第7章免疫與血清學(xué)基本技術(shù).doc

1、學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考第七章免疫與血清學(xué)基本技術(shù)第一節(jié)免疫學(xué)基本知識(shí)一、抗原抗原是指能與 T 細(xì)胞及 B 細(xì)胞的受體結(jié)合，促使其增殖、分化，產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并與之結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮免疫效應(yīng)的物質(zhì)。抗原一般具有兩個(gè)重要特性：一是免疫原性，即抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力；二是抗原性，即抗原與其誘生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。既有免疫源性又有抗原性的物質(zhì)為完全抗原，而只有抗原性無(wú)免疫源性的物質(zhì)稱(chēng)為半抗原。決定 Ag 特異性的最小化學(xué)亞單位稱(chēng)為決定簇（又稱(chēng)表位）。依其與胸腺關(guān)系又分胸腺依賴(lài)抗原（TD-Ag ）和胸腺非依賴(lài)抗原（TI-Ag ）。絕大多數(shù)蛋白

2、質(zhì)抗原如病原微生物、血細(xì)胞、血清蛋白等均屬于TD-Ag 。抗原的免疫源性是異物性，抗原的特異性是免疫應(yīng)答中最重要的特點(diǎn)，也是免疫學(xué)診斷和免疫學(xué)防治的理論依據(jù)。人類(lèi)血型抗原有A 和 B 抗原，它們刺激機(jī)體產(chǎn)生抗A和抗B抗體。人類(lèi)血型抗原是同種異型抗原（同一種屬不同個(gè)體間的遺傳標(biāo)記不同）。器官移植所產(chǎn)生的排異反應(yīng)，也是因同種異型抗原所致。佐劑在免疫中常常采用，它主要的機(jī)制是增強(qiáng)機(jī)體對(duì)Ag 的免疫應(yīng)答。二、抗體抗體是抗原刺激機(jī)體由B 細(xì)胞產(chǎn)生的，本質(zhì)是免疫球蛋白（Ig）。Ig 的基本結(jié)構(gòu)是：4 條肽鏈（ 2 條輕鏈 -L 鏈、 2 條重鏈 -H 鏈）由二硫鍵連接。L 鏈分為可變部位（ V ）和恒定部

3、分（ C），即 VL+CL 。H 鏈也分為可變部位（V ）和恒定部分（ C），即 VH+CH ，但 CH 部分又分為 CH1、 CH2、 CH3。 IgM和 IgE 還有 CH4 部分。CH 1 與 CH2 區(qū)之間為絞鏈區(qū)。如果用木瓜酶水解后，將IgG 水解 2Fab 和 Fc。 Fab 是 Ig 與 Ag 結(jié)合部位， Fc 是可結(jié)晶部分。用胃蛋白酶水解IgG ，可分為 F(ab?)2 和 Fc 部分， F(ab?)2 是兩個(gè) Fab 連在一起的部分。Ig 的分類(lèi)是依據(jù)H 鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)， 主要依 Fc 部分（CH）。Ig 分為五大類(lèi)： IgG 、IgM 、IgA 、IgE 、IgD 。Ig 同

4、種型是指 H 鏈所具有的的特性。同一類(lèi) Ig 分型依據(jù) L 鏈結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為 和 型。 Ig 的 Fc 段部分可與某些細(xì)胞的Fc 受體結(jié)合，如巨噬細(xì)胞等。F(ab?)2 部分是與 Ag 結(jié)合部， VH+VL是 F(ab?)2 中的高變區(qū)，直接與Ag 能結(jié)合的部位。人類(lèi) 5 種 Ig 各具特色， IgM 分子量最大，免疫應(yīng)答早期產(chǎn)生的Ab 只要為 IgM 。IgG 在血清中含量最高，而且是唯一能通過(guò)人類(lèi)胎盤(pán)的Ig。IgA 經(jīng) J 鏈連接，可形成多聚 IgA 。多聚 IgA 與分泌片結(jié)合后，能抵抗蛋白酶的水解作用。有人稱(chēng)具備局部Ab 。IgE 可與肥大細(xì)胞膜上 Fc 受體結(jié)合。三、抗原抗體反應(yīng)每

