生物樣品與樣品制備資料

1、第一節(jié)第一節(jié) 生物樣品的種類、采集、制備與貯存生物樣品的種類、采集、制備與貯存 一一. .生物樣品的種類、采集和制備生物樣品的種類、采集和制備 1.1.血液：血液：血漿、血清和全血血漿、血清和全血 1 1）血樣的采集）血樣的采集 A:A:藥物在血液中分布均勻后采樣藥物在血液中分布均勻后采樣 B:B:從靜脈、動(dòng)脈和心臟（動(dòng)物），常用的是靜脈采血從靜脈、動(dòng)脈和心臟（動(dòng)物），常用的是靜脈采血 C:1-5mlC:1-5ml，動(dòng)物，動(dòng)物 10min10min；可用物理和化學(xué)方法；可用物理和化學(xué)方法 刺激采集刺激采集 C:C:刺激法采集優(yōu)點(diǎn)刺激法采集優(yōu)點(diǎn) 縮短采集時(shí)間；減少縮短采集時(shí)間；減少pH pH （

2、7.07.0）范圍；藥）范圍；藥 物濃度個(gè)體差異小物濃度個(gè)體差異小 D:D:唾液樣品的制備唾液樣品的制備 放置分層后，放置分層后，3000r/min3000r/min離心離心10min,10min,取上取上 清作為藥物濃度測定樣品清作為藥物濃度測定樣品 E:E:唾液采集特點(diǎn)唾液采集特點(diǎn) 無痛、簡便、經(jīng)濟(jì)等成為無痛、簡便、經(jīng)濟(jì)等成為TDMTDM的研究熱點(diǎn)的研究熱點(diǎn) 4.4.組織組織 1 1）勻漿化法）勻漿化法 A:A:組織檢材中加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機(jī)中組織檢材中加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機(jī)中 勻漿，取上清液供萃取勻漿，取上清液供萃取 B:B:方法簡便，回收率低方法簡便，

3、回收率低 2 2）沉淀蛋白法）沉淀蛋白法 A:A:在組織勻漿中加入蛋白沉淀劑，取上清供萃取在組織勻漿中加入蛋白沉淀劑，取上清供萃取 B:B:方法簡便，回收率低方法簡便，回收率低 C:C:常被采用，加入蛋白后上清液清澈，不乳化，雜質(zhì)少常被采用，加入蛋白后上清液清澈，不乳化，雜質(zhì)少 3 3）酸堿水解法）酸堿水解法 A:A:組織勻漿中加酸或堿，水浴加熱，過濾或離心，上清萃取組織勻漿中加酸或堿，水浴加熱，過濾或離心，上清萃取 B:B:適合熱酸或熱堿穩(wěn)定的藥物適合熱酸或熱堿穩(wěn)定的藥物 4 4）酶水解法）酶水解法 A:A:在組織勻漿中加入酶和緩沖液，水浴，過濾或離心，取上清在組織勻漿中加入酶和緩沖液，水浴

4、，過濾或離心，取上清 液萃取液萃取 B:B:酶為蛋白水解酶的枯草菌溶素，可使組織溶解、藥物析出酶為蛋白水解酶的枯草菌溶素，可使組織溶解、藥物析出 C:C:優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 可顯著改善與蛋白結(jié)合緊密的藥物的回收率；無乳化可顯著改善與蛋白結(jié)合緊密的藥物的回收率；無乳化 化現(xiàn)象；可避免在酸和熱下藥物分解；采用化現(xiàn)象；可避免在酸和熱下藥物分解；采用HPLCHPLC法無需過多法無需過多 凈化凈化 5.5.頭發(fā)頭發(fā) A:A:用于體內(nèi)微量元素測定用于體內(nèi)微量元素測定 B:B:可用于用藥史的估計(jì)可用于用藥史的估計(jì) C:C:毒性藥物的檢測毒性藥物的檢測 6.6.其他體液其他體液 1 1）乳汁）乳汁 用市售的吸乳器，取乳

