷細(xì)菌形態(tài)和染色性質(zhì)，按各屬鑒定的作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行各菌屬的常規(guī)鑒定及藥敏試驗(yàn)。6、結(jié)果的報(bào)告6.1、確認(rèn)細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果后，進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)單結(jié)果報(bào)告的存盤、打印。7、對(duì)各類細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求進(jìn)行無(wú)害化處理。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 13 -文件編碼jyk-sop006文件名稱細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01細(xì)菌的形態(tài)檢查操作規(guī)程一、不染色標(biāo)本的檢查壓滴法和懸滴法。主要用于檢查生活

20、狀態(tài)下的細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況。將特制好的標(biāo)本置于顯微鏡載物臺(tái)中央，先以低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。結(jié)果：有鞭毛的細(xì)菌呈穿梭似流星狀運(yùn)動(dòng)(有明顯的方向性)：無(wú)鞭毛的細(xì)菌呈布朗運(yùn)動(dòng)(只在原地顫動(dòng)而無(wú)位置的改變)。二、細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查染色的第一步是制作涂片。菌液涂片時(shí)，用接種環(huán)沾取菌液點(diǎn)在載玻片上，標(biāo)本可直接在玻片上涂布。菌落涂片時(shí)，先取生理鹽水 l 滴，置玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中涂布。涂片時(shí)必須注意應(yīng)輕輕操作。猛烈的動(dòng)作會(huì)改變菌細(xì)胞原有的排列形式，或造成細(xì)菌鞭毛脫落，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。制備的涂片應(yīng)自然干燥，并經(jīng)火焰固定，固定溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準(zhǔn)，否則可能使細(xì)胞形態(tài)改

21、變。將固定后的涂片進(jìn)行染色。2.1、革蘭染色本染色是最基本的染色法，可用于標(biāo)本涂片或菌落涂片。染色結(jié)果將細(xì)菌分為革蘭陽(yáng)性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。2.1.1、試劑(1) 結(jié)晶紫溶液 a 液： 結(jié)晶紫 29 95乙醇 20ml b 液： 草酸銨 0.8g 蒸餾水 80ml需在用前 24h 將 a 液、b 液混合，過濾后裝入試劑瓶?jī)?nèi)備用。 (2) 碘液 碘 lg 碘化鉀 2g 蒸餾水 300ml內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 14 -碘與碘化鉀混合并研磨，加入幾毫升水，使其逐漸溶解，然后研磨，繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補(bǔ)足水量。也可用少量蒸餾水，先將碘化鉀完全溶解，再

22、加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。(3) 脫色液：95乙醇。(4) 復(fù)染液 a 貯存液：沙黃 2.5g 95%乙醇 100ml b 應(yīng)用液： a 液 10ml 蒸餾水 90ml染色方法： (1)涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫液染 1 min，清水沖去染液。 (2)加碘液染 i min，水洗。 (3)加脫色液，不時(shí)搖動(dòng)約 1030s，至無(wú)紫色脫落為止，水洗。 (4)加復(fù)染液，染30s，水洗。 (5)干后鏡檢。2.2、抗酸染色抗酸染色直接用于痰標(biāo)本時(shí)，可以適當(dāng)增加標(biāo)本涂片的厚度，以提高檢出率。染厚涂片時(shí)，須掌握復(fù)染色時(shí)間。如果背景過深，影響鏡檢。奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性，取培養(yǎng)菌落涂片染色時(shí)，

23、呈現(xiàn)兩種現(xiàn)象，視野中有些菌細(xì)胞陽(yáng)性，另外一些則陰性；有時(shí)同一個(gè)菌體上，紅色的深淺亦有不同，觀察時(shí)應(yīng)予注意?？顾崛旧袃煞N常用方法：口堿性復(fù)紅法又稱萋納(ziehlneelsen)法。 口 熒光染料金胺 o 法(也稱金胺 o羅丹明 b 法)。2.2.1 堿性復(fù)紅染色法試 劑 (1)萋納石炭酸復(fù)紅溶液 堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液 10ml 5石炭酸溶液 90ml (2)、脫色劑 * 濃鹽酸 3ml 95%乙醇 97ml內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 15 - (3)、復(fù)染液(呂弗勒美藍(lán)液) 美藍(lán)乙醇飽和溶液 30ml 10氫氧化鉀 0.1m1 蒸餾水 100ml染色方法 (1)、涂片經(jīng)火

