蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)

1、第三章蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)蛋白質(zhì)的修飾和表達(dá)是蛋白質(zhì)工程的重要研究內(nèi)容和手段。將從蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑、蛋白質(zhì)改造的分子生物學(xué)途徑和重 組蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行講解。第一節(jié) 蛋白質(zhì)修飾的化學(xué)途徑蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾：凡通過活性基團(tuán)的引 入或去除，而使蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改 變的過程。有些情況下，化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變并不影響蛋 白質(zhì)的生物學(xué)活性，這些修飾稱頭/非必需 部分白切修儷。但多數(shù)情況下，蛋白庚結(jié)桁 的灰變將導(dǎo)致生物活性的改變。影響化學(xué)修飾的主要因素有兩方面： 1、蛋白質(zhì)功能基的活性反應(yīng)，包括基團(tuán)之 間的氫鍵和靜電作用等，基團(tuán)之間的的空 間阻力。2、修飾劑的反應(yīng)活性。一、蛋白質(zhì)側(cè)鏈的化學(xué)修飾在20種天然氨基

2、酸的側(cè)鏈中，大約有一半可以在足夠溫和 的條件下產(chǎn)生化學(xué)取代而不使肽鍵受損，其中氨基、銃基 和竣基特別容易產(chǎn)生有用的取代。因為任何給定的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子中可能出現(xiàn)不止 一次，如果用化學(xué)的方法對氨基酸進(jìn)行修飾時，正常情況 下所有相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈都要被取代。至于談到氨基和竣基基團(tuán)，盡管處在側(cè)鏈上和末端基團(tuán)的pK值有差別，但在 化學(xué)上很難將肽鏈的-氨基或-竣基基團(tuán)與側(cè)鏈上的氨基或竣基相區(qū)別。蛋旦質(zhì)側(cè)鏈的化學(xué)修飾是通過選擇性試劑 或親和標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上特定 的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。（一）銃基的化學(xué)修飾由于銃基有很強(qiáng)的殺核性，銃基基團(tuán)一般 是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。烷基化

3、試劑是一種重要的銃基修飾試劑， 特別是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸測序前, 常用碘乙酸來使毓基基團(tuán)竣甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。其他一些鹵代酸、鹵代酰胺也可以修飾銃 基。 N-乙基馬來酰亞胺也是一種有效的銃基修 飾試劑，該反應(yīng)具有較強(qiáng)的專一性并伴隨 光吸收的變化。 5, 5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)是目前 最常用的銃基修飾試劑之一，可與疏基反 應(yīng)形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子上標(biāo)記1個2一 硝基-5-硫苯甲酸(TNB),同時釋放一個 有顏色的TNB陰離子，該離子在412nm有很 強(qiáng)的吸收，可以通過光吸收變化來檢測反 應(yīng)程屢。（二）氨基的化學(xué)修飾賴氨酸的 -氨基是蛋白質(zhì)分子中親核反應(yīng) 活性很高

4、的基團(tuán)，是蛋白質(zhì)或多肽分子比 較容易與修飾劑發(fā)生作用的位點(diǎn)。常見的修飾劑有三硝基苯磺酸、烷基化試 劑、氧酸鹽以及鹽酸毗哆醛等。（三）竣基的化學(xué)修飾谷氨酸、天冬氨酸修飾方法很有限，產(chǎn)物一般是脂類或酰胺 類。（四）二硫鍵的化學(xué)修飾 一般用變性劑如毓基乙醇，將二硫鍵還原 成游離的銃基，再通過毓基修飾的方法對 其進(jìn)行修飾，如經(jīng)過竣甲基化處理，以防 止重新氧化成二硫鍵。（五）其他側(cè)鏈基團(tuán)的修飾 1、組氨酸殘基的咪卩坐基可以通過氮原子的烷基化或碳原子的親核取代來進(jìn)行修飾。2、酪氨酸殘基的修飾既可以是酚甕基的修飾，也可以是芳香環(huán)上的取代反應(yīng)。 3、精氨酸殘基含一個月瓜基，精氨酸殘基的 強(qiáng)堿性，使其很難與大多

5、數(shù)試劑發(fā)生修飾 反應(yīng)，但可以和二撥基化合物發(fā)生反應(yīng)。 4、色氨酸口引味基可以發(fā)生取代反應(yīng)或者被 氧化裂解。N-漠代琥珀酰亞胺（NBS）可以 使口弭朵基團(tuán)氧化成輕口弭朵衍生物，但專一 性較差，酪氨酸殘基也可與該試劑發(fā)生反 應(yīng)。 5、蛋氨酸主要是由于硫i迷的硫原子的親核 性所引起的，一些氧化劑可以使蛋氨酸氧 化。二、蛋白質(zhì)的位點(diǎn)專一性修飾專一性包括兩方面的含義：一是試劑對被 修飾基團(tuán)的專一性；二是試劑對蛋白質(zhì)分 子中被修飾部位，如膜蛋白質(zhì)上的激素結(jié) 合部位、酶的活性部位等位點(diǎn)的專一性， 一般這類試劑不僅具有對被作用基團(tuán)的專 一性，而且具有對被作用部位的專一性。這類專一性的化學(xué)修飾，稱為親和標(biāo)記或