5、汁，用市售的吸乳器，取乳汁，3000r/min3000r/min離心，取上清離心，取上清 供萃取供萃取 2 2）精液）精液 近年有關(guān)精液中藥物濃度的報(bào)道，甚少。近年有關(guān)精液中藥物濃度的報(bào)道，甚少。 二二. .生物樣本的貯存處理生物樣本的貯存處理 1.1.冷藏與冷凍冷藏與冷凍 生物樣品量大，需要將其貯存。冷藏生物樣品量大，需要將其貯存。冷藏4 4C C，冷，冷 凍凍-20-20C C 1 1）血液和血清樣品）血液和血清樣品 采血后及時(shí)分離，不超采血后及時(shí)分離，不超2h2h，分離后冷藏，分離后冷藏 4 4C C或冷凍或冷凍-20-20C C 2 2）尿液樣品）尿液樣品 應(yīng)立即測定，不能，應(yīng)加防腐劑

6、后置冰箱冷藏應(yīng)立即測定，不能，應(yīng)加防腐劑后置冰箱冷藏 4 4C C或冷凍或冷凍-20-20C C 3 3）唾液樣品）唾液樣品 A:A:須測唾液須測唾液pHpH值時(shí)，應(yīng)取樣后立即測定值時(shí)，應(yīng)取樣后立即測定 B:B:冷凍的樣品，須解凍后測定，解凍的樣品應(yīng)一次性測完冷凍的樣品，須解凍后測定，解凍的樣品應(yīng)一次性測完 C:C:冷凍的樣品，須解凍后充分?jǐn)嚢?，測定冷凍的樣品，須解凍后充分?jǐn)嚢?，測定 2.2.去活法去活法 1 1）為防止采樣后酶對樣品成分進(jìn)一步分解，需要立即終止酶）為防止采樣后酶對樣品成分進(jìn)一步分解，需要立即終止酶 的活性的活性 2 2）常用的方法）常用的方法 A:A:液氮中快速冷凍液氮中快速

7、冷凍 B:B:微波照射樣品微波照射樣品 C:C:抗氧化劑抗氧化劑 D:D:酶活性阻斷劑（三氯醋酸）酶活性阻斷劑（三氯醋酸） E:E:勻漿和沉淀勻漿和沉淀 F:F:樣品煮沸樣品煮沸 第二節(jié)第二節(jié) 生物樣品的預(yù)處理和制備生物樣品的預(yù)處理和制備 一一 生物樣品預(yù)處理的目的生物樣品預(yù)處理的目的 1.1.使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，測定其總濃度使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，測定其總濃度 2.2.生物樣品成分復(fù)雜、干擾多、含量低。經(jīng)預(yù)處理達(dá)到純生物樣品成分復(fù)雜、干擾多、含量低。經(jīng)預(yù)處理達(dá)到純 化、富集等目的化、富集等目的 3.3.為了適應(yīng)和符合測定方法的靈敏度為了適應(yīng)和符合測定方法的靈敏度 A:

8、A:免疫分析法可不作預(yù)處理免疫分析法可不作預(yù)處理 B:B:紫外、熒光分析法樣品預(yù)處理十分必要紫外、熒光分析法樣品預(yù)處理十分必要 4.4.為了防止分析儀器的污染、劣化，提高靈敏度、準(zhǔn)為了防止分析儀器的污染、劣化，提高靈敏度、準(zhǔn) 確性、精密度和選擇性確性、精密度和選擇性 A:A:生物樣本中的脂肪、蛋白、不溶性顆粒等雜質(zhì)污染儀器生物樣本中的脂肪、蛋白、不溶性顆粒等雜質(zhì)污染儀器 B:B:生物樣本可根據(jù)儀器的不同而不同生物樣本可根據(jù)儀器的不同而不同 如如HPLCHPLC法法 二二. .樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問題樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問題 1.1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式藥物的理化性質(zhì)和存在形式 A:A:藥物的酸

9、堿性、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性藥物的酸堿性、未電離分子的親脂性、揮發(fā)性 B:B:藥物光譜性及官能團(tuán)藥物光譜性及官能團(tuán) C:C:藥物在體內(nèi)的存在形式及蛋白結(jié)合率藥物在體內(nèi)的存在形式及蛋白結(jié)合率 2.2.待測樣品的濃度范圍待測樣品的濃度范圍 A:A:生物樣本中藥物濃度個(gè)體差異大生物樣本中藥物濃度個(gè)體差異大 地高辛地高辛1-2ng/ml1-2ng/ml；水楊酸；水楊酸 鹽鹽20-10020-100gg/ml/ml。 B: B:濃度高的對樣品與處理要求低，低的要求高濃度高的對樣品與處理要求低，低的要求高 3.3.藥物測定的目藥物測定的目 A:A:急性中毒病例急性中毒病例 B:B:大部分的體內(nèi)藥物分析

