多糖的提取和純化.doc

1、多糖的提取和純化多糖的提取和純化多糖的提取和純化摘要本文較詳細(xì)地介紹了多糖的提取和純化方法，為多糖的研究和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞多糖；提取；純化；活性炭多糖（ polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由 10 個(gè)以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物（細(xì)菌和真菌）與動(dòng)物體內(nèi)。 20 世紀(jì) 60 年代以來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有復(fù)雜的、 多方面的生物活性和功能 1 ：(1) 多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、 癌癥等免疫系統(tǒng)疾病， 甚至能抗 AIDS 病毒 2 。如甘草多糖具有

2、明顯的抗病毒和抗腫瘤作用10 ，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強(qiáng)人體免疫功能3-5 。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)作用 6 ，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強(qiáng)作用 7-8 ，動(dòng)物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能 9 。(3)多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用 10 ，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能 11 。另外，多糖作為藥物，其毒性極小，因而多糖供參考的研究已引起人們極大的興趣。由于多糖具有的生物活性與

3、其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，而多糖的結(jié)構(gòu)又是相當(dāng)復(fù)雜的，所以在這一領(lǐng)域的研究相對(duì)緩慢。但人們?cè)诙嗵堑姆蛛x提取與純化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取 121.1熱水浸提法：1.1.1 多糖提取條件的優(yōu)選根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道13 ：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時(shí)間、提取次數(shù)、溶劑體積、浸提溫度、 pH 值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗(yàn)前對(duì)上述多種因素利用正交實(shí)驗(yàn)法做出優(yōu)選，才能選出最佳提取方案。 1.1.2 其步驟為：原料粉碎脫脂粗提（2 3 次）吸濾或離心沉淀洗滌干燥首先除去表面脂肪。原料經(jīng)粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1： 1 的乙醇乙醚混合液，水浴加熱攪拌或回流13 小時(shí)，脫脂后過濾得到的殘?jiān)?/p>

4、一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀堿性水液、氯化鈉水液、 1醋酸和1苯酚或 0.1 1M 氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90 100，攪拌 46 小時(shí)，反復(fù)提取 2 3 次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進(jìn)行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質(zhì)除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為堿性則需要中和）。然后濃縮，再加入2 5 倍低級(jí)醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入費(fèi)林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質(zhì)結(jié)合生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干后疏松的多糖迅速轉(zhuǎn)入裝有五氧化二磷和氫氧供參考化鈉的真空干燥器中減壓干燥（若沉淀的多糖為膠狀或具粘著性時(shí)，可

5、直接冷凍干燥）。干燥后可得粉末狀的粗多糖。1.2 微波輔助提取法：其原理為利用不同極性的介質(zhì)對(duì)微波能的不同吸收程度，使基體物質(zhì)中的某些區(qū)域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質(zhì)從基體或體系中分離出來(lái)，進(jìn)入到介電常數(shù)小，微波吸收能力較差的萃取劑中14 。由于微波能極大加速細(xì)胞壁的破裂，因而應(yīng)用于中草藥中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產(chǎn)率。而且由于其選擇性好，提取后基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清 15 。聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取 18 中對(duì)微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取法所需時(shí)間最短（ 10min ），多糖的

6、提取率最高（ 28.46）。 1.3 超聲輔助法：其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，利于提取 16 。超聲波輔助法與常規(guī)提取法相比，具有提取時(shí)間短、 產(chǎn)率高、 無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn) 17 。1.4 索氏提取法：將植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚， 60 -90條件下提取至無(wú)色（一般為6 小時(shí)）。過濾，濾渣揮發(fā)干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6 小時(shí)，過濾，濾渣乙醇揮發(fā)干燥后加蒸餾水?；亓魈崛? 次，趁熱過濾，濾液減壓濃供參考縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60干燥，稱重

7、。1.5 醇提法：先后將 90%和 50%乙醇加入植物粉末中，振蕩充分再抽濾。濾液中加入足量無(wú)水乙醇，至于 4冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素， 得多糖粗品， 在 60通風(fēng)干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法簡(jiǎn)單，易于操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規(guī)模提取使用。1.6其它方法：多糖的提取方法還有稀堿液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀堿條件下，易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗(yàn)中避免采用稀堿液浸提法和稀酸液浸提法。2. 多糖的純化 2.1 多糖中雜質(zhì)除去方法粗多糖中往往混雜著蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)，必須分別除去。 2.