6、專一性的不可逆抑制作用。這類修飾試劑 也被稱為位點(diǎn)專一性抑制劑。（一）親和標(biāo)記親和標(biāo)記是一類位點(diǎn)專一性的化學(xué)修飾， 試劑可以專一性標(biāo)記于酶的活性部位上， 使酶不可逆的失活，因此又稱為專一性的 不可逆抑制作用。這類抑制劑可分為兩類： 一類是Ks型的不可逆抑制劑，它是根據(jù)底 物的結(jié)構(gòu)設(shè)計的，它具有和底物結(jié)構(gòu)相似 的結(jié)合集團(tuán)，同時還具有和活性部位氨基 酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)的活性基團(tuán)。另一類是Kcat型的不可逆抑制劑，是根據(jù)酶 催化過程設(shè)計的。這類抑制劑具有和底物 類似的結(jié)構(gòu)，具有被酶催化和結(jié)合的性質(zhì)。 此外還有一個潛伏反應(yīng)基團(tuán)，在酶對它進(jìn) 行催化反應(yīng)時，這個潛伏基團(tuán)被酶催化而 活化，對活性部位起不可

7、逆抑制作用。這 類抑制劑的專一性很咼，被稱為自殺性 底物”。（二）光親和標(biāo)記這類試劑在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的 特點(diǎn)卜，還具有一個晃皮應(yīng)塞囪。反應(yīng)一般分兩步進(jìn)行：第一步，試劑先與 蛋白質(zhì)的活性部位在暗條件下發(fā)生特異性 結(jié)合；第二步，光照，試劑被光激活后， 產(chǎn)生一個高度活潑的功能基團(tuán)，與活性部 位的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。三、蛋白質(zhì)的聚乙二醇修飾聚乙二醇(PEG)由環(huán)氧乙烷聚合而成， 兩端各有一個輕基，若一端以甲基封閉則 得到單甲氧基聚乙二醇(mPEG) o蛋右質(zhì) 修飾中應(yīng)用最多的是mPEG的衍生物。 PEG與蛋白質(zhì)的非必需基團(tuán)共價結(jié)合時， 可作為一種屏障擋住蛋白質(zhì)分子表面的抗 原決定簇，避免抗體產(chǎn)

8、生，或者阻止抗原 與抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生。還可以保護(hù)蛋白質(zhì)不易被蛋白酶水解。 修飾后，分子量增加，腎小球濾過減少。這些均有助于蛋白質(zhì)類藥物循環(huán)半衰期的 延長。修飾時，先對PEG進(jìn)行活化，活化的PEG 可與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上的各種化學(xué)基團(tuán)反 應(yīng)而與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，蛋白質(zhì)分子上與 PEG進(jìn)行偶聯(lián)的基團(tuán)主要是氨基、銃基和 竣基。四、蛋白質(zhì)的化學(xué)交聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián)化學(xué)交聯(lián)可以發(fā)生于分子內(nèi)的亞基與亞基 之間，龜址以發(fā)生勾蛋自質(zhì)分子與分子之 間，也可以發(fā)生于蛋白質(zhì)分子與分子之間, 也可發(fā)生于多個分子之間，而形成網(wǎng)狀交 聯(lián)。交聯(lián)劑為含有雙功能基團(tuán)的化學(xué)試劑。 如戊二醛蛋白質(zhì)的化學(xué)偶聯(lián)是指將蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)

9、到一個化學(xué)惰性的水不溶性載體上，形成 固定化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的固定化蛋白質(zhì)分子的固定主要是酶分子的固定。酶的固定化，使用固體材料將酶束縛或限制于一 定區(qū)域內(nèi)，酶仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可 回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：1、既能保持酶的活性又能克服游離酶的一 些不足，提高酶分子的穩(wěn)定性。 2、能與產(chǎn)物分開，有效地控制生產(chǎn)過程 3、能與產(chǎn)物分開，可省去熱處理使酶失活的步驟, 簡化生產(chǎn)工藝 4、酶可在生產(chǎn)中重復(fù)利用，提高了酶的利用率。酶的固定化可通過吸附法、交聯(lián)法、包埋 法、共價結(jié)合法去實(shí)現(xiàn)。 1、交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、 強(qiáng)分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn) 行交聯(lián)反應(yīng)，