10、，均需要進(jìn)行全面的樣品與處理研究大部分的體內(nèi)藥物分析，均需要進(jìn)行全面的樣品與處理研究 4.4.選用的生物樣本類型選用的生物樣本類型 A:A:血漿、血清出蛋白后處理血漿、血清出蛋白后處理 B:B:唾液通過離心除蛋白后萃取唾液通過離心除蛋白后萃取 C:C:尿液中的綴合物常用酸和酶法水解綴合物尿液中的綴合物常用酸和酶法水解綴合物 D:D:頭發(fā)需有機(jī)破壞頭發(fā)需有機(jī)破壞 三三. .生物樣品的預(yù)處理技術(shù)生物樣品的預(yù)處理技術(shù) A:A:有機(jī)破壞法有機(jī)破壞法 B:B:除蛋白法除蛋白法 C:C:分離、純化與濃集分離、純化與濃集 D:D:綴合物水解綴合物水解 E:E:化學(xué)衍生化法化學(xué)衍生化法 1.1.有機(jī)破壞法有機(jī)

11、破壞法 濕法破壞、干法破壞及氧瓶燃燒法濕法破壞、干法破壞及氧瓶燃燒法 1 1）濕法破壞）濕法破壞 A:A:硝酸硝酸- -高氯酸高氯酸 適于血、肝、尿液等破壞，測高價(jià)無機(jī)離子適于血、肝、尿液等破壞，測高價(jià)無機(jī)離子 B:B:電熱消化法電熱消化法 人發(fā)的消化人發(fā)的消化 C:C:電熱板消化法電熱板消化法 人發(fā)的消化人發(fā)的消化 D:D:烘箱消化法烘箱消化法 2 2）干法破壞）干法破壞 A:A:高溫電阻爐灰法高溫電阻爐灰法 人發(fā)的消化人發(fā)的消化 B:B:低溫等離子灰化法低溫等離子灰化法 人發(fā)的消化人發(fā)的消化 3 3）氧瓶燃燒法）氧瓶燃燒法 血樣和人發(fā)的消化血樣和人發(fā)的消化 2.2.去除蛋白去除蛋白 測定血

12、樣時(shí)首先除蛋白測定血樣時(shí)首先除蛋白 A:A:可是結(jié)合型藥物釋放出來可是結(jié)合型藥物釋放出來 B:B:減少提取過程中的發(fā)泡和乳化減少提取過程中的發(fā)泡和乳化 C:C:保護(hù)儀器的性能，延長使用期保護(hù)儀器的性能，延長使用期 1 1）溶劑除蛋白）溶劑除蛋白 A:A:加入與水相混溶的溶劑加入與水相混溶的溶劑 C:C:蛋白聚集，結(jié)合藥物釋放出蛋白聚集，結(jié)合藥物釋放出 D:D:血樣與溶劑體積比為血樣與溶劑體積比為1:31:3除除90%90% E:E:操作操作 混合、遙均、離心、吸上清混合、遙均、離心、吸上清 2 2）加入中性鹽）加入中性鹽 A:A:中性鹽能將蛋白水合的水置換出來，蛋白質(zhì)脫水而沉淀中性鹽能將蛋白水

13、合的水置換出來，蛋白質(zhì)脫水而沉淀 B:B:常用的鹽常用的鹽 飽和硫酸銨等飽和硫酸銨等 C:C:操作操作 1:21:2混合、離心、取上清，除混合、離心、取上清，除90%90%以上蛋白以上蛋白 3 3）加入強(qiáng)酸）加入強(qiáng)酸 A:A:加入強(qiáng)酸可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性的鹽加入強(qiáng)酸可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性的鹽 B:B:常用的酸常用的酸 10%10%三氯醋酸等三氯醋酸等 C:C:操作操作 1:0.61:0.6混合、離心、取上清，除混合、離心、取上清，除90%90%以上以上 D:D:血含酸不穩(wěn)定藥物不宜血含酸不穩(wěn)定藥物不宜 4 4）加入含鋅或銅鹽）加入含鋅或銅鹽 A:A:金屬離子和蛋白分子的的帶陰電荷的基