24、焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰。染 5 min(若染色奴卡菌需要加長(zhǎng)時(shí)間)，水洗。(2)、加脫色劑，不時(shí)搖動(dòng)玻片至無(wú)紅色脫落為止，水洗。(3)、加復(fù)染液，染 0.5l min，水洗。(4)、干后鏡檢。分枝桿菌呈紅色，背景為藍(lán)色。*：奴卡菌、放線菌標(biāo)本染色時(shí)，脫色劑改用 2硫酸水溶液。2.2.2、金胺 0 一羅丹明 b 染色法染劑1、羅丹明 b 液：羅丹明 b 0.1g 加蒸餾水 100ml：2、0.1金胺 o 液：金胺 0 0.1g 加蒸餾水 95ml，再加入純石炭酸 5ml，混勻：3、 3鹽酸酒精；4、稀釋美藍(lán)液：呂弗勒美藍(lán)液 10ml，加蒸餾水 90ml，混勻。

25、方法1、涂片固定后加第 1 液 3090s。2、棄去第 l 液后加第 2 液染 15min。3、用第 3 液脫色 l2min，水洗。4、滴加第 4 液染 30s，水洗，待干，熒光抗酸菌在暗背景中呈現(xiàn)金黃色熒光。2.3、鞭毛染色用于觀察菌體上有無(wú)鞭毛、鞭毛在菌體上的位置以及鞭毛的數(shù)量。在細(xì)菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。鞭毛染色可以直接從平板上挑選菌落，或從斜面上刮菌苔涂片即可，但必須注意動(dòng)作盡量輕，以免鞭毛從菌體上脫落。菌落應(yīng)是生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)較好的瓊脂平板(如血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂)上的過夜培養(yǎng)物。不可采用有抑制劑的選擇性培養(yǎng)基，如中國(guó)藍(lán)、麥康凱、ss 瓊脂等。觀察鞭毛時(shí)，應(yīng)耐心尋找整個(gè)涂片上的

26、菌細(xì)胞，因?yàn)椴⒉皇峭科厦總€(gè)細(xì)菌細(xì)胞上的鞭毛特性及數(shù)量都一樣，應(yīng)以鞭毛數(shù)量最多的菌細(xì)胞為準(zhǔn)。 鞭毛染色(改良 ryu 法)內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 16 - 試劑 a 液： 5石炭酸 10ml 鞣酸 2g 飽和硫酸鋁鉀液 10ml b 液： 結(jié)晶紫酒精飽和液 應(yīng)用液：a 液 10 份，b 液 l 份，混合，室溫存放。 染色方法(1)、玻片的處理：要求用新的載玻片。用前須在 95酒精中浸泡 24 小時(shí)以上。用時(shí)從酒精中取出，以干凈紗布擦干后使用。(2)、在玻片上滴蒸餾水兩滴。一張玻片上可同時(shí)制 2 個(gè)涂片。(3)、用接種環(huán)挑取血平板上菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在玻片上的蒸餾水滴的頂

27、部。一般只需點(diǎn)一下，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落。(4)、玻片置室溫自然干燥。(5)、滴加染液于玻片上，染色。(6)、約 1015min 后，用蒸餾水緩慢沖去染液。沖洗時(shí)應(yīng)避免使染液表面的金屬光澤液膜滯留在玻片上，影響鏡檢。(7)、玻片自然干燥后，鏡檢時(shí)應(yīng)從涂片的邊緣開始，逐漸移向中心。尋找細(xì)菌較少的視野，鞭毛容易觀察。細(xì)菌密集的地方，鞭毛被菌體擋住，不易觀察。2.4、異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色，異染顆?？擅黠@地被顯示出來(lái)。標(biāo)本直接涂片或細(xì)菌涂片均可用改良阿伯特(a1bert)法染色來(lái)觀察異染顆粒。試 劑甲液： 甲苯胺藍(lán) 0.15g 孔雀綠 0.2g 冰醋酸 lml

28、95乙醇 2ml 蒸餾水 100ml將各染料先溶于乙醇，然后加入水與冰醋酸的混合液中，充分混勻。靜置 24h 后過濾備用。乙液： 碘 2g碘化鉀 3g內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 17 - 蒸餾水 300ml先將碘化鉀加少許蒸餾水(約 2m1)，充分振搖，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后， 加蒸餾水至 300ral。染色方法(1)、涂片經(jīng)火焰固定，加甲液，染 35 min。水洗。(2)、滴加乙液，染 l min。水洗。(3)、干后鏡檢，菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色。2.5、墨汁莢膜染色用于觀察菌體有無(wú)莢膜結(jié)構(gòu)，借此鑒定某些菌，如新型隱球菌。傳統(tǒng)的方法是用印度墨汁，但目前國(guó)內(nèi)

29、無(wú)售。常規(guī)工作可以用墨汁或墨水代替，但應(yīng)注意顆粒不能太粗，否則影響觀察結(jié)果。有人用 5黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果較好。試 劑印度墨汁或 5黑色素水溶液。染色方法將標(biāo)本與 1 滴染色液在載玻片上混合，加上蓋玻片，輕輕壓一下，使標(biāo)本混合液變薄。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細(xì)胞。找到后，轉(zhuǎn)換高倍鏡確認(rèn)。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 18 -文件編碼jyk-sop007文件名稱細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定及其它試驗(yàn)操作規(guī)程1、氧化一發(fā)酵試驗(yàn)(of 試驗(yàn))原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧

30、化型。可以進(jìn)行無(wú)氧降解的，稱為發(fā)酵型(發(fā)酵型細(xì)菌在有氧無(wú)氧的條件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。方法：將待檢細(xì)菌同時(shí)穿刺接種兩支 hl 培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無(wú)菌石蠟(或其它礦物油)，高度不少于 lcm。35，48 小時(shí)或更長(zhǎng)。結(jié)果：兩支培養(yǎng)基均無(wú)變化為產(chǎn)堿型或不分解糖型；兩支培養(yǎng)基均均產(chǎn)酸為發(fā)酵型。若僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸為氧化型。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵細(xì)菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者均為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌問的鑒別。2、半乳糖苷酶(onpg)試驗(yàn)原理：細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶分解鄰-硝基酚 d半乳糖苷(無(wú)色)鄰硝基酚(黃色)結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)

31、黃色為陽(yáng)性反應(yīng)，一般在 20-30 分鐘內(nèi)顯色。應(yīng)用：主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。3、七葉苷分解試驗(yàn)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色的化合物。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于 d 群鏈球菌與其它鏈球菌的鑒別。前者為陽(yáng)性，后者為陰性。也可用于革蘭陰性菌與厭氧菌的鑒別。4甲基紅試驗(yàn)原理：糖代謝分解葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸等，加入甲基紅。 紅色結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，橘紅色為弱陽(yáng)性。黃色為陰性。應(yīng)用：主要用于鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌，前者陽(yáng)性，后者陰性。此外腸桿菌科中變形桿菌屬、沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬和志賀

32、菌屬等陽(yáng)性，而腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬則為陰性。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 19 -5、vp 試驗(yàn)原理：分解葡萄糖丙酮酸，脫羧乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中，氧化二乙酰，與精氨酸中的胍基紅色化合物。結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，如無(wú)紅色出現(xiàn)且于 35c4h 后仍如故者即為陰性。應(yīng)用：本試驗(yàn)與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧?yáng)性的細(xì)菌，后者通常為陰性。6、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸吲哚(靛基質(zhì))吲，加入對(duì)位二甲基苯甲醛紅色玫瑰吲哚。結(jié)果：于兩者液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定。6、尿素分解試驗(yàn)原理：尿素酶(尿酶)，分解尿素產(chǎn)生大

33、量的氨，培養(yǎng)基變堿。結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽(yáng)性，不變色為陰性。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定，奇異變形桿菌、普通變形桿菌為陽(yáng)性，克雷伯菌屬、枸椽酸菌屬、雷氏普羅威登菌和摩根摩根菌為陽(yáng)性。7、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理：苯丙氨酸脫氨酶使脫去氨基苯丙酮酸，加入 fecl3綠色.結(jié)果：出現(xiàn)綠色為陽(yáng)性，應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長(zhǎng)會(huì)引起退色。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科的鑒定，變形桿菌屬、普羅威登斯菌和摩根摩根菌均為陽(yáng)性。腸桿菌科其它菌均為陰性。8、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)原理：氨基酸脫羧一胺，co2培養(yǎng)基變堿，黃色紫色。結(jié)果：對(duì)照管應(yīng)呈黃色，測(cè)定管呈紫色(指示劑為溴甲酚紫)為陽(yáng)性。應(yīng)用：主要用于

34、腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。9、氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。首先使細(xì)胞色素 c 氧化一氧化對(duì)苯二氨氧化。粉紅色深紅色紫黑色結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸 10 秒內(nèi)呈紫色為陽(yáng)性。為保證結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)作陰、陽(yáng)性對(duì)照。應(yīng)用：主要用于腸桿菌科與假單胞菌的鑒別，前者為陰性。后者為陽(yáng)性。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 20 -10、過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。試劑：3過氧化氫溶液方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加 3過氧化氫數(shù)滴；或直接滴加 3過氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)基中，立即觀察結(jié)

35、果。結(jié)果：有大量氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡為陰性。應(yīng)用：革蘭陽(yáng)性球菌中，葡萄球菌和微球菌均陽(yáng)性。而鏈球菌均陰性。1l、硝酸鹽還原試驗(yàn)原理：包括兩個(gè)過程：一是在合成過程中，硝酸鹽還原為亞哨酸鹽和氨。再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)菌內(nèi)其它含氮化合物。二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的受氫體，能使硝酸鹽還原的細(xì)菌從哨酸鹽中獲得氧而形成亞硝酸鹽和其它還原性產(chǎn)物。結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。若加入試劑后無(wú)顏色變化反應(yīng)，可能是硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性。硝酸鹽被還原為氨和氮等其它產(chǎn)物而導(dǎo)致假陰性，這時(shí)應(yīng)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明為試驗(yàn)為假陰性。應(yīng)用：本