10、把酶分子彼此交叉連接起來, 形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的固定化酶。常用的交聯(lián)劑是戊二醛和雙重氮聯(lián)苯胺_2, 2-二磺酸。交聯(lián)法有四種形式：1）酶直接交聯(lián)法：在酶液中加入適量多功能試劑，、使其形成不 溶桎衍生物。2）酶諭助蛋白交耳壬法：酶量有限時，使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。3） 吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子谿:而其中 2、共價結(jié)合法是酶蛋白分子上功能團(tuán)和固定支持物表面 上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價鍵連接， 以固定酶的方法。常用載體為：天然高分子（纖維素、瓊脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龍、多聚 氨基酸），無機(jī)支持物（多孔玻璃）影響因素：1）要求載體親水，并且有一

11、定 的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，同時具備在溫和條 件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán) 2）反應(yīng)必須在溫和pH、中度離子強(qiáng)度和低 溫緩沖液中進(jìn)行3）所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要盡量考慮到對酶的 其他功能基團(tuán)副反應(yīng)盡可能少 4）要考慮到酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少 載體的空間位阻對酶活力的影響。第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)改造主要有基因突變、基因融合和摻入非天然氨基酸輕方法。一、基因突變技術(shù)基因突變技術(shù)是通過在基因水平上對其編 碼的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，在其表達(dá)后用 來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種方法。根據(jù)改造策略的不同可以分為定點(diǎn)突變和 定向進(jìn)化兩種，前者屬于理性的設(shè)計方法, 后者屬于非理性的設(shè)計方法。（一）定點(diǎn)突

12、變對已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺 失或者插入。具有突變率高、簡單易行、重復(fù)性好的特 占O八、。野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）在紫外光 激發(fā)下能夠發(fā)岀微弱的綠色熒光，經(jīng)過對 其發(fā)尢結(jié)*勾域的#寺定氨塞酸定點(diǎn)改造，現(xiàn) 在的GFP能在可見光的波長范圍被激發(fā)，而 且發(fā)光強(qiáng)度比原來強(qiáng)上百倍，甚至還岀現(xiàn) 了綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白等。 1、重疊延伸PCR技術(shù)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物 形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中 通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片 段重疊拼接起來。為提高葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，用雙引 物法對葡萄糖異構(gòu)酶基因進(jìn)行了體外定點(diǎn) 突變，以卩心38替代Glyl3

13、8,突變性葡奮霧 異構(gòu)酶的熱半衰期比野生型漲一倍，最是 反應(yīng)溫度提高10 -12度。首先準(zhǔn)備質(zhì)粒：必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑 盒（Miniprep）或者氯化艷純化抽提的質(zhì)粒。債點(diǎn)的引物正、反 PfuTurbo聚合酶循，（所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版 2、快速定點(diǎn)突變恣后，於IP向）,耒環(huán)延伸” IK跡（申引物，二圈后回到引物5端幺乂止，再繹討后 退火后配對成為帶缺刻的異饑密反仲產(chǎn)初產(chǎn)鐵由可撕卩勺模版質(zhì)粒來（二）定向進(jìn)化在實(shí)驗室中模仿自然進(jìn)化的關(guān)鍵步驟一突變、重 組和篩選，在較短的時間內(nèi)完成漫長的自然進(jìn)化 過程，有效的改造蛋白質(zhì)，使之適于人類的需 要。，這種策略只針對特定蛋白質(zhì)的特

14、定性質(zhì)， 因而被稱為定向進(jìn)化。需要兩項支撐技術(shù)，一是產(chǎn)生大量突變體為進(jìn)一 步篩選提供豐富的素材；二是有合適的篩選系統(tǒng), 可迅速從突變題庫中篩選到符合目標(biāo)的蛋白質(zhì)。1、制造突變體 (1)易錯PCR基本原理是通過改變正常PCR反應(yīng)體系中某 些組分的數(shù)量或質(zhì)量，隨機(jī)引入錯誤堿基 從而創(chuàng)造序列多樣性的DNA序列文庫。關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)耐蛔冾l率。一般目標(biāo) 基因內(nèi)有1.5-5個堿基發(fā)生堿基替換時，誘變 結(jié)果最理想。由于一輪易錯PCR往往很難獲得滿意的結(jié)果, 因此常用連續(xù)易錯PCR方法。DNA shuffling allows accelerated evolution ofgenes1( DNA shuf

