5.3血紅蛋白的提取和分離(定稿)

1、課題課題3 3：血紅蛋白的提取和分離：血紅蛋白的提取和分離 血紅蛋白存在于紅細(xì)胞內(nèi)，含有四條肽鏈血紅蛋白存在于紅細(xì)胞內(nèi)，含有四條肽鏈, ,每條肽鏈環(huán)每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一分子氧一分子氧或或一分子二一分子二氧化碳，氧化碳，血紅蛋白因含有血紅蛋白因含有血紅素血紅素而呈而呈紅色。紅色。一一. . 基基 礎(chǔ)礎(chǔ) 知知 識(shí)識(shí)蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)不同蛋白質(zhì)的物理、不同蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同：化學(xué)性質(zhì)不同： 不同蛋白質(zhì)的形狀、不同蛋白質(zhì)的形狀、大小大小、電荷性質(zhì)和多少、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等等各不相同。溶

2、解度、吸附性質(zhì)、親和力等等各不相同。 ( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法1 1、凝膠：、凝膠： 根據(jù)被分離物質(zhì)的根據(jù)被分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠( (分子篩作用分子篩作用) )，來進(jìn)行分離。來進(jìn)行分離。一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的孔隙，由一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的孔隙，由多糖類構(gòu)成，如葡聚糖、瓊脂糖）多糖類構(gòu)成，如葡聚糖、瓊脂糖）由葡萄糖通過不同方式形成的聚糖。 2 2、原理：、原理：小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短

3、，流動(dòng)快；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠內(nèi)部；2 2、原理：、原理：小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法小分子物質(zhì)在向下移動(dòng)的過程中，從一個(gè)凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒；2 2、原理：、原理：小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，

4、流動(dòng)慢。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)；2 2、原理：、原理：小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。( (一一) )凝膠色譜法凝膠色譜法4.4.具體過程具體過程 混合物

5、混合物上上 柱柱洗洗脫脫大分子流動(dòng)快大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢小分子流動(dòng)慢收集收集大分子大分子收集收集小分子小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分 子產(chǎn)生差速流動(dòng)。子產(chǎn)生差速流動(dòng)。 1 1 、緩沖液是什么？、緩沖液是什么？2 2、 緩沖液有什么作用呢？緩沖液有什么作用呢？（二）、緩沖溶液（二）、緩沖溶液- 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外來少量強(qiáng)酸或強(qiáng)外來少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿堿的影響，并使原來溶液的影響，并使原來溶液PHPH值基本保持值基本保持不變的混合溶液。不變的混合溶液。 由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如由弱酸

6、和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸醋酸/ /醋酸鈉，醋酸鈉， NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對(duì)溶液對(duì)溶液PHPH值值的影響，的影響，維持維持PHPH基本不變?；静蛔?。洗脫劑洗脫劑3 3、 緩沖液是如何配制的？緩沖液是如何配制的？ 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩沖劑溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。pHpH5.86.06.26.46.66.88.0 mL12.3 mL18.5 mL26.5 mL37.5 mL49.0 mL92.0 mL87.7

7、 mL81.5 mL73.5 mL62.5 mL51.0 mL7.07.27.47.67.88.061.0 mL72.0 mL81.0 mL87.0 mL91.5 mL94.7 mL39.0 mL28.0 mL19.0 mL13.0 mL8.5 mL5.3 mL0.2 mol/LNaHNaH2 2POPO4 4/mL/mL0.2 mol/LNaNa2 2HPOHPO4 4/mL/mL0.2 mol/L0.2 mol/LNaHNaH2 2POPO4 4/mL/mLNaNa2 2HPOHPO4 4/mL/mL3 3、 緩沖液是如何配制的？緩沖液是如何配制的？ 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩

8、沖劑溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。 通過通過調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)緩沖劑的緩沖劑的使用比例使用比例就可以制就可以制得得不同不同pH的緩沖液。的緩沖液。4 4、 本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？ 為何要加緩沖液？為何要加緩沖液？, ,利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pHpH環(huán)境，環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察便于觀察( () )和科學(xué)研究和科學(xué)研究( () )磷酸緩沖液磷酸緩沖液（三）電（三）電 泳泳1 1、概念：、概念：帶電粒子帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2 2、原理：、原理： 電泳利用電泳