5、一種抗原物質(zhì)都能在具有免疫功能的機(jī)體中遇到與其相應(yīng)的免疫細(xì)胞，結(jié)合在其表面受體上，激發(fā)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并且能夠與這種抗體特異性地結(jié)合。抗原與抗體的結(jié)合為非共價(jià)結(jié)合。其分子空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，決定了結(jié)合部位原子間的接近程度，使各種弱作用鍵充分發(fā)揮作用，形成相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)合。學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考在機(jī)體內(nèi)，抗原和抗體的結(jié)合導(dǎo)致補(bǔ)體激活，最終引起殺細(xì)胞或殺菌作用；或者結(jié)合于吞噬細(xì)胞表面的受體，引起對(duì)細(xì)菌或異物的吞噬作用?？乖c抗體的結(jié)合使特異性的，這種性質(zhì)構(gòu)成了各種免疫學(xué)測(cè)定的基礎(chǔ)；同時(shí)，這種結(jié)合反應(yīng)只是相對(duì)穩(wěn)固的，可以利用洗脫的方法將它們重新分離而不損害其活性，這種方法可以用于抗原或抗體

6、的提純。四、補(bǔ)體（ C ）存在于人和動(dòng)物血清中，不耐熱，可輔助特異性抗體介導(dǎo)的溶菌作用，由于這種成分是抗體發(fā)揮溶細(xì)胞作用的必要補(bǔ)充條件，這種物質(zhì)稱(chēng)為補(bǔ)體。補(bǔ)體由 9 種成分， 11 種蛋白組成： C1（ q、 r、 s）、 C2 、C3、C4 、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9。它們對(duì)溫度很敏感，易被破壞。補(bǔ)體系統(tǒng)包括補(bǔ)體及D、 P、B 等因子，約有20 種成分。補(bǔ)體激活有兩個(gè)途徑：傳統(tǒng)途徑（第一途徑）和旁路途徑（第二途徑）。第一途徑可被Ag-Ab 免疫復(fù)合物（IC ）活化?；罨樞蚴牵篊1、C4、C2、C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9。第二途徑可被細(xì)菌的脂多糖激活。補(bǔ)體的激

7、活是一種酶促級(jí)連反應(yīng)：第一種成分激活后，稱(chēng)為一種有活性的酶，催化下一種成分轉(zhuǎn)化為具有生物活性的物質(zhì)（蛋白酶或炎癥誘導(dǎo)成分）。補(bǔ)體的最后3 種成分將聚合成為“終末復(fù)合物”，其本身或在抗體的幫助下插入細(xì)菌外膜，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。五、免疫系統(tǒng)1、免疫組織器官（ 1）中蘇免疫器官：骨髓、胸腺、法氏囊（禽類(lèi)）（ 2）周?chē)庖咂鞴伲浩⑴K、淋巴結(jié)、皮膚免疫系統(tǒng)、黏膜免疫系統(tǒng)。2、免疫細(xì)胞干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞系（TH 、TC、T S、T DH 、B C 漿細(xì)胞等）、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK 細(xì)胞等。單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 IL-1 。3、免疫分子T CR、B CR、 CD、MHC 、 Ig、補(bǔ)體、細(xì)胞因子（

8、IL-1 、 IL-2 ）六、各免疫細(xì)胞特點(diǎn)1、T 細(xì)胞CD4 +可被 PHA 、ConA 、 PWM 、花生凝集素刺激活可分為幾群，其中T H 細(xì)胞是很重要的免疫細(xì)胞，化進(jìn)行有絲分裂，幫助產(chǎn)生抗體，司管細(xì)胞免疫。+TS 細(xì)胞是抑制細(xì)胞，CD8 參加免疫調(diào)節(jié)。T H 細(xì)胞成熟需要胸腺加工處理。T 細(xì)胞定位于淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)。2、B 細(xì)胞B 淋巴細(xì)胞主管體液免疫調(diào)節(jié)。表面有抗原受體（ SMIg）。BC 成熟在骨髓中（相當(dāng)禽類(lèi)法氏囊）。未成熟 BC 最初可查到 Ig 的 鏈，活化 BC 可衍變成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞能產(chǎn)生Ab 和分泌 Ab 。PWM 可以刺激 BC 有絲分裂。人類(lèi)外周血中 T 細(xì)胞與 B