15、flingreanneal pieces3 2 copies of a DNA5 moleculeamplify DNArandom mutation2、篩選 (1)表型觀察選擇和篩選菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的瓊脂平 板上產(chǎn)生清晰的水解圈。在高溫并有藍(lán)色木聚糖底物存在的條件下, 根據(jù)菌落周圍地物的顏色變化來篩選耐高 溫的木聚糖酶。 (2)高通量篩選方法噬菌體展示技術(shù)、細(xì)菌展示技術(shù)、酵母菌展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)等。噬菌體展示技術(shù)是一種將外源肽或蛋白質(zhì)與特定噬菌體衣 殼蛋自麻合菲農(nóng)示于噬菌體衰面的技采。Phage display method (1)glllp display

16、gene 111 proteingene VIII proteing VI lip displayFigure 17.7 Proteins displayed on filamentous phage. In phage display； proteiiw arc usually fused to the major coat protein gVIIIp (2700 copies per phage), or to the infectivity protein, glllp (5 copies per phage). During assembly of the virus in bact

17、criaf capsid fusion proteins are incorporated into the virus and are displayed on the surface of the phage. When gVIIIp fusions are produced, there can be many copies of protein per phage particle, leading to multivalent display* By contrast, glllp fusions typically give only one copy per phage (mon

18、ovalent display).M13 (a filamentous phage containing ss-DNA encased in a protein coat): contains five coat proteins, two of which are gVIIIp (gene VIII protein) and glllp (gene III protein)Phage display method (#)Phage display method (#)P伽e DNApackage DNA library into phage partidesPhage display met

19、hod (2): (contd.核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)在體外無 細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行，用mRNA的可復(fù)制性, 使靶基因得到有效富集，不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效 率的限制。大大提高了篩選通量?；蛉诤虾突蚣艚踊驹瓌t：將第一個蛋白基因的終止密碼 子刪除，再接上帶有終止密碼子的第二個 蛋白質(zhì)或多肽基因，即可實(shí)現(xiàn)兩個基因的 融合表達(dá)。1.利用基因融合技術(shù)表達(dá)外源基因的緣由（1）通過與一特異性蛋白質(zhì)或其特意的結(jié)構(gòu)域形成融合蛋 白，可使表達(dá)產(chǎn)物得到有效的回收、純化。（2）通過與具有不同功能的蛋白質(zhì)融合，產(chǎn)生新的多功能 蛋白。（3）與報告分子的融合蛋白結(jié)合，應(yīng)用于蛋白質(zhì)定位或轉(zhuǎn) 基因動物。（4.）避免被蛋白

20、水解酶水解（5）改變細(xì)胞溶解性，防止包涵體的形成（6）定向定位在宿主的不同區(qū)位。2.基因融合的策略（1）方式A酶切后，直接剪接到適當(dāng)?shù)男盘栯闹驜在目的基因兩端分別加上不同的親和標(biāo)簽，有利于 蛋白純化C將目標(biāo)基因插入信號肽序列和一插入序列之間， 成為一種可插入到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的蛋白編碼。 (2)融合蛋白接頭的設(shè)計和選擇多個不同模塊連接成一個大分子時，其中 起連接作用的氨基酸鏈即blinkero因素：長度在10 -15個氨基酸之間具有一定柔性避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)選擇非疏水性的氨基酸，常用序列為(GGGGS) 3o 3、融合蛋白標(biāo)簽?zāi)康模簽榱酥亟M蛋白質(zhì)的純化，目的蛋白 質(zhì)的監(jiān)測和定向固定，提高重組蛋白

21、質(zhì)的 產(chǎn)量，增加可溶性和穩(wěn)定性等。常用片段：多聚精氨酸、多聚組氨酸、 FLAG、c_myc等。這些蛋白不會與融合蛋白發(fā)生干擾。 4、融合蛋白報告分子目的：標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控應(yīng)用：啟動子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、 細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物的篩選特點(diǎn)：1、報告基因應(yīng)不存在于宿主中或易 于和內(nèi)源性基因相區(qū)別2、應(yīng)當(dāng)有一個簡單、 快速、靈敏及經(jīng)濟(jì)的分析方法來檢測報、告 分工3、報告分工0勺分卅結(jié)菓應(yīng)具肴彳艮寬的 線性范圍，以便于分析啟動子活性的幅度 變化4、報告基因的表達(dá)必須不改變受體細(xì) 胞或生物的生理活動。 5、蛋白質(zhì)剪接-內(nèi)含肽蹩魁驕旱黠谿靈豔陽的表達(dá)蛋白連接（內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白連接）: 通過改變裂