36、試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中應(yīng)用廣泛。12、凝固酶試驗(yàn)原理：致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，可用玻片法測(cè)出。另一種是分泌至菌體外的游離凝固酶，可用試管法測(cè)出。方法：玻片法：取人血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的玻片上，挑取被檢菌分別與血漿和鹽水混合。試管法：取 2 支試管，各加 05m1 人血漿，挑取被檢菌和陽(yáng)性對(duì)照菌分別加入人血漿中混勻。于 37水浴 3-4 小時(shí)。結(jié)果：玻片法以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性；試管法以血漿凝固為陽(yáng)性。應(yīng)用：作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時(shí)常用的一個(gè)試驗(yàn)。13、camp 試驗(yàn)原理：b 群鏈球菌能產(chǎn)生 c

37、amp 因子，可促進(jìn)葡萄球菌的 -溶血素溶解紅細(xì)胞活性，因此在兩菌的交界處溶血力增加。出現(xiàn)矢形(半月形)的溶血區(qū)。結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血區(qū)為陽(yáng)性內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 21 -應(yīng)用：在鏈球菌中，只有 b 群鏈球菌 camp 試驗(yàn)陽(yáng)性。14、o/129 抑菌試驗(yàn)原理：o/129(二氨基喋啶)對(duì)弧菌屬、鄰單胞菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對(duì)氣單胞菌無(wú)抑制作用。方法：將待檢菌均勻涂布于堿性瓊脂平板上，鑷取 o/129 紙片(含藥 40ug)貼于平板上，35，18-24h，觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無(wú)抑菌環(huán)為耐藥應(yīng)用：弧菌屬、鄰單胞菌屬對(duì) o129 敏感，而氣單胞

38、菌屬耐藥15、桿菌肽試驗(yàn)原理：a 群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全部敏感，而其它鏈球菌絕大多數(shù)對(duì)其耐藥。16、奧普托欣試驗(yàn)原理：幾乎所有的肺炎鏈球菌對(duì) optochin 敏感，而 optochin 對(duì)其它鏈球菌則無(wú)抑制作用17、 h2s 試驗(yàn)原理：有些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇到鉛或亞鐵離子，則生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮?。?yīng)用：主要用于腸桿菌科屬或種的鑒定。18、觸酶試驗(yàn)(過氧化氫酶試驗(yàn))試劑：3 oah202 溶液，置棕色瓶?jī)?nèi)于 4陰暗處保存。方法：先挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的玻片上，然后滴加 3過氧化氫溶液12

39、滴。靜置之，lmin 內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡的為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子試驗(yàn)葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗(yàn)稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測(cè)凝聚因子。1凝聚因子試驗(yàn)：取 1 滴蒸餾水于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中，制成濃的菌懸液，無(wú)自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合，10s 內(nèi)觀察結(jié)果，出現(xiàn)明顯細(xì)菌凝塊為陽(yáng)性，否則為陰性。如超過 10s 可出現(xiàn)假陽(yáng)性，有 10一 15金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。操作過程中的注意點(diǎn)： (1)10s 內(nèi)觀察結(jié)果。 (2)必須制備濃厚的均勻菌懸

40、液。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 22 - (3)用 edta 抗凝的兔血漿為最好。 (4)加血漿后不要再混攪，以免細(xì)菌凝塊分散變小。 (5)生長(zhǎng)在高鹽培養(yǎng)基上的菌落可出現(xiàn)自凝或假陽(yáng)性。2葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)：用生理鹽水將血漿 4 倍稀釋，取 05ml。然后挑取 35 個(gè)菌落于稀釋血漿中，成濃菌懸液。置 37水浴，34h 后讀取結(jié)果，凝固者為陽(yáng)性。若陰性，繼續(xù)觀察到 24h，不凝固者為陰性。試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長(zhǎng)時(shí)間孵育，才可出現(xiàn)

41、陽(yáng)性。凝固酶試驗(yàn)應(yīng)考慮下述情況：某些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。所用血漿缺乏纖維蛋白原。試驗(yàn)菌株不純。20、新生霉素耐藥試驗(yàn)方法：挑取待檢菌菌落數(shù)個(gè)，制成相當(dāng) 0.5 號(hào)麥?zhǔn)瞎?mcfarland)濃度菌液，棉拭子浸透，擠去多余液，均勻涂在 mh 平板上，貼上含 5ug片的新生霉素紙片，35孵育1620h，抑菌環(huán)直徑16 為陽(yáng)性(耐藥)。試驗(yàn)時(shí)應(yīng)以金黃色葡萄球菌 atcc25923 做陰性(敏感)對(duì)照，以確認(rèn)紙片是否有效。21、氧化酶(改良法)試驗(yàn)試劑：四甲基對(duì)苯二胺(tmpd) (tetramethylphenylenediamine) 6.0g 二甲基亞砜(dmso)