14、團(tuán)形成不溶沉淀金屬離子和蛋白分子的的帶陰電荷的基團(tuán)形成不溶沉淀 B:B:常用的鹽常用的鹽 ZnSOZnSO4 4-NaOH-NaOH等等 C:C:操作操作 1:1:（1-31-3）混合、離心、取上清，除）混合、離心、取上清，除90%90%以上蛋白以上蛋白 5 5）超濾法）超濾法 A:A:超濾膜為分離介質(zhì)的膜分離技術(shù)超濾膜為分離介質(zhì)的膜分離技術(shù) B:B:膜孔徑大小有區(qū)別膜孔徑大小有區(qū)別 6 6）其他方法）其他方法 A:A:酶水解法酶水解法 B:B:加熱法加熱法 3.3.分離、純化與濃集分離、純化與濃集 A:A:選擇性分離是相當(dāng)重要的，內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物、其他共存選擇性分離是相當(dāng)重要的，內(nèi)源性物質(zhì)

15、、代謝物、其他共存 藥物干擾分析結(jié)果藥物干擾分析結(jié)果 B:B:藥物處理分為兩部藥物處理分為兩部 樣品的前處理和處理后的測定樣品的前處理和處理后的測定 C:C:前處理前處理 出去介質(zhì)中雜質(zhì)提取出被測物，濃集被測物，達(dá)到出去介質(zhì)中雜質(zhì)提取出被測物，濃集被測物，達(dá)到 儀器要求的檢測限，提高專屬性儀器要求的檢測限，提高專屬性 D:D:有的分析儀器具備提取、純化、濃集、進(jìn)樣分析有的分析儀器具備提取、純化、濃集、進(jìn)樣分析 1 1）液）液- -液提取法液提取法 A:A:多數(shù)藥物親脂性的，雜質(zhì)是親水性，可用有機(jī)溶劑提取多數(shù)藥物親脂性的，雜質(zhì)是親水性，可用有機(jī)溶劑提取 B:B:選擇溶劑考慮選擇溶劑考慮 了解藥物

16、與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu) 對藥物未電離的分子可溶，電離分子不溶對藥物未電離的分子可溶，電離分子不溶 溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)濃集溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)濃集 與水不相混溶與水不相混溶 無毒，不易燃燒無毒，不易燃燒 不易形成乳化不易形成乳化 具有較高化學(xué)穩(wěn)定性和惰性具有較高化學(xué)穩(wěn)定性和惰性 不影響檢測不影響檢測 C:C:有機(jī)溶劑的體積有機(jī)溶劑的體積 樣品與提取溶劑體積比樣品與提取溶劑體積比1:1:（1-21-2） D:D:樣品溶液的樣品溶液的pHpH 堿性藥物最佳堿性藥物最佳pHpH要高于要高于pKpKa a1-21-2單位單位 酸性藥物最佳酸性藥物最佳pHpH要低于要低于pKpKa a1-

17、21-2單位單位 原則是酸性藥物在酸性，堿性藥物在堿性環(huán)境提取原則是酸性藥物在酸性，堿性藥物在堿性環(huán)境提取 待測藥物多為堿性的，內(nèi)源雜質(zhì)多為酸性的待測藥物多為堿性的，內(nèi)源雜質(zhì)多為酸性的 對空白血對空白血pH13pH13、7 7、2 2的的HPLCHPLC法研究法研究 E:E:如堿性藥物在堿性條件下不穩(wěn)定，在近中性如堿性藥物在堿性條件下不穩(wěn)定，在近中性pHpH提取提取 F:F:中性藥物在中性藥物在pH7pH7附近提取附近提取 G:G:一般只提取一次，有時(shí)需要多次提取和反復(fù)提取一般只提取一次，有時(shí)需要多次提取和反復(fù)提取 H:H:優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn) 藥物可與多數(shù)的內(nèi)源性物質(zhì)分離藥物可與多數(shù)的內(nèi)源性

18、物質(zhì)分離 有機(jī)溶劑可揮發(fā)達(dá)到濃集目的有機(jī)溶劑可揮發(fā)達(dá)到濃集目的 易產(chǎn)生乳化，降低回收率易產(chǎn)生乳化，降低回收率 2 2）固相萃?。ǎ┕滔噍腿。⊿PESPE）將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng) 含有藥物的生物樣品通過時(shí)，由于受到含有藥物的生物樣品通過時(shí)，由于受到“吸附吸附”或或“分配分配”或或 “離子交換離子交換”或其他親合力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在柱上，或其他親合力作用，藥物或雜質(zhì)被保留在柱上， 用適當(dāng)流動(dòng)向洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)流動(dòng)向洗脫藥物用適當(dāng)流動(dòng)向洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)流動(dòng)向洗脫藥物 A:A:兩種洗脫方式兩種洗脫方式 藥物比雜質(zhì)與固定相之間親和力強(qiáng)；雜質(zhì)比藥