9、細(xì)胞比為2：1。3、單核類(lèi)細(xì)胞學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考無(wú)Ag受體，但不能處理Ag ，加工Ag ，并向T 細(xì)胞呈遞Ag 。七、過(guò)敏反應(yīng)（變態(tài)反應(yīng)）國(guó)際公認(rèn)的過(guò)敏反應(yīng)是4 個(gè)型：型（速發(fā)型） 、型（溶細(xì)胞型） 、型（免疫復(fù)合物型或稱(chēng)血管炎型）、型（遲發(fā)型） 。第型是由IgE 抗體所致， IgE 與肥大細(xì)胞的IgE 的 Fc 受體結(jié)合產(chǎn)生一系列變化，出現(xiàn)型過(guò)敏。如青霉素過(guò)敏（皮內(nèi)注射過(guò)敏原）?；加新约纳x(chóng)感染疾患；IgE 抗體升高顯著。第型過(guò)敏反應(yīng)是由T 細(xì)胞中 T DH 細(xì)胞釋放淋巴因子所致。如結(jié)核菌素過(guò)敏試驗(yàn)（皮內(nèi)直射過(guò)敏原）第型、型過(guò)敏系由IgM 、 IgG 抗體及補(bǔ)體參與介導(dǎo)。

10、第二節(jié)抗體檢測(cè)一、抗體檢測(cè)的基本原理抗原與抗體之間特異性的結(jié)合反應(yīng)，是免疫學(xué)檢測(cè)的基礎(chǔ)，既抗原使用已知抗原來(lái)檢測(cè)抗體，也可以使用一直抗體來(lái)檢測(cè)抗原?？乖c抗體雖然都是大分子物質(zhì)，但單分子的抗原與抗體反應(yīng)仍然是肉眼無(wú)法覺(jué)察的反應(yīng)。要檢測(cè)抗體的存在， 就必須建立一中顯示系統(tǒng)，將看不見(jiàn)的抗原 -抗體反應(yīng)， 轉(zhuǎn)化為抗原看見(jiàn)、或者可以測(cè)定的反應(yīng)?？贵w測(cè)定抗原使用許多種不同的方法，本質(zhì)上浙西而方法只有顯示系統(tǒng)的誤差。不同的方法可以顯示出不同量的抗原-抗體反應(yīng)，因而，抗體檢測(cè)的方法主要決定了抗體檢測(cè)的靈敏度。檢測(cè)抗體必須使用已知的抗原，抗原可能是混雜的物質(zhì)。因而，在抗體測(cè)定中使用的抗原種類(lèi)，主要決定了抗體檢

11、測(cè)的特異性。二、抗體檢測(cè)方法(一）中和反應(yīng)中和反應(yīng)不僅測(cè)定抗體是否存在，而且測(cè)定抗體是否具有免疫保護(hù)作用，因而，盡管這種方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，影響因素眾多而且不穩(wěn)定，在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是病毒性疾病中，仍然是不可區(qū)帶的抗體檢測(cè)方法。中和試驗(yàn)的基本方法是，將待檢物質(zhì)與活的致病微生物混合，感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，然后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)病、死亡、或細(xì)胞是否發(fā)生病變。早期中和試驗(yàn)主要利用疾病的動(dòng)物模型進(jìn)行，目前，在病毒性疾病領(lǐng)域，通常利用培養(yǎng)病毒的細(xì)胞進(jìn)行。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當(dāng)注意，細(xì)胞的中和試驗(yàn)通常只反映抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力，這只是病毒致病過(guò)程中的一小部分。（二）沉淀反應(yīng)血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸

12、液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類(lèi)反應(yīng)稱(chēng)為沉淀反應(yīng)。該類(lèi)反應(yīng)可檢測(cè)到202mg/mL 水平的抗體。較常用的檢測(cè)方法有：1、單項(xiàng)免疫擴(kuò)散將一定量抑制抗原混于瓊脂中制成瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗體加入孔中擴(kuò)散，抗原抗體在擴(kuò)散過(guò)程形成以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測(cè)血清中的 IgG、 IgM 、 IgA 和補(bǔ)體 C3 等含量。2、雙相免疫擴(kuò)散將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中， 二者自由向四周擴(kuò)散， 在相遇處形成沉淀線。 可用于抗體的定性、定量檢測(cè)。（三）凝集反應(yīng)細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，這一類(lèi)反應(yīng)稱(chēng)為凝集反應(yīng)，該類(lèi)反應(yīng)可檢測(cè)到 1g/mL。學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集

13、于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考1、直接凝集將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。檢測(cè)方法有兩種：是玻片凝集試驗(yàn)，用于定性測(cè)抗原，多用于快速診斷；是試管凝集試驗(yàn)，在試管種系列稀釋待檢血清，加入已知顆?？乖ㄋ谰蚧罹?，多用死菌）行的血清反應(yīng)，用于定量檢測(cè)抗體。溫箱中放24 小時(shí)后取出反應(yīng)管在室溫放2 個(gè)小時(shí)再判斷為宜，判定凝集滴度以凝集程度為，進(jìn)+ 而定。2、間接凝集將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。如用 球蛋白包被的乳膠顆粒，檢測(cè)病人血清中的一種抗球蛋白的抗體（類(lèi)風(fēng)濕因子）（四）補(bǔ)體參加的反應(yīng)利用抗體與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補(bǔ)體，

14、導(dǎo)致紅細(xì)胞的溶解，用溶血現(xiàn)象作為指示系統(tǒng)幫助結(jié)果判定。常用的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和溶血空斑試驗(yàn)。（五）用標(biāo)記抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)利用熒光素、酶或放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點(diǎn)。1、免疫熒光將已知細(xì)菌、感染病毒的細(xì)胞等顆?？乖裙潭ㄓ谳d玻片，加待檢血清反應(yīng)后，再加熒光素標(biāo)記的抗體，置熒光顯微鏡下觀察判定，用于檢測(cè)抗體。2、酶免疫測(cè)定是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)?？捎媚繙y(cè)定性，也可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（OD ）值以反映抗體的含量，敏感度可達(dá)ng/mL甚至pg/mL 。常用語(yǔ)標(biāo)記的酶有辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。常用的方法

15、有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）。或采用雙抗體夾心法或間接法檢測(cè)特異抗體。3、放射免疫測(cè)定法用放射性的核素（ 125I 和 131I ）標(biāo)記抗原，檢測(cè)抗體，靈敏度達(dá)pg/mL 。4、免疫印跡法將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移至NC 或 PVDF 等膜上。檢測(cè)特異的抗體。用該法檢測(cè)血清HIV 抗體為診斷 HIV 感染的方法之一。三、抗體檢測(cè)所使用的抗原病原微生物，無(wú)論是細(xì)菌還是病毒，都含有許多種抗原物質(zhì)，在感染過(guò)程中，會(huì)形成反應(yīng)性非常復(fù)雜的抗體。這些抗原的特異性很不相同，有的只存在于該種致病微生物中，也有的可能是在細(xì)菌或病毒中廣泛存在時(shí)，甚至可以和動(dòng)物以至人體的組織產(chǎn)生交叉

16、反應(yīng)。因此，我們?cè)诤饬恳豁?xiàng)抗體檢測(cè)的結(jié)果時(shí)，不僅需要考慮所采用的方法和滴度的高低，還必須考慮用于檢測(cè)的是那一種類(lèi)型的抗原。1、全菌或全病毒抗原最早的血清學(xué)反應(yīng)，就是將細(xì)菌或病毒直接殺死后作為抗原進(jìn)行的。目前，這種類(lèi)型的抗原在一些疾病， 幾種類(lèi)型的試驗(yàn)方法如細(xì)菌凝集試驗(yàn)或免疫熒光檢測(cè)中仍在應(yīng)用。由于這種類(lèi)型的抗原物質(zhì)中成分復(fù)雜，很難避免交叉反應(yīng)，在用作疾病診斷時(shí)，必須結(jié)合臨床癥狀并對(duì)結(jié)果判定有較嚴(yán)格的限制。由于結(jié)果難于解釋?zhuān)@些方法很難用于大規(guī)模的疾病監(jiān)測(cè)。2、替代抗原由于一些種類(lèi)的微生物只能在細(xì)胞中生長(zhǎng)，無(wú)法獲得純培養(yǎng)，傳統(tǒng)上使用與它們具有交叉反應(yīng)的抗原物質(zhì)來(lái)測(cè)定這些疾病產(chǎn)生的抗體。學(xué)習(xí)資料學(xué)