42、 (dimethy sulfoxide) 100.oml溶解 tmpd 于 dmso 中，置于避光玻塞瓶中，可在室溫中保留幾個(gè)星期。方法：被檢菌株移種于 7羊血瓊脂上，30需氧條件下孵育 1518h，刮取菌落涂布于無(wú)色濾紙片上，加 l 滴上述試劑，陽(yáng)性者在 2min 內(nèi)呈深藍(lán)色。若被測(cè)菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上，至少孵育 3 天以上，才可檢測(cè)，陽(yáng)性反應(yīng)510min 出現(xiàn)。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 23 -文件編碼jyk-sop008文件名稱細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01細(xì)菌的接種與培養(yǎng)方法操作規(guī)程一、細(xì)菌的接種根據(jù)待檢標(biāo)本的來(lái)源、

43、培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的性狀，采用不同的接種方法。l、平板畫線分離法（1） 、連續(xù)畫線分離法此法主要用于雜菌不多的標(biāo)本。用接種環(huán)取標(biāo)本少許，于平板 l/5處密集涂布，然后回來(lái)作曲線連續(xù)劃線接種，線與線間有一定距離，劃滿平板為止。（2） 、分區(qū)畫線分離法此法適用于雜菌較多的標(biāo)本。先將標(biāo)本均勻涂布于平板邊緣一小區(qū) (約占平板 1/5)，再在二、三區(qū)依次連續(xù)畫線，每畫線一區(qū)均將接種針滅菌一次。每一區(qū)的劃線均接觸上一區(qū)的接種線 12 次。以獲得單個(gè)菌落。2、斜面接種法該法主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)。用滅菌接種環(huán)取菌少許，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線畫線。一直畫到斜面頂端。3、液體

44、接種法多用于一些液體生化試驗(yàn)管的接種。用滅菌接種環(huán)取菌少許，在試管內(nèi)壁與液面交接處的管壁上輕輕研磨，使細(xì)菌混合于液體中。4、穿刺接種法主要用于半固體培養(yǎng)基、明膠及雙糖鐵的接種。用接種針取菌少許，從半固體培養(yǎng)基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接觸管底，然后接種針原路退出。5、傾注平板法臨床上主要用于尿液等標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)。將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已經(jīng)溶化并冷卻至 45左右的定量培養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。6、涂布接種法常用于紙片藥物敏感性測(cè)定，也可用于被檢標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)。加定量的被檢菌液于瓊脂平板表面，然后用滅菌的 l 型玻璃棒反復(fù)涂布幾次，使被檢菌均勻分

45、布在瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片培養(yǎng)，或直接培養(yǎng)觀察結(jié)果。二、細(xì)菌培養(yǎng)方法內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 24 -根據(jù)臨床初步診斷及待檢細(xì)菌的種類，可選用不同的環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。常用的有需氧培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。1、需氧培養(yǎng)法本法是臨床細(xì)菌室常用的培養(yǎng)方法，即將已經(jīng)接種好的平板、斜面和液體培養(yǎng)基等。置于 35溫箱中孵育 1824 小時(shí)。2、二氧化碳培養(yǎng)法本室用 co2 孵箱將已接種好的培養(yǎng)基置于 co2 孵箱內(nèi)培養(yǎng)。3、厭氧培養(yǎng)(暫時(shí)未開展)三、分離及純化法3.1、分離是指從原材料或多種細(xì)菌的混合培養(yǎng)物中將各種細(xì)菌彼此獨(dú)立地分離開，以得到純的單一菌株，技術(shù)步驟如下：

46、作純培養(yǎng)分離時(shí)，一般只用一只完整的瓊脂平板。涂劃多采用分區(qū)劃線法，在一只平板中可劃 35 個(gè)區(qū)。劃法有兩種：3.2、從臨床標(biāo)本分離細(xì)菌所含菌數(shù)相對(duì)較少時(shí)，可用接種環(huán)取標(biāo)本涂布在平板一角邊緣，然后從此區(qū)開始劃線至 13 平板，為第一區(qū)，再在 2、3 區(qū)依次劃線，每劃完一個(gè)區(qū)域均將接種環(huán)滅菌一次，冷卻后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 12 次，使菌量逐漸減少以獲得單個(gè)菌落。3.3、快速劃線分離法：采用快速劃線使一接種環(huán)標(biāo)本能分離出單個(gè)菌落，這與標(biāo)本的菌量及操作者的技能有很大關(guān)系。3.4、純化是指欲獲得大量純培養(yǎng)物的方法，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量而定。方法是將一單個(gè)菌落或?qū)⑾?/p>