19、藥物比雜質(zhì)與固定相之間親和力強(qiáng)；雜質(zhì)比藥 物與固定相之間親和力強(qiáng)物與固定相之間親和力強(qiáng) B:SPEB:SPE構(gòu)造構(gòu)造 C:SPEC:SPE固定相的選擇固定相的選擇 固定相與被測組分具有相似的極性固定相與被測組分具有相似的極性 沖洗時(shí)改用與被測組分極性相近似的溶劑沖洗時(shí)改用與被測組分極性相近似的溶劑 D:SPED:SPE的種類的種類 親脂型親脂型 大孔吸附樹脂；親脂性鍵合相硅膠大孔吸附樹脂；親脂性鍵合相硅膠 親水型親水型 硅膠；硅藻土；棉纖維硅膠；硅藻土；棉纖維 離子交換型離子交換型 E:E:親脂性鍵合相硅膠親脂性鍵合相硅膠 十八烷基鍵合相硅膠最常用；吸附非十八烷基鍵合相硅膠最常用；吸附非 極性

20、藥物，易于有機(jī)溶劑洗脫；常見商品極性藥物，易于有機(jī)溶劑洗脫；常見商品Sep-Pak CSep-Pak C1818 親脂性鍵合相硅膠親脂性鍵合相硅膠SPESPE的操作的操作 （1 1）甲醇濕潤小柱，活化填料）甲醇濕潤小柱，活化填料 （2 2）用水或緩沖鹽沖洗小柱）用水或緩沖鹽沖洗小柱 （3 3）加樣，樣品和小柱接觸，棄去廢液）加樣，樣品和小柱接觸，棄去廢液 （4 4）用水或緩沖液沖洗小柱）用水或緩沖液沖洗小柱 （5 5）選擇洗脫液洗脫，收集洗脫液）選擇洗脫液洗脫，收集洗脫液 （6 6）用洗脫液測定或濃集）用洗脫液測定或濃集 親脂性鍵合相硅膠親脂性鍵合相硅膠SPESPE注意注意 （1 1）體液樣品

21、可直接上樣，體積）體液樣品可直接上樣，體積0.1-2ml0.1-2ml，流速，流速1-2ml/min1-2ml/min （2 2）萃取堿性藥物其中殘存的羥基與藥物的靜電作用，甲醇）萃取堿性藥物其中殘存的羥基與藥物的靜電作用，甲醇 等很難洗脫，需加酸等等很難洗脫，需加酸等 （3 3）苯基、氰基柱有一定極性，極性藥物吸附力大，用極性）苯基、氰基柱有一定極性，極性藥物吸附力大，用極性 溶劑洗脫溶劑洗脫 親脂性鍵合相硅膠親脂性鍵合相硅膠SPESPE特點(diǎn)特點(diǎn) （1 1）方便、省時(shí)）方便、省時(shí) （2 2）洗脫溶劑量少）洗脫溶劑量少 （3 3）用多個(gè)柱同時(shí)萃取）用多個(gè)柱同時(shí)萃取 I:I:其他其他SPESPE

22、小柱小柱 （1 1）苯基硼酸鍵合硅膠）苯基硼酸鍵合硅膠 選擇性的萃取血漿中選擇性的萃取血漿中- -拮抗劑拮抗劑 （2 2）環(huán)糊精鍵合硅膠）環(huán)糊精鍵合硅膠 選擇性的萃取磺胺類選擇性的萃取磺胺類 （3 3）免疫親和固定相）免疫親和固定相 萃取生物大分子萃取生物大分子 G:G:離子交換樹脂離子交換樹脂 （1 1）弱酸性藥物）弱酸性藥物 中性或堿性下，用陰離子交換樹脂萃取，甲中性或堿性下，用陰離子交換樹脂萃取，甲 醇清洗，酸性溶液洗脫醇清洗，酸性溶液洗脫 （2 2）堿性藥物）堿性藥物 方法相反方法相反 （3 3）適合高極性，可電離的藥物，回收率）適合高極性，可電離的藥物，回收率90%90%以上以上 H