22、解條件以及對內(nèi)含肽進(jìn)行適當(dāng) 修佛，可以生暢合成C端帶有硫備旨讎或N末端帶有半胱氨酸的蛋白質(zhì)分子。兩種蛋白 質(zhì)混合以后，硫酯鍵和半胱氨酸利用自然 化學(xué)連接的原理進(jìn)行自發(fā)的連接反應(yīng)，在硫酯鍵和半胱氨酸之間形成肽鍵，從而將兩種蛋白質(zhì)連接起來。 6、tRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)工程在蛋白質(zhì)工程中，借助于校正tRNA定點(diǎn)摻 入非天然氨基酸可以提供蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信 息、改進(jìn)蛋白質(zhì)檢測與分離的方法，甚至 賦予蛋白質(zhì)某些新的特征。增添一個非天然氨基酸到遺傳密碼中需要 創(chuàng)建一套新的組分，包括tRNA、密碼子和 氨酰tRNA合成酶。迄今為止超過20個非天然氨基酸被摻入到遺 傳密碼中。例如，含有酮基的對乙酰苯丙氨酸。含有這個

23、氨基酸的蛋白質(zhì)能夠選擇性的被熒光標(biāo)記用以跟蹤和成像，或是被生物素標(biāo)記用作靈敏度檢岀。許多試劑都可以通過酮基這個化學(xué)手柄選擇的結(jié)合到目標(biāo)蛋 白上?；蛉诤系挠猛旧鲜鲞@些基因融合策略，主要是有利于外源 基因的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化以及細(xì)胞定 位。作為蛋白質(zhì)分子改造可以借用這些策略對蛋 白質(zhì)分子中的特定序列、結(jié)構(gòu)元件乃至結(jié)構(gòu)域通 過基因剪接來進(jìn)行操作。第三節(jié)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)重組蛋白質(zhì)在哺乳類動物細(xì)胞中的表達(dá)、大腸桿菌中表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)大腸桿菌（E.c必）表達(dá)體系是目前應(yīng)用最廣的一個外源 基因表達(dá)體系，是外源基因表達(dá)的首選體系。利用大腸桿菌作為

24、表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：遺傳學(xué)和生理學(xué)背景清楚；容易培養(yǎng)，特別是高密度發(fā)酵；外源基因經(jīng)?？梢赃_(dá)到高效表達(dá)。產(chǎn)物。大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn)大腸桿菌系統(tǒng)最大的不足之處是不能進(jìn)行典型真核細(xì)胞所 具有的復(fù)雜的翻譯后修飾，如糖基化、烷基化、磷酸化、 特異性的蛋白水解加工等；而廣泛二硫鍵的形成以及外源 蛋白質(zhì)組裝成多亞基復(fù)合體的能力也受到限制。大腸桿菌體系的另一個不足之處是外源基因產(chǎn)物在大腸桿 菌細(xì)胞內(nèi)易形成不溶性的包涵體；而當(dāng)真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時，作為起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白質(zhì)的N末端。最后，由于真核mRNA的結(jié)構(gòu)特性以及密碼子使用頻率與大腸桿菌本身的差異，當(dāng)用真核mRNA的 序列直接在大腸桿菌

25、細(xì)胞中表達(dá)時，有時不能得到足夠的大腸桿菌表達(dá)體系的應(yīng)用當(dāng)外源蛋白質(zhì)的分子量小于70kD,不存在半胱氨酸或分子內(nèi)的二硫鍵少于34個,以及不需要翻譯后修飾而能保持其生物活性的蛋白質(zhì)，大多可以利用大腸桿菌系統(tǒng)得到滿意的結(jié)果。產(chǎn)物。1.表達(dá)載體的構(gòu)建(1)復(fù)制起始點(diǎn)大部分載體是基于pBR322或pUC質(zhì)粒 的復(fù)制起始點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)主要決定了 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。前者可保持每 個細(xì)胞中20-50個拷貝，后者為150-200 個質(zhì)粒。(2) 選擇性基因載體上至少含有一個選擇性基因，一方面用 于對轉(zhuǎn)化體的確定，另一方面在培養(yǎng)過程 中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。一般為抗生素抗性基因或報道基因。(3) 強(qiáng)的、可誘導(dǎo)的啟動子

26、主要作用是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的有效起始。原核細(xì) 胞的啟動子由-10區(qū)和-35區(qū)兩部分組成。-10 區(qū)是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)，一35區(qū)是 RNA聚合酶的識別位點(diǎn)。(4) 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列高效表達(dá)的載體應(yīng)該含有終止子，因為合成 的mRNA過長，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能 量，且易使mRNA形成妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。(5) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)原核微生物的mRNA結(jié)合核糖體的序列稱為 SD序列。SD序列對翻譯效率有影響。 (6)合適的多克隆位點(diǎn)于外源基因插入和篩選。便2與外源基因有效表達(dá)的相關(guān)因素（1）有效的轉(zhuǎn)錄起始一個合適的高表達(dá)外源基因的啟動子應(yīng)符合以 下幾點(diǎn)：第一，必須是較強(qiáng)的啟動子，表 達(dá)效率在10-30