9、利用了待分離樣品中各種了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子帶電性質(zhì)的差異以及 分子本身的大小，形狀的不同分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的，使帶電分子產(chǎn)生不同的 遷移速度遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離分離。 許多許多重要的重要的生物大分子生物大分子，如多肽、核酸等都具，如多肽、核酸等都具有可解離有可解離 的基團(tuán)的基團(tuán)，在一定的，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電正電或負(fù)電。 在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反電荷相反 的的電極移動(dòng)。電極移動(dòng)。3.3.分類：分

10、類：瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳和和聚丙稀酰胺凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳+ + + + +電泳原理圖解電泳原理圖解 相對(duì)分子質(zhì)量等不同相對(duì)分子質(zhì)量等不同，其其移動(dòng)速度不同移動(dòng)速度不同，從而實(shí)現(xiàn)了各種分子的，從而實(shí)現(xiàn)了各種分子的分離分離。 各種各種分子大小、分子大小、 帶電性質(zhì)、帶電性質(zhì)、 分子形狀、分子形狀、+ + + + +不同大小不同大小DNA片段的混合液片段的混合液樣品處理樣品處理粗分離粗分離純純 化化純度鑒定純度鑒定二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作 ？ 動(dòng)動(dòng) 動(dòng)動(dòng) 腦腦二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作（一）樣品處理（一）樣品處理知識(shí)回憶知識(shí)回憶血液的組成血液的組成二、實(shí)驗(yàn)操作二

11、、實(shí)驗(yàn)操作1 1血液血液100mL3g3g檸檬酸鈉檸檬酸鈉低速離心低速離心2 min紅細(xì)胞紅細(xì)胞血血 漿漿吸出血漿吸出血漿5 5倍體積生理鹽水倍體積生理鹽水?dāng)嚢钄嚢?0min重復(fù)洗滌重復(fù)洗滌3 3次，次，直至上清液沒有黃色直至上清液沒有黃色 紅細(xì)胞紅細(xì)胞 （一）樣品處理（一）樣品處理初次離心初次離心3 3次洗滌后次洗滌后1 1、紅細(xì)胞的洗滌：、紅細(xì)胞的洗滌：( (1 1) ) 為什么要進(jìn)行紅細(xì)胞的洗滌，洗滌的目的是什么？為什么要進(jìn)行紅細(xì)胞的洗滌，洗滌的目的是什么？( (2 2) ) 怎樣洗滌紅細(xì)胞？能用蒸餾水代替生理鹽水嗎怎樣洗滌紅細(xì)胞？能用蒸餾水代替生理鹽水嗎? ?(3) (3) 紅細(xì)胞洗滌

12、干凈的標(biāo)志是什么紅細(xì)胞洗滌干凈的標(biāo)志是什么? ?直至上清液中無黃色直至上清液中無黃色，表明洗滌干凈。表明洗滌干凈。（一）樣品處理（一）樣品處理2 2、血紅蛋白的釋放：、血紅蛋白的釋放： ( (1 1) )怎樣讓紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來？怎樣讓紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來？ ( (2 2) )加入甲苯的目的是什么？加入甲苯的目的是什么？ (3) (3)加入甲苯后攪拌的目的是什么加入甲苯后攪拌的目的是什么? ? 加入加入蒸餾水和甲苯蒸餾水和甲苯, ,使紅細(xì)胞破裂使紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白，釋放出血紅蛋白加速細(xì)胞破裂加速細(xì)胞破裂點(diǎn)撥：點(diǎn)撥：細(xì)胞膜的主要成分是脂質(zhì)，易溶于甲苯等細(xì)胞膜的主要成分是脂質(zhì)

13、，易溶于甲苯等 有機(jī)溶劑中，加入甲苯可加速紅細(xì)胞的破裂有機(jī)溶劑中，加入甲苯可加速紅細(xì)胞的破裂溶解細(xì)胞膜溶解細(xì)胞膜（一）樣品處理（一）樣品處理紅細(xì)胞紅細(xì)胞破碎液破碎液高速離心高速離心10min 離心管離心管3 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液：出現(xiàn)分層出現(xiàn)分層2000r/min（一）樣品處理（一）樣品處理有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 無色透明的無色透明的甲苯層甲苯層脂類物質(zhì)脂類物質(zhì) 白色脂溶性白色脂溶性物質(zhì)物質(zhì)沉淀層沉淀層血紅蛋白溶液血紅蛋白溶液 紅色透明液體紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色沉淀物暗紅色沉淀物離心管離心管3 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液：（一）樣品處理