23、:H:親水型填料親水型填料 填料硅膠、硅藻土、棉纖維填料硅膠、硅藻土、棉纖維 （1 1）為分配作用）為分配作用 （2 2）萃?。┹腿?樣品加到柱上，分布到填料表面，用水不容的有極樣品加到柱上，分布到填料表面，用水不容的有極 相洗脫親脂性藥物相洗脫親脂性藥物 F:F:大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂 （1 1）具有較大的表面積，適于吸附較大的分子）具有較大的表面積，適于吸附較大的分子 （2 2）傳質(zhì)速度快，有不同的極性）傳質(zhì)速度快，有不同的極性 （3 3）使用前甲醇等除雜質(zhì)，有時(shí)需用酸或堿處理）使用前甲醇等除雜質(zhì)，有時(shí)需用酸或堿處理 3 3）萃取方法的選擇）萃取方法的選擇 （1 1）較親脂的藥物）較親脂

24、的藥物 A:A:溶劑提取溶劑提取 B:B:烷基鍵合硅膠烷基鍵合硅膠SPESPE提取提取 C:C:大孔樹脂大孔樹脂SPESPE提取提取 D:D:親水型填料親水型填料SPESPE提取提取 E:E:烷基鍵合硅膠烷基鍵合硅膠SPESPE提取最佳，堿性藥物選大孔樹脂提取最佳，堿性藥物選大孔樹脂SPESPE提取提取 （2 2）較親水具有酸堿性、可解離藥物）較親水具有酸堿性、可解離藥物 A:A:離子交換樹脂離子交換樹脂SPESPE小柱小柱 B:B:形成離子對絡(luò)合物形成離子對絡(luò)合物 （3 3）親水不能電離藥物）親水不能電離藥物 不易萃取，可用蛋白沉淀進(jìn)樣法不易萃取，可用蛋白沉淀進(jìn)樣法 4 4）各種萃取方法的比

25、較）各種萃取方法的比較 （1 1）SPESPE的比較的比較 A:A:離子交換離子交換SPESPE回收率及選擇性高回收率及選擇性高 B:B:親脂性鍵合硅膠親脂性鍵合硅膠SPESPE常用常用 （2 2）SPESPE與與LIELIE及沉淀蛋白法比較及沉淀蛋白法比較 A:SPEA:SPE萃取試劑與樣品接觸面大，短時(shí)間達(dá)有效萃取，自動(dòng)化萃取試劑與樣品接觸面大，短時(shí)間達(dá)有效萃取，自動(dòng)化 B:B:回收率及選擇性因藥而異，回收率及選擇性因藥而異，SPESPE與與LIELIE無區(qū)別無區(qū)別 C:C:蛋白沉淀法簡便、回收率高，濃度低時(shí)不使用蛋白沉淀法簡便、回收率高，濃度低時(shí)不使用 5 5）SPESPE優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)

26、（1 1）SPESPE優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) A:A:引入雜質(zhì)少引入雜質(zhì)少 B:B:避免乳化形成避免乳化形成 C:C:在優(yōu)化條件下有較高的回收率、重現(xiàn)性好在優(yōu)化條件下有較高的回收率、重現(xiàn)性好 D:D:可用少量樣本可用少量樣本 （2 2）SPESPE缺點(diǎn)缺點(diǎn) A:A:價(jià)格貴價(jià)格貴 B:B:技術(shù)要求高技術(shù)要求高 C:C:批與批之間有差異批與批之間有差異 3.3.自動(dòng)化自動(dòng)化SPESPE技術(shù)技術(shù) 1 1）自動(dòng)化自動(dòng)化SPESPE技術(shù)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) A:A:節(jié)約時(shí)間，工作效率高節(jié)約時(shí)間，工作效率高 B:B:減少操作誤差，提高準(zhǔn)確度和精密度減少操作誤差，提高準(zhǔn)確度和精密度 C:C:安全，避免與有毒物接觸安全，避免與

27、有毒物接觸 D:D:殘留物對測定影響殘留物對測定影響 E:E:采用連續(xù)進(jìn)樣時(shí)，要考慮測定物穩(wěn)定性采用連續(xù)進(jìn)樣時(shí)，要考慮測定物穩(wěn)定性 2 2）自動(dòng)化自動(dòng)化SPESPE設(shè)備設(shè)備 A:A:在線技術(shù)在線技術(shù) 限制性介質(zhì)填料；湍流色譜；在線固相萃取技術(shù)限制性介質(zhì)填料；湍流色譜；在線固相萃取技術(shù) B:B:獨(dú)立工作站獨(dú)立工作站 C:96C:96通道工作站通道工作站 3 3）自動(dòng)化自動(dòng)化SPESPE方法的建立方法的建立 A:A:柱預(yù)處理柱預(yù)處理 除去填料雜質(zhì)；填料溶劑化除去填料雜質(zhì)；填料溶劑化 B:B:加樣加樣 試樣溶劑強(qiáng)度不宜過高，反向萃取水或緩沖為溶劑，試樣溶劑強(qiáng)度不宜過高，反向萃取水或緩沖為溶劑， 可加

