分子生物學(xué)：第九章基因診斷1

1、第九章 基因診斷第一節(jié) 基因診斷的概念及常用技術(shù)基因診斷基因診斷利用分子生物學(xué)技術(shù)，從利用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA/RNADNA/RNA水平檢測水平檢測基因的存在基因的存在, ,分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，從而對(duì)疾病作出診斷態(tài)，從而對(duì)疾病作出診斷?；蛟\斷檢測的目標(biāo)分子是基因診斷檢測的目標(biāo)分子是DNADNA或或RNARNA，反映，反映基因的結(jié)構(gòu)和功能。檢測的基因有內(nèi)源性基因的結(jié)構(gòu)和功能。檢測的基因有內(nèi)源性( (即機(jī)體自身的基因即機(jī)體自身的基因) )和外源性正如病毒、細(xì)和外源性正如病毒、細(xì)菌等兩種，前者用于診斷基因有無病變，菌等兩種，前者用于診斷基因有無病變，后者用于

2、診斷有無病原體感染。后者用于診斷有無病原體感染。 一、基本概念一、基本概念二 基因診斷的特點(diǎn)高特異性高特異性高靈敏度高靈敏度早期快速早期快速適用性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣適用性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣三、基因診斷常用方法核酸分子雜交核酸分子雜交PCRPCR及衍生技術(shù)及衍生技術(shù)DNADNA序列測定序列測定 DNADNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)( (一一) )核酸分子雜交核酸分子雜交基本原理基本原理-核酸變性和復(fù)性理論核酸變性和復(fù)性理論 即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。因此應(yīng)用已知堿基序

3、列的單鏈核成雙鏈結(jié)構(gòu)。因此應(yīng)用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核苷酸序列。與其互補(bǔ)的同源核苷酸序列。probeprobe核酸分子雜交流程核酸分子雜交流程 待測核酸制備待測核酸制備濾膜上核酸固化濾膜上核酸固化雜交雜交去除未雜交的探針去除未雜交的探針檢測雜交信號(hào)檢測雜交信號(hào)核酸探針制備核酸探針制備探針標(biāo)記探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針加入標(biāo)記探針核酸雜交方法分類核酸雜交方法分類按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固固相雜交是將參加反

4、應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。中。固相雜交分類Southern Southern 印記雜交印記雜交Northern Northern 印記雜交印記雜交斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交原位雜交原位雜交Southern blot是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的的DNADNA片段，而且能進(jìn)行定量和測定分子片段，而且能進(jìn)行定量和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、量，可用于基因的酶切圖譜分析、RFLPRFLP、基因

5、缺失型突變分析等?；蛉笔屯蛔兎治龅取orthernNorthern雜交雜交用于用于RNARNA的檢測，能對(duì)組織細(xì)胞中總的檢測，能對(duì)組織細(xì)胞中總RNARNA或或mRNAmRNA進(jìn)行定性和定量分析。進(jìn)行定性和定量分析。如脆性如脆性X X綜合征綜合征 脆性脆性X X致病基因致病基因1 1 表達(dá)表達(dá)脆性脆性X X智力低下蛋白智力低下蛋白 水平水平斑點(diǎn)雜交（斑點(diǎn)雜交（Dot blotDot blot）或狹縫雜交）或狹縫雜交是直接將被測是直接將被測DNADNA或或RNARNA固定在濾膜上，然后加入固定在濾膜上，然后加入過量的標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。過量的標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。優(yōu)點(diǎn)主要是在同一張膜上

6、可以進(jìn)行多個(gè)樣品的檢優(yōu)點(diǎn)主要是在同一張膜上可以進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測測; ;根據(jù)斑點(diǎn)雜交的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的根據(jù)斑點(diǎn)雜交的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)?？捎没蚪M中特定基因及其表達(dá)的定性拷貝數(shù)?？捎没蚪M中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少。及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少。缺點(diǎn)是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，缺點(diǎn)是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。有一定比例的假陽性。反向斑點(diǎn)印跡雜交(reverse dot blot (reverse dot blot hybridization)hybridization) 先