17、習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考如診斷立克次體病使用的變形桿菌抗原或診斷梅毒的牛心脂抗原。由于這些抗原廣泛存在，這種檢測(cè)方法的結(jié)果只能具有參考價(jià)值。3、粗提取抗原在一些監(jiān)測(cè)方法發(fā)展較早的疾病中，已經(jīng)選用了病原微生物中高度特異的抗原成分，而在監(jiān)測(cè)方法中使用的抗原物質(zhì)，也已經(jīng)過(guò)了一定程度的提純，但其中仍會(huì)含有少量的其他雜散蛋白質(zhì)。在當(dāng)前使用的高靈敏度檢測(cè)方法中，極微量的蛋白質(zhì)也能顯示反應(yīng)。這說(shuō)明，使用這種類(lèi)型抗原的試驗(yàn)，雖然對(duì)結(jié)果能有明確的解釋?zhuān)匀淮嬖谥徊娣磻?yīng)的可能性。4、精提純抗原當(dāng)前，已經(jīng)有一些疾病的抗體檢測(cè)中，使用高度提純的抗原?？赡苁翘烊坏?，也可能是克隆的蛋白質(zhì)，能夠達(dá)到“層析純”的純度，

18、即經(jīng)過(guò)電泳只能見(jiàn)到清晰的單一蛋白質(zhì)條帶。使用這樣的抗原物質(zhì)進(jìn)行的檢測(cè)，可以得到最可靠的結(jié)果。然而，這仍然不能保證不同微生物之間具有共同抗原的可能性。使用分子克隆方法獲取的蛋白質(zhì)，不能認(rèn)為就已經(jīng)是精提純的抗原。因?yàn)槿魏慰寺《急仨氃谳d體中表達(dá)，不管表達(dá)的蛋白質(zhì)量有多大，其中還是會(huì)含有受體細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)中成分，這些成分仍然能夠引起交叉反應(yīng)。還有一些疾病，抗原的特異性本身就不夠明確，目前仍然需要通過(guò)蛋白印跡試驗(yàn)，不是通過(guò)明確的蛋白質(zhì)種類(lèi)，而是根據(jù)多種不明性質(zhì)的蛋白質(zhì)組成的圖形來(lái)確定診斷。在這樣的疾病，即使高度提純的抗原物質(zhì)也難于在監(jiān)測(cè)中應(yīng)用。四、抗體本地測(cè)定無(wú)論發(fā)展得多么成熟的檢測(cè)方法，也無(wú)論提取得多

19、么純粹的抗原，在大規(guī)模的疾病監(jiān)測(cè)中，還是會(huì)在無(wú)疾病的人群或動(dòng)物中顯示一定程度的反應(yīng)，這稱(chēng)為抗體本底，誒一種新的方法投入使用前，都必須進(jìn)行抗體本底測(cè)定。本底抗體可能有以下幾個(gè)主要的來(lái)源：1、雜散抗原致病微生物通常具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，其中許多是低特異性的，存在于許多微生物，甚至宿主機(jī)體之中。這些雜散抗原能產(chǎn)生低滴度的抗體。因而在根本沒(méi)有疾病流行的人群或動(dòng)物中，本底抗體反映著其他類(lèi)型的感染，甚至其他未知來(lái)源產(chǎn)生的抗體。2、共同抗原現(xiàn)代分子生物學(xué)表明，任何一個(gè)基因都是可能轉(zhuǎn)移的，多為的病原微生物，都是由于基因的轉(zhuǎn)移，從其非致病的祖先轉(zhuǎn)化而來(lái)。盡管在檢測(cè)中采用了高度特異并且高度提純的抗原，這種抗原仍然可