28、少量的有機(jī)溶劑可加少量的有機(jī)溶劑 C:C:除去干擾雜質(zhì)除去干擾雜質(zhì) 中等強(qiáng)度的清洗劑洗干擾物，反向萃取用中等強(qiáng)度的清洗劑洗干擾物，反向萃取用 水水- -有機(jī)溶劑（有機(jī)溶劑（95:595:5）, ,也可加少量緩沖液。也可加少量緩沖液。 D:D:分析物的洗脫和收集分析物的洗脫和收集 重要，用水重要，用水- -有機(jī)溶劑（有機(jī)溶劑（5:955:95）洗脫）洗脫 E:E:收集的樣直接進(jìn)樣，或濃集收集的樣直接進(jìn)樣，或濃集 4 4）其他）其他萃取技術(shù)萃取技術(shù) A:A:固相微萃取技術(shù)固相微萃取技術(shù) B:B:膜萃及位微透析技術(shù)取技術(shù)膜萃及位微透析技術(shù)取技術(shù) C:C:超臨界流體萃取技術(shù)超臨界流體萃取技術(shù) 4.4.

29、化學(xué)衍生化化學(xué)衍生化 1 1）光譜技術(shù)）光譜技術(shù) （1 1）紫外分光光度法）紫外分光光度法 紫外沒有吸收或吸收小的藥物紫外沒有吸收或吸收小的藥物 （2 2）熒光光度法）熒光光度法 不具天然熒光的藥物不具天然熒光的藥物 （3 3）色譜分析法）色譜分析法 極性大、揮發(fā)性低、熱不穩(wěn)定、檢測靈敏度極性大、揮發(fā)性低、熱不穩(wěn)定、檢測靈敏度 不夠不夠 A:GCA:GC法中的化學(xué)衍生化法法中的化學(xué)衍生化法 使極性藥物變成非極性的、易揮發(fā)使極性藥物變成非極性的、易揮發(fā) 法的藥物；增加藥物穩(wěn)定性；提高光學(xué)異構(gòu)體的分離能力法的藥物；增加藥物穩(wěn)定性；提高光學(xué)異構(gòu)體的分離能力 主要衍生化反應(yīng)主要衍生化反應(yīng) 硅烷化：硅烷

30、化：R-OHR-OH；R-COOHR-COOH；R-NH-RR-NH-R 等極性基團(tuán)藥物等極性基團(tuán)藥物 ?；乎；篟-OHR-OH；R-NHR-NH2 2；R-NH-RR-NH-R 等極性基團(tuán)藥物等極性基團(tuán)藥物 烷基化：烷基化：R-OHR-OH；R-COOHR-COOH；R-NH-RR-NH-R 等極性基團(tuán)藥物等極性基團(tuán)藥物 生成非對應(yīng)異構(gòu)體衍生化法：生成非對應(yīng)異構(gòu)體衍生化法：具有光學(xué)異構(gòu)體的藥具有光學(xué)異構(gòu)體的藥R R（- -）與）與 （+ +），），用不對稱試劑使其生成非對應(yīng)異構(gòu)體衍生物，用不對稱試劑使其生成非對應(yīng)異構(gòu)體衍生物，GCGC分析分析 B:HPLCB:HPLC法中的化學(xué)衍生化法法

31、中的化學(xué)衍生化法 使極性藥物變成非極性的、易揮使極性藥物變成非極性的、易揮 目的：目的：提高靈敏度；提高分離度提高靈敏度；提高分離度 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：條件嚴(yán)格；對某樣只生成一種衍生物，副產(chǎn)物不條件嚴(yán)格；對某樣只生成一種衍生物，副產(chǎn)物不 干擾測定；衍生試劑易得，通用性好干擾測定；衍生試劑易得，通用性好 種類：種類：柱前衍生；柱后后衍生柱前衍生；柱后后衍生 紫外衍生化反應(yīng)：紫外衍生化反應(yīng)：紫外無吸收或吸收系數(shù)小，衍生化后有紫外紫外無吸收或吸收系數(shù)小，衍生化后有紫外 吸收吸收 熒光衍生化反應(yīng)：熒光衍生化反應(yīng)：無熒光，衍生化后有熒光，提高靈敏度無熒光，衍生化后有熒光，提高靈敏度 電化學(xué)衍生化：電化