47、同的菌落作大量密集涂劃于平板上而獲得大量純的培養(yǎng)物。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 25 -文件編碼jyk-sop009文件名稱支原體培養(yǎng)、鑒定、計(jì)數(shù)及藥敏操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01支原體培養(yǎng)、鑒定操作規(guī)程1原理及依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)：支原體分離鑒定培養(yǎng)基用于泌尿生殖道支原體(解脲支原體 uu 和人型支原體肺)的檢測(cè)與診斷。當(dāng)有 uu 和 mh 生長(zhǎng)，分解尿素和精氨酸引起 ph 上升，使以酚紅為指示劑的培養(yǎng)基由黃轉(zhuǎn)紅。依據(jù)珠海迪爾生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書。2標(biāo)本的采集：2.1、男性：用特別細(xì)的無(wú)菌棉拭子沾取無(wú)菌生理鹽水少許深入尿道口內(nèi) 225cm 處取分泌物，

48、前列腺液亦可用沾取無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌棉拭子盡量多的沾取。2.2、女性：用沾取少許無(wú)菌生理鹽水的棉拭子取宮頸內(nèi)口 12cm 處單層柱狀上皮細(xì)胞，取樣拭子不可碰陰道壁。2.3、支原體對(duì)干、熱抵抗力差，標(biāo)本采集后應(yīng)接種運(yùn)輸培養(yǎng)基送檢：將已采樣的拭子放置入運(yùn)輸培養(yǎng)基小瓶?jī)?nèi)，攪動(dòng)數(shù)次后將拭子于瓶壁上盡量旋轉(zhuǎn)擠壓其中的液體，取出拭子并蓋上瓶塞。支原體在此培養(yǎng)基中放置室溫可保存 8 小時(shí)。在 4條件下可保存 24 小時(shí)。中段尿標(biāo)本可直接送檢。2.4、整個(gè)采樣過程應(yīng)注意無(wú)菌操作。若送檢標(biāo)本不是接種運(yùn)輸培養(yǎng)基而直接用采樣棉拭子送檢則為不合格標(biāo)本。隨原驗(yàn)單一同退回重新采取標(biāo)本同時(shí)在檢驗(yàn)系統(tǒng)“標(biāo)本留言”欄注明以免收

49、其費(fèi)。3、標(biāo)本接種：(本實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意無(wú)菌操作，避免污染雜菌)3.1、取出培養(yǎng)基，放置接近室溫，并在瓶蓋上編號(hào)。3.2、將采集的標(biāo)本拭子插入培養(yǎng)瓶中，在靠近液面上方的瓶壁擠示壓旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，使拭子中標(biāo)本滲入到肉湯中：若為液體標(biāo)本，取 200 u 1 加入培養(yǎng)基中；若為中段尿，經(jīng) 2000轉(zhuǎn)分離心 10 分鐘取沉渣 100ul 加入培養(yǎng)基中。3.3、蓋上瓶蓋，置 3537孵箱，在 2448 小時(shí)分別觀察結(jié)果。4、結(jié)果判讀：4.1、培養(yǎng)基變紅，判斷陽(yáng)性，培養(yǎng)基黃色并清亮，判斷陰性。24 小時(shí)結(jié)果：內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 26 -5已檢標(biāo)本處理：密閉容器高壓滅菌后，按醫(yī)用垃圾處理

50、。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 27 -文件編碼jyk-sop010文件名稱血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01血液感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程1、標(biāo)本采集(1)、采集時(shí)間和次數(shù)血標(biāo)本一般應(yīng)在病人發(fā)熱初期或根據(jù)不同的發(fā)熱情況在未用抗生素前采集做細(xì)菌培養(yǎng)，提高陽(yáng)性率需連續(xù)三次采血進(jìn)行培養(yǎng)。(2)、采血部位及抽血量一般抽取肘靜脈血。采血量為成人 5-10ml，兒童為 35ml。(3)、結(jié)果觀察：培養(yǎng) 72 小時(shí)后若肉眼或自動(dòng)血液培養(yǎng)儀報(bào)告仍未細(xì)菌生長(zhǎng)，則盲目移種一次，仍未細(xì)菌生長(zhǎng)，向臨床發(fā)出一級(jí)初級(jí)報(bào)告：“血液經(jīng) 72 小時(shí)培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)”：為避免漏診，應(yīng)在

51、培養(yǎng) 5 天、7 天時(shí)再作盲目移種培養(yǎng)。疑為亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、真菌血癥等時(shí)，血培養(yǎng)至少連續(xù)培養(yǎng) 23 周，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)方可報(bào)告為陰性。2、檢驗(yàn)程序血液標(biāo)本（無(wú)菌采集）72 小時(shí)盲目移種（初級(jí)報(bào)告）傳統(tǒng)方法或自動(dòng)血液培養(yǎng)儀指示有細(xì)菌生長(zhǎng)涂片、染色、鏡檢 需氧培養(yǎng)及 co2培養(yǎng) 直接藥敏試驗(yàn) （血平板、巧克力瓊脂）觀察菌落涂片、染色、鏡檢 純培養(yǎng) 血清學(xué)鑒定 atb expression 報(bào)告內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件- 28 -3、血培養(yǎng)瓶中不同表現(xiàn)為不同細(xì)菌生長(zhǎng)：渾濁并有凝無(wú)塊 金黃色葡萄球菌均勻渾濁，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣 多為革蘭陰性菌微渾濁，有綠色變化 肺炎鏈球菌表面有菌膜