27、%o第二，由啟動子控制的 本底轉(zhuǎn)錄很低。第三，啟動子能夠有一些 簡單及經(jīng)濟(jì)合算的方式誘導(dǎo)啟動。例如：T7啟動子(2)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達(dá)效率的影響轉(zhuǎn)錄終止有兩種機(jī)制，一種是依賴六聚體蛋白rho的 rho依賴性轉(zhuǎn)錄終止，rho蛋白能使新生RNA轉(zhuǎn)錄 本從模板脫離。另一種是rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止, 它特異性依賴與模板上編碼的信號。貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成啟動 子的封堵。 (3)mRNA穩(wěn)定性的影響 mRNA的快速降解勢必影響蛋白質(zhì)的合成。通常用非常強(qiáng)的啟動子來彌補(bǔ)不穩(wěn)定的 mRNA的轉(zhuǎn)錄物。(4)密碼子偏好性遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用其 中一部分。那些被最頻繁

28、利用的稱為最佳密碼子, 不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。富含E.coli不常用密碼子的外源基因有可能在E.coli中 得不到有效表達(dá)。精氨酸t(yī)RNA是多種哺乳動物基 因在細(xì)菌中表達(dá)的限制因子。 5、表達(dá)定位外源蛋白可能定位于：胞內(nèi)、胞質(zhì)膜、胞 周質(zhì)、外膜和胞外培養(yǎng)基。 (1)表達(dá)的外源蛋白定位于胞外小分子蛋白較易表達(dá)，產(chǎn)物接近天然蛋白; 但義達(dá)大分子時，則易在胞丙形成包涵襪。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中被降解的可能性比其他 的定位要大得多。從細(xì)胞質(zhì)蛋白混合物中純化目的蛋白相對 比較困難。 (2)細(xì)胞外周質(zhì)表達(dá)有利于目的蛋白的純化；有利于蛋白質(zhì)的 正確折疊；信號肽在細(xì)胞內(nèi)剪切更有可能 產(chǎn)生目的蛋白

29、的天然N末端；蛋白質(zhì)降解也 少。許多原核和真核細(xì)胞來源地信號肽已成功 用于蛋白質(zhì)從內(nèi)膜到外周質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。女山 E.coli的PhoA信號、入生長激素言號臥等。（3）細(xì)胞外分泌易于純化，減少降解方法：a、利用已有的“真正”的分泌蛋白 所采用的途徑，b、利用信號肽序列、融合 伴侶和具有穿透能力的因子。（4）外源蛋白表達(dá)定位在胞質(zhì)膜上形成具生物活性的膜蛋白，大腸桿菌內(nèi)膜上 表達(dá)定位的G蛋白偶聯(lián)受體，已用于受體與 配基的結(jié)合、G蛋白與效應(yīng)物的偶聯(lián)、受體 自身的結(jié)構(gòu)等。 (5)表達(dá)外源蛋白定位于菌體表面定位方式：a、將外源肽插入大腸桿菌外膜 蛋白的膜外區(qū)，使一些短肽在細(xì)菌表面呈 現(xiàn)。B、將外源蛋白序列插入

30、菌體表面的結(jié) 構(gòu)，如鞭毛和菌毛的蛋白中。C、以菌體表 面脂蛋白或Lpp-OmpA融合體作為靶向載體 蛋白，將外源蛋白或肽序列與脂蛋白或Lpp- OmpA的N端或C端序列融合，表達(dá)定位扌 菌體表面。 6、宿主選擇對表達(dá)的影響宿主菌對外源基因的表達(dá)會產(chǎn)生一定的影 響。例如，菌株內(nèi)源h勺蛋白酶過多，可能 會造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些 蛋白酶喩陷型菌株往往成為理想白6起始表 達(dá)菌糕。Rosetta2索列擊攻補(bǔ)堯天腸桿菌缺 乏的七種稀有密碼子對應(yīng)的tRNA,提高了 外源基因白勺表達(dá)水平。Origami 2系列是硫氧 化還原蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶雙突 變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾 率，