8、1.1 除蛋白質(zhì)采用醇沉或其它溶劑沉淀所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質(zhì)，脫去蛋白質(zhì)的方法有多種：如選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣質(zhì)等試劑來(lái)處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有19 ：2.1.1.1沙維積法 （ Sevag 法）20 ：根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑變性而不溶與水的特點(diǎn)，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調(diào)為 25:5:1 或 25:4:1，混合物劇烈振搖 20 到 30 分鐘，蛋白質(zhì)與氯仿戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然后離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味供參考子

9、多糖的提取實(shí)驗(yàn)中要重復(fù)處理達(dá)三十幾次。并且每次除去蛋白質(zhì)變性膠狀物時(shí)，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時(shí)會(huì)沉淀下來(lái)，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質(zhì)水解酶，再用 Sevage 法效果更佳。 2.1.1.2 三氟三氯乙烷法 21 ：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min 左右，離心得上面水層，水層繼續(xù)用上述方法處理幾次，即得無(wú)蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。 2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5 30三氯醋酸，直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，在 5 10 放置過夜，離心除去沉淀即得無(wú)蛋白質(zhì)的

10、多糖溶液。此法會(huì)引起某些多糖的降解。 Sevag 法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會(huì)像蛋白質(zhì)那樣沉淀出來(lái)。對(duì)于對(duì)堿穩(wěn)定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀堿溫和處理，可以把這種結(jié)合蛋白質(zhì)分開1 。 2.1.1.4 酶解法22 ：在樣品溶液中加入蛋白質(zhì)水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、 鏈霉蛋白酶等， 使樣品中的蛋白質(zhì)降解。通常將其與Sevag 法綜合使用除蛋白質(zhì)效果較好。2.1.1.5 鹽酸法 23 ：取樣品濃縮液，用 2mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)其 PH 至 3，放置過夜，在 3000r/min 條件下離心，棄去沉淀，即脫去蛋白質(zhì)。另有李知敏 23 和葉將瑜 25

11、等人分別在植物多糖實(shí)驗(yàn)中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及 Sevag 法脫蛋白率分別為供參考72.5、46.1和 42.3，多糖的損失率分別為15.1%、6.1和 14.3。鹽酸法脫蛋白率高， 但多糖的損失率也較高 ;三氯乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高； Sevag 法的脫蛋白效果不及前兩種。 2.1.1.6 其它方法：可以加入 5%ZnSO4 溶液和飽和 Ba（ OH ） 2 溶液，振蕩后離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結(jié)合 Sevag 法使用。還可在提取液中加入50%的TCA 溶液至沉淀完全，在4000r/min 的條件下離心10min ，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1 的氯仿 -

12、乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復(fù)多次方可除盡蛋白。除去蛋白質(zhì)的樣品用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，觀察在 280mm 處是否有吸收，如果無(wú)吸收則表明蛋白質(zhì)已經(jīng)除盡 24 。2.1.2 除色素 2.1.2.1 活性炭（ activated carbon）除色素 12 ：活性炭屬于非極性吸附劑， 有著較強(qiáng)的吸附能力，特別適合于水溶性物質(zhì)的分離。它的來(lái)源充足，價(jià)格便宜，上柱量大，適用于大量制備性分離。目前用于色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因?yàn)榛钚蕴繒?huì)吸附多糖，造成多糖的損失。2.1.2.2 對(duì)于植物來(lái)源的多糖，