52、，培養(yǎng)基清晰，底層容血 枯草桿菌表面有菌膜，膜下有綠色渾濁 銅綠假單胞菌血細(xì)胞層上面有顆粒狀生長(zhǎng)，自上而下的溶血 溶血性鏈球菌 4、血液及骨髓標(biāo)本中常見病原菌 革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌 表皮葡萄球菌 變形桿菌 溶血性鏈球菌 產(chǎn)氣腸桿菌 糞腸球菌 肺炎克雷伯氏菌銅綠假單胞菌糞產(chǎn)鹼桿菌沙雷氏菌流感嗜血桿菌布魯氏菌5、報(bào)告結(jié)果5.1、在血液中檢出沙門氏菌，必須以血清凝集試驗(yàn)為依據(jù)報(bào)告血清型。5.2、血液正常情況下應(yīng)是無(wú)菌的，如培養(yǎng)出細(xì)菌即為致病菌，應(yīng)報(bào)細(xì)菌的種屬及藥敏試驗(yàn)結(jié)果。5.3、血培養(yǎng)陽(yáng)性均作為危急值報(bào)告。內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室

53、操作程序文件- 29 -文件編碼jyk-sop011文件名稱中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程l、標(biāo)本采集 以無(wú)菌方法采集腦脊液 25ml，盛于無(wú)菌瓶中送檢。2、直接檢查 腦脊液可直接涂片、革蘭染色或抗酸染色等，然后鏡檢。無(wú)色透明的腦脊液，應(yīng)作離心取沉淀物涂片、染色鏡檢。3、檢驗(yàn)步驟：3.1、一般細(xì)菌涂片檢查除結(jié)核性腦膜炎外，由其它細(xì)菌引起的化膿性腦膜炎，腦脊液明顯混濁，可直接涂片，革蘭染色鏡檢。無(wú)色透明的腦脊液，應(yīng)離心后涂片、染色、鏡檢，根據(jù)染色及形態(tài)特征可初步提示細(xì)菌的種類。結(jié)核分枝桿菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物(

54、3000rmin。30min)作抗酸染色。新型隱球菌涂片檢查：取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負(fù)染色。3.2、分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取混濁腦脊液或經(jīng)離心沉淀的沉淀物，分別接種于血平板、巧克力平板，巧克力平板應(yīng)置于 co2環(huán)境中 35培養(yǎng) 1824 小時(shí)。腦脊液也可直接注入血培養(yǎng)瓶。4、檢驗(yàn)程序腦脊液 直接涂片 分離培養(yǎng) （取離心沉淀）不染色標(biāo)本 染色標(biāo)本 血平板、巧克力 沙氏培養(yǎng)基 （5%co2環(huán)境） 血平板動(dòng)力試驗(yàn) 革蘭染色 抗色染色墨汁染色 一般細(xì)菌 新生隱球菌等 腦膜炎奈瑟菌 一般細(xì)菌 結(jié)核分枝桿菌 腦膜炎奈瑟菌 atb expression atb expression 鑒定藥敏試條 鑒定藥敏試

55、條 初步報(bào)告 報(bào) 告內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件305、腦脊液培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟菌 a、b 群鏈球菌 卡他布蘭漢菌 肺炎鏈球菌 流感嗜血桿菌 結(jié)核分支桿菌 腸桿菌科菌種 產(chǎn)單核李斯特菌 腦膜敗血性黃桿菌 新型隱球菌 假單胞菌 白色念珠菌內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件31文件編碼jyk-sop012文件名稱創(chuàng)傷和外科感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01創(chuàng)傷和外科感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程三、創(chuàng)作和外科感染1、標(biāo)本采集(1)、開放性感染分泌物或膿液先用無(wú)菌生理鹽水沖洗表面，用 2 支無(wú)菌棉拭子取創(chuàng)傷或