31、促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。 7、培養(yǎng)條件的控制對表達(dá)效率的影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以通過高細(xì)胞密度培養(yǎng)系統(tǒng) 獲得提咼。高密度培養(yǎng)系統(tǒng)可以分為：分批培養(yǎng)、補(bǔ) 料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)參數(shù)會影響蛋白酶的 活彳*、分泌和產(chǎn)量。培養(yǎng)基的特殊操作能顯著提高蛋白質(zhì)釋放 到培養(yǎng)基審。如培聶基中添加甘氨酸能增 強(qiáng)外周質(zhì)蛋白釋放到培養(yǎng)基中。（三）真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控 需注意：1、基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的， 因此要用切除內(nèi)含子的cDNA。2、基因必 須置于原核細(xì)胞的啟動子、終止子和SD序 列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯 系統(tǒng)有效識別。3、產(chǎn)生的mRNA必須相對 穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)

32、折疊。二、目標(biāo)蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：1、既有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、易于 土咅養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)2、對外源蛋白的翻譯后修飾特點(diǎn)：1、具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。2、對表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，從而使其表達(dá)的蛋白具有 生物活彳生。3、表達(dá)量咼。4、表達(dá)的蛋白既可以存在于胞內(nèi)，也可以存在于胞外。酵母自身分泌的背景蛋白很少。5、整合有外源基因的重組子表達(dá)系統(tǒng)十分穩(wěn)定。6、糖基化程度低，使得他的蛋 白抗原性較低。7、對營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成分簡 單廉價，可進(jìn)行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于 工業(yè)化生產(chǎn)。（一）表達(dá)菌株常用菌株有GS115、I

33、CM71、PMAD11、PMAD16等，均為甲醇誘導(dǎo)型，以甲醇為唯 一碳源時，宿主菌中AOX1啟動子被強(qiáng)烈誘 導(dǎo)，是外源蛋白大量表達(dá)。蛋白酶缺陷株，女HSMD1168,可以減少分 泌蛋白的酶解消化，為外源蛋白的成功表 達(dá)創(chuàng)造了條件。（二）表達(dá)載體 一般用整合型載體作為外源基因的表達(dá)載 體。特點(diǎn)：載體與酵母宿主細(xì)胞基因組DNA整合，因此穩(wěn)定性高，但基因的拷貝數(shù)量低這種載體被設(shè)計為穿梭載體，即它可以在 大腸桿菌中保存、擴(kuò)增和構(gòu)建，線性化后 又可轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。 1、啟動子 AOX1啟動子，僅受甲醇誘導(dǎo)，可產(chǎn)生較高 水平的表達(dá)，但不適于食品生產(chǎn)，又有火 災(zāi)隱患。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)不以甲醇為唯一誘導(dǎo)物的啟動子:

34、GAP、FLD1、DAS、AOX2等。GAP （3-磷酸甘油醛脫氫酶基因）的啟動子可以利用多種碳源如葡萄糖、甘油等。 2、選擇標(biāo)記 一般有兩種：營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記，如His4、Arg4等 抗性選擇標(biāo)記，G418抗性基因 3、信號肽序列可以選擇外源蛋白自身的信號肽和酵母本 身的信號麻。 4、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及與畢赤酵母的整合載體首先以質(zhì)粒的形式轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在 其內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)酶切和測序證明表達(dá)載 體構(gòu)建正確后，經(jīng)DNA內(nèi)切酶線性化后，轉(zhuǎn)入巴斯得畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。整合方式：a、單交換，外源基因通過重組 插入到畢赤酵母染組his4位點(diǎn)或 AOX1基因的上游和下游，b、雙交換，酵 母染色體AOX1基

35、因被載體外源基因表達(dá)元 件和標(biāo)記基因所代替，該方法對甲醇的利 用率低，但它表達(dá)外源基因的效率高。（三）外源基因在畢赤酵母中的表達(dá) 1、異源蛋白在酵母中表達(dá)的一般步驟 A、將編碼異源蛋白的DNA序列克隆進(jìn)含有 酵母啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列的表達(dá)框中。 B轉(zhuǎn)化及在宿王中穩(wěn)定維持此DNA融合產(chǎn) 物 C、異源蛋白在特定培養(yǎng)條件下合成D、異源蛋白的純化及其與天然產(chǎn)物的比較 2、外源蛋白的表達(dá)方式分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外兩種胞內(nèi)表達(dá)適于在胞漿中表達(dá)或不含二硫鍵 的非糖基化蛋白。分泌表達(dá)一般為優(yōu)先原則方式，因為畢赤 酵母只分泌很低水平的內(nèi)源蛋白，外源蛋 白的純化非常簡便。 3、表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工、修飾畢赤酵母