14、（一）樣品處理紅細(xì)胞紅細(xì)胞破碎液破碎液高速離心高速離心10min 離心管離心管濾紙濾紙過濾過濾燒杯燒杯3 3、分離血紅蛋白溶液：、分離血紅蛋白溶液：去除脂溶性沉淀層去除脂溶性沉淀層出現(xiàn)分層出現(xiàn)分層分液漏斗中靜置片分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的刻后，分出下層的紅色透明液體紅色透明液體2000r/min（一）樣品處理（一）樣品處理透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。取取1ml1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，（除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)）（除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)）二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作（二）粗提?。ǘ┐痔?/p>

15、取透析透析 將透析袋放將透析袋放入盛有入盛有300ml300ml的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l20mmol/l的磷酸緩的磷酸緩沖液中（沖液中（pHpH為為7.07.0），透析，透析1212小時(shí)。小時(shí)。（二）粗提取（二）粗提取透析透析二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作閱讀教材相關(guān)部分內(nèi)容，回答：閱讀教材相關(guān)部分內(nèi)容，回答：1.1.凝膠色譜操作分為哪幾個(gè)步驟？凝膠色譜操作分為哪幾個(gè)步驟？凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填樣品的加入和洗脫樣品的加入和洗脫（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法將分子量較大的將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去雜

16、質(zhì)蛋白質(zhì)除去二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作1 1、凝膠色譜柱的制作：、凝膠色譜柱的制作：取長取長4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，兩兩 端需用砂紙磨平。端需用砂紙磨平。（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆蓋覆蓋尼龍網(wǎng)，再用尼龍網(wǎng)，再用100100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作1 1、凝膠色譜柱的制作：、凝膠色譜柱的制作：（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法指篩網(wǎng)在指篩網(wǎng)在1 1英寸線段英寸線段內(nèi)的孔數(shù)為內(nèi)的孔數(shù)為10010

17、0二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作1 1、凝膠色譜柱的制作：、凝膠色譜柱的制作：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作1 1、凝膠色譜柱的制作：、凝膠色譜柱的制作：頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作1 1、凝膠色譜柱的制作：、凝膠色譜柱的制作：（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色

18、譜法組裝：組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。+2 2、凝膠色譜柱的裝填：、凝膠色譜柱的裝填：材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠顆粒材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠顆粒G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液裝填裝填: :步驟步驟操作要求操作要求根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量根據(jù)色譜柱體積計(jì)算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上色譜柱垂直固定在支架上計(jì)算稱量凝膠計(jì)算稱量凝膠固定色譜柱固定色譜柱“G”“G”表示凝膠的交聯(lián)表示凝膠的交聯(lián)程度程度。7575表示凝膠的表示凝膠的得水值，即每克凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？恕６?、實(shí)驗(yàn)操作二、

19、實(shí)驗(yàn)操作（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法配制懸浮液配制懸浮液裝填懸浮液裝填懸浮液或者凝膠顆粒洗脫液或者凝膠顆粒洗脫液沸水浴沸水浴 凝膠顆粒蒸餾水凝膠顆粒蒸餾水充分溶脹充分溶脹一次性緩慢倒入；輕輕敲動(dòng)一次性緩慢倒入；輕輕敲動(dòng)色譜柱，色譜柱，使凝膠填裝均勻。使凝膠填裝均勻。商品凝膠凝膠是干燥的顆粒顆?？芍苯釉谙疵撘合疵撘褐信蛎?。為了加速膨脹，可在沸水浴沸水浴使其快速膨脹 2 2、凝膠色譜柱的裝填：、凝膠色譜柱的裝填：二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法步驟步驟操作要求操作要求洗滌平衡洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌立刻用磷酸緩沖液洗滌12h，使凝膠裝填緊密使凝膠裝填緊密。3 3、樣品加入與洗脫：、樣品加入與洗脫：二、實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)操作（三）純化（三）純化-凝膠色譜法凝膠色譜法 調(diào)節(jié)緩沖液面：調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：滴加透析樣品：吸管吸吸管吸1ml1ml樣品加到色譜柱的樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)頂端，滴加樣