56、潰瘍深處及分泌物送檢，一支為涂片用，一支為培養(yǎng)用。(2)、封閉性膿腫常局部消毒后，用注射器抽取膿液置于無(wú)菌試管內(nèi)送檢。(3)、對(duì)放線菌標(biāo)本，常用無(wú)菌棉拭子擠壓瘺管，選取流出膿液中的“硫磺樣顆?！敝糜跓o(wú)菌瓶?jī)?nèi)送檢。胸腔、腹腔、心包腔和滑膜腔等標(biāo)本采集，應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序，由臨床醫(yī)生進(jìn)行。檢驗(yàn)程序膿汁、分泌物、壞死組織等 直接涂片 分離培養(yǎng) 革蘭染色 通平板、mac 抗酸染色 巧克力平板（5%co2） 鏡檢 觀察、挑取菌落 涂片染色鏡檢、氧化酶或觸酶等 初步報(bào)告 atb expression 鑒定、藥敏試條 血清學(xué)試驗(yàn) 報(bào)告膿汁及病灶分泌物培養(yǎng)常見病原茵膿汁及病灶分泌物培養(yǎng)常見病原茵 革蘭陽(yáng)性菌

57、 革蘭陰性菌 葡萄球菌 腸桿菌科細(xì)菌 鏈球菌 假單胞菌 炭疽芽孢桿菌 擬桿菌 破傷風(fēng)芽孢桿菌 腐敗謝瓦納拉菌 產(chǎn)氣莢膜梭菌 嗜血桿菌 結(jié)核分枝桿菌 產(chǎn)堿桿菌 放線菌、奴卡菌 弧菌屬細(xì)菌 念珠菌 氣單胞菌內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件32內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件33文件編碼jyk-sop013文件名稱下呼吸道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01下呼吸道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程1、標(biāo)本的采集有自然咳痰法、咽拭子采集法、支氣管鏡下采集法及分泌物標(biāo)本2、標(biāo)本的直接檢查(1)、將痰標(biāo)本涂片后待干，固定、染色，或直接濕片鏡檢，對(duì)病原學(xué)早期、初步診斷有

58、重要意義。并向臨床發(fā)出初級(jí)報(bào)告。(2)、一般認(rèn)為合格的痰標(biāo)本為：以白細(xì)胞25 個(gè)/低倍鏡視野，而上皮細(xì)胞10 個(gè)/低倍鏡視野。采集合格標(biāo)本對(duì)細(xì)菌的診斷尤為重要。3、分離培養(yǎng)與鑒定(1)、一般要求下呼吸道感染培養(yǎng)的細(xì)菌濃度應(yīng)107cfu/ml，可視為病原菌，104cfu/ml 可視為污染菌。若介于兩者之間 105-106cfuml 時(shí)，要連續(xù)分離培養(yǎng)兩次以上仍為 105106cfuml 時(shí)，亦認(rèn)為是病原菌。(2)、檢驗(yàn)程序痰及呼吸道分泌物標(biāo)本涂片、染色、鏡檢 分離培養(yǎng) 藥敏試驗(yàn) 血平板、巧克力瓊脂、mac初步報(bào)告（一級(jí)報(bào)告）菌落觀察涂片、染色、鏡檢 純培養(yǎng)細(xì)菌 珠海迪爾鑒定、藥敏試條 報(bào)告最終報(bào)

59、告(三級(jí)報(bào)告)內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件344、下呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟氏菌 化膿性鏈球菌 流感嗜血桿菌 肺炎鏈球菌 腸桿菌科細(xì)菌 結(jié)核分支桿菌 非發(fā)酵菌 白喉棒狀桿菌 嗜肺軍團(tuán)菌 假絲酵母菌內(nèi)江市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 細(xì)菌室操作程序文件35文件編碼jyk-sop014 消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行時(shí)間（第四版）2012.01.01消化道感染病原體檢驗(yàn)操作規(guī)程1、糞便標(biāo)本中常見病原菌 革蘭陽(yáng)性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 傷寒及其它沙門菌 結(jié)核分支桿菌 志賀菌屬 難辨梭菌 致病大腸埃希菌 白色念珠菌 (etec、epe

60、c、eiec、ehec) 弧菌屬菌種 氣單胞、鄰單胞菌種 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 彎曲菌2標(biāo)本采集2.1、自然排便采集法 自然排便后，挑取膿血、粘膜部分的糞便 23g，液體糞便取絮狀物置于大便培養(yǎng)管或增菌液中送檢。2.2、直腸肛管法用大便培養(yǎng)用的肛管直接插入肛門成人 45cm，幼兒 23cm，輕輕在直腸內(nèi)旋轉(zhuǎn)數(shù)次，目的是使直腸表面粘液能通過肛管孔進(jìn)入肛管內(nèi)。然后拔出放入大便培養(yǎng)管中送檢。3、檢驗(yàn)步驟3.1、涂片檢查糞便標(biāo)本因各種正常菌群含量甚多而一般不作直接涂片找致病菌，只有懷疑霍亂弧菌及菌群失調(diào)所致腹瀉時(shí)，才作直接涂片檢查。3.2、各項(xiàng)的涂片檢驗(yàn)均按染色方法進(jìn)行，但大便檢查霍亂弧菌有其處理程序：