36、可以對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，包括信號肽加工、蛋白折疊、二硫鍵形成、 O-連接和N-連接糖基龍修飾、磷酸化修飾等。 4、影響外源蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)的 因素 (1)目的基因的特性 A、特定的A+T富含區(qū)可作為多腺昔酸或轉(zhuǎn) 錄終止信號，導(dǎo)致只產(chǎn)生低水平或截短的 mRNAo B、外源序列中的mRNA55非編碼區(qū)的核昔 酸序列和長度會影響核糖體40S亞單位識別 的障礙。 C、某些稀有密碼子是制約翻譯速率的因素。 (2)啟動子的影響常用的強(qiáng)啟動子有AOX1、GAP、FLD1這些強(qiáng)啟動子有時會引起外源蛋白高水平 表達(dá)，超過宿主細(xì)胞翻譯后處理加工能力 所能承擔(dān)的最大負(fù)荷量，引起蛋白的錯誤 折疊、不加工或錯

37、誤定位?？蛇x擇較溫和 的啟動子，女口PPEX8、PYPT1。 (3)基因劑量有些單拷貝的表達(dá)盒就可得到較理想的表 達(dá)產(chǎn)量，有些提高拷貝數(shù)可大大增加表達(dá) 水平，還有些增加拷貝數(shù)反而降低了表達(dá) 水平。因此，高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋 白量為唯一標(biāo)準(zhǔn)，基因劑量與表達(dá)水平的 關(guān)系取決于特定的外源蛋白。 (4)宿主、整合方式及轉(zhuǎn)化子的類型 AOX1位點(diǎn)的雙交換，可產(chǎn)生表型為ME(甲醇利用慢)的菌落，單交換引起的基因 插入，菌落表型為Mut+。一般情況下，胞內(nèi)表達(dá)最好選擇Mut$ ,分泌 表達(dá)，應(yīng)盡量選用表型Mut+。但是，對整 合位點(diǎn)、整合方式、轉(zhuǎn)化子表型的選擇應(yīng) 根據(jù)外源基因的特點(diǎn)和研究目的設(shè)計合

38、理 的技術(shù)路線。 (5)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素蛋白酶是一個重要因素。提高外源目的蛋白穩(wěn)定性的方法:降低培養(yǎng)基的pH和培養(yǎng)溫度, 作用的最適條件破壞蛋白酶培養(yǎng)基中添加蛋白月東和酵母提取物以增加 蛋白酶作用的底物選用蛋白酶缺陷型菌株做宿主菌進(jìn)行表達(dá) （6）發(fā)酵條件的影響通氣量碳源，常用甘油做碳源，但是碳源會抑制 AOX啟動子。一般采用甘油培養(yǎng)基使細(xì)胞 達(dá)到一定濃度，再加甲醇誘導(dǎo)的，兩步法 來表達(dá)外源蛋白。誘導(dǎo)時間起始pH添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)三、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)核型多角體病毒的多角體蛋白基因是病毒 感染晚期高效表達(dá)的基因。 1、其缺失對病毒復(fù)制增殖毫無影響，可以 作為外源基因理想的插入位點(diǎn)。2、多

39、角體蛋白被外源基因取代后，不形成 多角體，在顯微鏡下可以與野生型相區(qū)別。（一）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理首先建立一個轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，在這個轉(zhuǎn)移載體上 含有多角體蛋白基因的啟動子及多角體蛋白基因的旁側(cè)序列；然后將外源基因克隆至轉(zhuǎn)移載體的多接頭的合適酶切位點(diǎn)處，使其處于多角蛋白基因啟動子的控制之下；再將重組轉(zhuǎn)移載體與野生 型病毒DNA起共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，外源基因通過細(xì)胞內(nèi)同源重組而插入病毒基因組中。最后利用 空斑形態(tài)形態(tài)的差異進(jìn)行篩選、純化重組病毒， 再以純化的重組病毒感染宿主細(xì)胞或幼蟲，即可 獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。（二）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 1、重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能 2、能進(jìn)行翻譯后的加

40、工修飾 3、表達(dá)水平高 4、能容納大分子的插入片段 5、能同時表達(dá)多個基因 6、適合表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白 7、安全不足之處： 1、非連續(xù)性表達(dá)。重組桿狀病毒能導(dǎo)致宿 主死亡，所以每一輪外源蛋白的表達(dá)必須 重新感染新鮮的培養(yǎng)細(xì)胞或宿主2、其表達(dá)產(chǎn)物的糖基化相對簡單，多不分支，糖側(cè)鏈甘露糖成分咼缺之符合寡糖。-1 1、重1哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系的種類和數(shù)目已經(jīng)發(fā)展很快。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系有很多其他體系不能與之相比的優(yōu) 勢。它具有復(fù)雜的翻譯后加工系統(tǒng)，糖基化以及二硫鍵在 合成和分泌過程中自然而然的正確形成。哺乳動物細(xì)胞具 有產(chǎn)生正確折疊和完全生物活性的蛋白質(zhì)。實(shí)例：組織血纖維蛋白溶酶原激活