20、能存在著目前未知的其他來(lái)源。這種來(lái)源的抗原，有時(shí)可以在無(wú)疾病個(gè)體中產(chǎn)生高滴度的抗體。3、既往感染并非所有的本底抗體反應(yīng)都源自非特異性，個(gè)體在感染后，抗體可能保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，疾病在動(dòng)物間的存在常常不被人所發(fā)掘，人類(lèi)的感染也可能由于癥狀輕微或時(shí)間久遠(yuǎn)而無(wú)從追溯，于是，這些疾病過(guò)程所產(chǎn)生的抗體便成了本底抗體。進(jìn)行本底調(diào)查需要在一個(gè)已經(jīng)確認(rèn)沒(méi)有疾病流行的地區(qū)，采取一定數(shù)量的“健康個(gè)體”血清標(biāo)本，測(cè)定其中的抗體，并計(jì)算反應(yīng)的幾何平均抗體滴度?？贵w本底測(cè)定最主要的目標(biāo)，是建立疾病的安定標(biāo)準(zhǔn)。這需要積累一定數(shù)量的，經(jīng)過(guò)病原學(xué)確診的個(gè)體，測(cè)定病后不同時(shí)間的抗體水平，再與本底抗體水平相比較，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法確

21、定期間的判別值。只有這樣，抗體測(cè)定的方法才能夠在疾病診斷和監(jiān)測(cè)中實(shí)際應(yīng)用。第三節(jié)細(xì)胞免疫檢查學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考一、淋巴細(xì)胞的分離與類(lèi)型鑒定體外檢測(cè)淋巴細(xì)胞，需要先制備外周血單個(gè)核細(xì)胞（ PBMC ），制備 PBMC 常用的方法是葡聚糖 -泛影葡胺（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。以下方法通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞的某些表面標(biāo)志，可確定細(xì)胞的不同類(lèi)型。1、免疫熒光法常用直接或間接免疫熒光法檢查淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，鑒定細(xì)胞的群、亞群。如 CD4+ 和 CD8+ 細(xì)胞亞群，表達(dá)mIgD 、 mIgM 的 B 細(xì)胞亞群。2、磁珠分離法將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)到磁珠顆粒，與細(xì)胞懸液反應(yīng)后，

22、磁珠通過(guò)抗體結(jié)合相應(yīng)的細(xì)胞群或亞群表面，借助磁場(chǎng)，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與未結(jié)合的細(xì)胞分開(kāi)。3、淘選法將一直抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體包被培養(yǎng)皿，加淋巴細(xì)胞懸液，表達(dá)響應(yīng)表面標(biāo)記的細(xì)胞即與相應(yīng)抗體結(jié)合，而黏附于固相上，與懸液中的其他細(xì)胞分開(kāi)。4、流式細(xì)胞術(shù)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離，借助熒光激活細(xì)胞分選器（FACS ）對(duì)免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定和分類(lèi)技術(shù)。二、免疫細(xì)胞功能測(cè)定（一） T 細(xì)胞功能測(cè)定1、 T 細(xì)胞增殖試驗(yàn)采用 3H-TdR 摻入法檢測(cè)。在 PBMC 中加入植物血凝素（ PHA ）共同培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前 815 小時(shí)加入 3H-TdR ，由于 3H-TdR 能摻入細(xì)胞合成的 DNA 中，