7、固定探針于膜上，用一張含有多種特異性寡核先固定探針于膜上，用一張含有多種特異性寡核苷酸探針的膜與待測目的基因雜交，經(jīng)過一次雜苷酸探針的膜與待測目的基因雜交，經(jīng)過一次雜交便可同時(shí)篩查出被檢交便可同時(shí)篩查出被檢DNADNA中的多種突變，因而改中的多種突變，因而改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種突變變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種突變的局限，大大提高了基因診斷的效率。的局限，大大提高了基因診斷的效率。主要應(yīng)用在遺傳病的基因診斷、病原微生物的鑒主要應(yīng)用在遺傳病的基因診斷、病原微生物的鑒定分型及癌基因的點(diǎn)突變分析等領(lǐng)域定分型及癌基因的點(diǎn)突變分析等領(lǐng)域 原位雜交原位雜交（Colony in s

8、itu hybridizationColony in situ hybridization）用特定標(biāo)記的已知核酸片段作為探針與細(xì)胞或用特定標(biāo)記的已知核酸片段作為探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交、實(shí)行檢測的方法。組織切片中的核酸進(jìn)行雜交、實(shí)行檢測的方法。該技術(shù)可以用來檢測該技術(shù)可以用來檢測DNADNA在細(xì)胞核或染色體上的在細(xì)胞核或染色體上的分布及特定基因在細(xì)胞中表達(dá)情況，還可以用分布及特定基因在細(xì)胞中表達(dá)情況，還可以用于組織、細(xì)胞中某種病菌和病毒等病原體的檢于組織、細(xì)胞中某種病菌和病毒等病原體的檢測。測。熒光原位雜交(fluorescence (fluorescence in situ in

9、 situ hybridizationhybridization， FISH)FISH)熒光標(biāo)記探針比放射性標(biāo)記探針更穩(wěn)定，熒光標(biāo)記探針比放射性標(biāo)記探針更穩(wěn)定，安全和環(huán)保；安全和環(huán)保；多色多色FISHFISH可以在同一細(xì)胞往中顯示不同的可以在同一細(xì)胞往中顯示不同的顏色，從而同時(shí)檢測兩種或多種序列；顏色，從而同時(shí)檢測兩種或多種序列；應(yīng)用不同的探針可以顯示某一物種的全部應(yīng)用不同的探針可以顯示某一物種的全部基因或某一染色體、染色體片段及單拷貝基因或某一染色體、染色體片段及單拷貝序列。序列。熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISHFISH）掛鎖FISH (FISH with padlock)FISH (F

10、ISH with padlock) 探針中間部分為連接序列，連接標(biāo)記物。探針中間部分為連接序列，連接標(biāo)記物。當(dāng)其兩側(cè)臂的序列與目的當(dāng)其兩側(cè)臂的序列與目的DNADNA序列完全互補(bǔ)序列完全互補(bǔ)并結(jié)合時(shí)并結(jié)合時(shí), ,可在可在DNADNA連接酶的作用下形成一連接酶的作用下形成一個(gè)環(huán)，形似掛鎖，該探針被稱為個(gè)環(huán)，形似掛鎖，該探針被稱為“掛鎖探掛鎖探針針”。這種形式的雜交體，可以經(jīng)受住較強(qiáng)烈的這種形式的雜交體，可以經(jīng)受住較強(qiáng)烈的洗滌條件，從而大幅度減少背景誤差，顯洗滌條件，從而大幅度減少背景誤差，顯示出清晰的雜交信號(hào)。示出清晰的雜交信號(hào)。 菌落雜交法(colony hybridization)(colon

11、y hybridization)用于基因工程研究中重組子的篩選或用于基因工程研究中重組子的篩選或 臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。臨床標(biāo)本檢驗(yàn)。菌落原位雜交菌落原位雜交; ; 噬菌斑原位雜交；而在臨噬菌斑原位雜交；而在臨床標(biāo)本檢驗(yàn)中可把平板上分離的單個(gè)菌落床標(biāo)本檢驗(yàn)中可把平板上分離的單個(gè)菌落或分離物點(diǎn)在膜上，或直接把標(biāo)本點(diǎn)在膜或分離物點(diǎn)在膜上，或直接把標(biāo)本點(diǎn)在膜上使其形成菌苔，經(jīng)處理后進(jìn)行雜交，這上使其形成菌苔，經(jīng)處理后進(jìn)行雜交，這些方法統(tǒng)稱為菌落雜交。些方法統(tǒng)稱為菌落雜交。 夾心雜交法(sandwich hybridization)(sandwich hybridization)用位于待測靶基因序列上兩個(gè)相鄰