13、可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負(fù)性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱堿性樹脂DEAE纖維素或 DuoliteA 7 來(lái)吸附色素。 2.1.2.3 若糖和色素時(shí)結(jié)合的，易被DEAE 纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可供參考進(jìn)行氧化脫色：以濃氨水或 NaOH 液調(diào)至 PH8.0 左右， 50 以下滴加 H2O2 至淺黃色，保溫 2 小時(shí)。2.1.2.4 依次用丙酮、無(wú)水乙醚和無(wú)水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡(jiǎn)單，便于操作，多糖損失也較小。2.1.2.5用 4:1的氯仿 -正丁醇除色素。操作簡(jiǎn)單，多糖有一定損失。2.1.2.6發(fā)酵來(lái)源的多糖顏色一般較淺，色素含量較

14、少，一般可不除色素。 2.1.2.7 對(duì)于動(dòng)物，微生物等提取得到的多糖也可根據(jù)不同情況按上述方法處理。2.1.3 除低聚糖等小分子雜質(zhì)2.1.3.1 采用逆向流水透析法。即準(zhǔn)備好一桶蒸餾水，用一根導(dǎo)管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導(dǎo)管將水引出，根據(jù)水量控制流速，使水緩慢流動(dòng)48 小時(shí)。這樣得到的就是多糖的半精品。 2.1.3.2 利用溶液濃度擴(kuò)散效應(yīng)，將分子量小的物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質(zhì)。具體的做法是根據(jù)多糖溶液的體積截取相應(yīng)長(zhǎng)度的透析袋，用透析夾夾住一端， 灌入多糖液， 離液面 2 3cm 處夾緊透析袋，置于一大燒杯中

15、，注入蒸餾水至完全浸沒透析袋后，用磁力攪拌器慢速攪拌， 每 12 小時(shí)換一次水， 重復(fù) 3 4 次。2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種： 2.2.1 分部沉淀法 根據(jù)各種多糖在不同濃度的低級(jí)醇或丙酮中具有不同溶解度的性質(zhì)，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同供參考濃度下析出的沉淀，經(jīng)反復(fù)溶解與沉淀后，直到測(cè)得的物理常數(shù)恒定（最常用的是比旋光度測(cè)定或電泳檢查）。這種方法適合于分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩(wěn)定，常在 pH7 進(jìn)行，唯酸性多糖在pH7 時(shí) COOH 是以COO 離子形式存在的，需在 pH2 4 進(jìn)行分離，為

16、了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖制成各種衍生物如甲醚化物、乙?；锏龋缓髮⒍嗵茄苌锶苡诖贾?，最后加入乙醚等極性更小的溶劑進(jìn)行分級(jí)沉淀分離。2.2.2 鹽析法 在天然產(chǎn)物的水提液中，加入無(wú)機(jī)鹽，使其達(dá)到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，與其它水溶性較大的雜質(zhì)分離。常做鹽析的無(wú)機(jī)鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。2.2.3 季銨鹽沉淀法季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物并不與中性多糖產(chǎn)生沉淀，但當(dāng)溶液的PH 增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時(shí)，也會(huì)與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽有十六烷基

17、三甲胺的溴化物（CTAB ）及其氫氧化物（cetyltrimethyl ammonium hydroxide ，CTA OH ）和十六烷基吡啶（ cetylpyridinm hydroride ， CP OH ）。 CTAB 或 CP OH 的濃度一般為 1 10（ W/V ）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉淀出來(lái)，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。 值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH供參考要小于 9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會(huì)被沉淀出來(lái)。 2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及

18、硅膠做載體的柱層來(lái)分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。纖維素柱層析纖維素柱層析對(duì)多糖的分離既有吸附色譜的性質(zhì)，又具有分配色譜的性質(zhì)，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先后順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，與分級(jí)沉淀法正好相反。纖維素陰離子交換柱層析最常見的交換劑為 DEAE 纖維素 （硼酸型或堿型） ，洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。般單糖、低聚糖因醛基而發(fā)生的顏色反應(yīng)在多糖上不明顯，電泳后常用的顯色劑是p茴香胺硫酸溶液（p anisidine）和過碘酸希夫試劑等。2.3.3凝膠柱層析常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為 0.020.2molNaCl 溶液或 0.04mol 吡啶與 0.02