23、細(xì)胞增殖的水平越高，摻入的放射性核素越高。用液體閃爍儀檢測(cè)細(xì)胞樣品中的放射活性，測(cè)定細(xì)胞的增值情況。2、細(xì)胞毒試驗(yàn)（ 1） 51Cr 釋放法：用 Na2CrO 4 標(biāo)記靶細(xì)胞，若待檢效應(yīng)細(xì)胞能殺傷靶細(xì)胞，測(cè)51Cr 從靶細(xì)胞內(nèi)釋放，用 計(jì)數(shù)儀測(cè)定釋放的 51Cr 放射活性，靶細(xì)胞溶解破壞越多，51Cr 釋放越多，上清液中的放射活性越低。（ 2）乳酸脫氫酶釋放法：將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按比例混合，靶細(xì)胞被殺傷后細(xì)胞膜受損，釋放出乳酸脫氫酶，用光度計(jì)測(cè)定溶液中的該酶的含量，反映效應(yīng)細(xì)胞的殺傷活性。（ 3）皮膚試驗(yàn)：根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度檢測(cè)。常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌

24、素、麻風(fēng)菌素等。（二） B 細(xì)胞功能測(cè)定1、 B 細(xì)胞增殖試驗(yàn)B 細(xì)胞受絲裂原刺激后，進(jìn)行分裂增殖，溫育一定時(shí)間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。2、抗體形成細(xì)胞測(cè)定常用溶血空斑試驗(yàn)測(cè)定。將 SRBC、待檢 B 細(xì)胞、補(bǔ)體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育 13 小時(shí)后，肉眼觀測(cè)分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個(gè)抗體形成細(xì)胞，空斑的數(shù)量即為抗體形成細(xì)胞數(shù)。三、免疫細(xì)胞因子測(cè)定細(xì)胞因子的檢測(cè)有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細(xì)胞，監(jiān)測(cè)某些疾病狀態(tài)的細(xì)胞免疫功能。1、免疫學(xué)檢測(cè)法用細(xì)胞因子單克隆抗體包被固相的雙抗體夾心法或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（也可用熒光素標(biāo)記抗細(xì)胞因子抗體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子作

25、染色，直接用ELISPOT ）測(cè)定法。FACS 分析法測(cè)定產(chǎn)生該細(xì)胞學(xué)習(xí)資料學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考因子的細(xì)胞比例。2、 RT-PCR 法設(shè)計(jì)特定引物，逆轉(zhuǎn)錄特定細(xì)胞因子的mRNA ，然后用特定引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。第四節(jié)抗原檢測(cè)一、抗原檢測(cè)的目的1、疾病的快速診斷由人或動(dòng)物的組織、器官或其他標(biāo)本中檢出病原微生物特征性的抗原成分，可以對(duì)某些疾病作出早期診斷。2、病原微生物鑒定分離獲得病原微生物后，可以通過(guò)抗原檢測(cè)確定其血清型，或者通過(guò)針對(duì)致病決定因子的抗原檢測(cè)確定其致病性。3、生物活性物質(zhì)的抗原分析提取的或人工合成的生物活性物質(zhì)，如果具有抗原性，都可以利用抗原檢測(cè)的方法

26、確定其生物活性。二、抗原的檢測(cè)方法在“抗體檢測(cè)”一節(jié)中介紹的方法，都可以通過(guò)相反方向的運(yùn)用，即使用已知抗體，通過(guò)類(lèi)似的方法來(lái)進(jìn)行抗原檢測(cè)。三、單克隆抗體的應(yīng)用與抗體檢測(cè)方法類(lèi)似，用于檢測(cè)的抗體，決定了抗原檢測(cè)的特異性。單克隆抗體的出現(xiàn)，使抗原測(cè)定稱(chēng)為精確的免疫學(xué)方法。一種 B 淋巴細(xì)胞抗原刺激后只能產(chǎn)生一種抗體，因此稱(chēng)其為單克隆抗體。使用細(xì)胞雜交技術(shù)，使免疫的小鼠脾細(xì)胞，與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞株可以在體外條件下任意增殖，并產(chǎn)生專(zhuān)一的，融合的 B 淋巴細(xì)胞特異的抗體，從而使單克隆抗體成為一種實(shí)用的技術(shù)。單克隆抗體的特點(diǎn)是：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來(lái)源容易。單克隆抗體用于抗原檢測(cè)時(shí)能充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。單克隆抗體的特異性強(qiáng)， 大大提高了抗原 -抗體反應(yīng)的特異性， 減少了和其他物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性，使試驗(yàn)結(jié)果可信度更大。單抗