12、但不重用位于待測靶基因序列上兩個(gè)相鄰但不重疊的疊的DNADNA序列片段序列片段(A(A、B B片段片段) )，分別作為捕，分別作為捕捉探針捉探針( (不標(biāo)記的不標(biāo)記的A A片段片段) )和檢測探針和檢測探針( (標(biāo)記標(biāo)記的的B B片段片段) )，同時(shí)與靶基因雜交。，同時(shí)與靶基因雜交。夾心雜交法的優(yōu)點(diǎn)是特異性好，對(duì)核酸樣夾心雜交法的優(yōu)點(diǎn)是特異性好，對(duì)核酸樣品純度要求不高，定量較準(zhǔn)確。品純度要求不高，定量較準(zhǔn)確。固相夾心雜交法示意圖固相夾心雜交法示意圖 （二）PCRPCR及衍生技術(shù)PCRPCR技術(shù)技術(shù)* *逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR RT-PCR RT-PCR熒光定量熒光定量PCRPCR (FQ-P

13、CR) (FQ-PCR) 多重多重PCRPCR長片段長片段PCRPCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶聚合酶變性變性延伸延伸退火退火 RT-PCR#熒光定量熒光定量PCR熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物# 多重多重PCR檢測特定基因序列的存在或缺失檢測特定基因序列的存在或缺失 多重多重PCRPCR示意圖示意圖 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR#長片段PCRPCRPCRPCR擴(kuò)增長片段目的基因需要解決的問題擴(kuò)增長片段目的基因需要解決的問題Taq Taq D

14、NADNA聚合酶的活性及保真性聚合酶的活性及保真性模板模板非特異片段非特異片段改良方案改良方案高質(zhì)量高質(zhì)量Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶模板完整，量模板完整，量要優(yōu)化要優(yōu)化較長引物（較長引物（21342134個(gè)堿基）個(gè)堿基）緩緩沖液沖液熱循環(huán)參數(shù)熱循環(huán)參數(shù)（三）結(jié)合PCRPCR進(jìn)行基因診斷的其他技術(shù)采用采用PCRPCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLPsPCR-RFLPs）進(jìn)行基因診斷）進(jìn)行基因診斷采用采用PCRPCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針（ASOASO）斑點(diǎn)雜交進(jìn)行基因診斷）斑點(diǎn)雜交進(jìn)行基因診斷 *

15、*采用采用PCRPCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCPSSCP分析進(jìn)分析進(jìn)行基因診斷行基因診斷 限制性片段長度多態(tài)性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于由于DNA DNA 變異產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或原有的酶切變異產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或原有的酶切位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不同位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段。長度或不同數(shù)量的片段。 可借助核酸分子雜交或可借助核酸分子雜交或PCRPCR進(jìn)行檢測。進(jìn)行檢測。ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +D

16、AEcoR 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，在PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增后用該限制酶切割增后用該限制酶切割PCRPCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。切片段長度變化，即可作出診斷。PCR-RFLP# PCR-ASO(等位基因特異寡核苷酸探針雜交等位基因特異寡核苷酸探針雜交) N N：正?；颍唬赫；颍籋 H：雜合子基因；：雜合子基因；M M：突變基因：突變基因ASO1ASO2NHM單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single-

17、strand conformation polymorphism, SSCP） DNA DNA 的突變?cè)斐傻耐蛔冊(cè)斐蒁NADNA片段中堿基序列不同，片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來?？墒垢鞣N序列不同的單鏈分離開來。PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意正常人正常人純合突變純合突變雜合突變雜合突變+ + PCR-SSCP分析分析 （四） DNA序列測定（DNA sequencing）DNA序列測定原理序列測定原理(雙脫

18、氧末端終止法雙脫氧末端終止法)（三） DNADNA序列測定 DNADNA序列測定是進(jìn)行基因突變檢測的序列測定是進(jìn)行基因突變檢測的最直接、最準(zhǔn)確的方法，可以確定突最直接、最準(zhǔn)確的方法，可以確定突變的部位，突變的性質(zhì)。變的部位，突變的性質(zhì)。左側(cè)：正常；右側(cè)突變左側(cè)：正常；右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究序列分析用于基因診斷研究（四 ） DNADNA芯片技術(shù) 應(yīng)用應(yīng)用DNADNA芯片，可以檢測基因的結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對(duì)基芯片，可以檢測基因的結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對(duì)基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。（六）生物芯片（biochips）基因芯片（基因芯片（gene chips）蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)基因芯片雜交流程示意圖基因芯片雜交流程示意圖基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法方法優(yōu)點(diǎn)