32、學(xué)衍生化：靈敏度高；選擇性強(qiáng)；有電化學(xué)活性藥物是靈敏度高；選擇性強(qiáng)；有電化學(xué)活性藥物是 指藥物與某些試劑反應(yīng)，生成電化學(xué)活性衍生物，電化學(xué)檢測指藥物與某些試劑反應(yīng)，生成電化學(xué)活性衍生物，電化學(xué)檢測 器檢測。帶有硝基的衍生化試劑與羥、氨、羧基等化合物反器檢測。帶有硝基的衍生化試劑與羥、氨、羧基等化合物反 應(yīng)可生成電化學(xué)活性衍生物應(yīng)可生成電化學(xué)活性衍生物 手性生化法：手性生化法：用手性衍生化試劑將藥物對映體轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的非用手性衍生化試劑將藥物對映體轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的非 對映異構(gòu)體，色譜檢測對映異構(gòu)體，色譜檢測 選擇該方法的原因：選擇該方法的原因：不宜直接拆分；添加基團(tuán)，增加色譜系統(tǒng)不宜直接拆分；添加基團(tuán)

33、，增加色譜系統(tǒng) 的對映異構(gòu)體的選擇性；提高紫外或熒光的檢測效果的對映異構(gòu)體的選擇性；提高紫外或熒光的檢測效果 滿足的條件：滿足的條件：溶質(zhì)分子至少有一個(gè)官能團(tuán)供衍生；手性衍生化溶質(zhì)分子至少有一個(gè)官能團(tuán)供衍生；手性衍生化 試劑達(dá)到對映體純；反應(yīng)條件溫和、簡便、完全；生成的非試劑達(dá)到對映體純；反應(yīng)條件溫和、簡便、完全；生成的非 對映異構(gòu)體應(yīng)易被裂解為原來的對映體對映異構(gòu)體應(yīng)易被裂解為原來的對映體 3.3.唾液唾液 唾藥濃度與血漿游離藥濃度相關(guān)，藥代動(dòng)力學(xué)唾藥濃度與血漿游離藥濃度相關(guān)，藥代動(dòng)力學(xué) A:A:唾液和唾液腺唾液和唾液腺 唾液由腮腺、舌下腺和頜下腺三腺體分泌唾液由腮腺、舌下腺和頜下腺三腺體分

34、泌 會(huì)集而成的，日分泌量約會(huì)集而成的，日分泌量約1.2L1.2L B: B:唾液的采集唾液的采集 漱口后漱口后15min15min，安靜情況下，用插入漏斗的試，安靜情況下，用插入漏斗的試 管接收自然流出的唾液，采集時(shí)間管接收自然流出的唾液，采集時(shí)間10min10min；可用物理和化學(xué)方法；可用物理和化學(xué)方法 刺激采集刺激采集 C:C:刺激法采集優(yōu)點(diǎn)刺激法采集優(yōu)點(diǎn) 縮短采集時(shí)間；減少縮短采集時(shí)間；減少pH pH （7.07.0）范圍；藥）范圍；藥 物濃度個(gè)體差異小物濃度個(gè)體差異小 D:D:唾液樣品的制備唾液樣品的制備 放置分層后，放置分層后，3000r/min3000r/min離心離心10min

35、,10min,取上取上 清作為藥物濃度測定樣品清作為藥物濃度測定樣品 E:E:唾液采集特點(diǎn)唾液采集特點(diǎn) 無痛、簡便、經(jīng)濟(jì)等成為無痛、簡便、經(jīng)濟(jì)等成為TDMTDM的研究熱點(diǎn)的研究熱點(diǎn) 二二. .生物樣本的貯存處理生物樣本的貯存處理 1.1.冷藏與冷凍冷藏與冷凍 生物樣品量大，需要將其貯存。冷藏生物樣品量大，需要將其貯存。冷藏4 4C C，冷，冷 凍凍-20-20C C 1 1）血液和血清樣品）血液和血清樣品 采血后及時(shí)分離，不超采血后及時(shí)分離，不超2h2h，分離后冷藏，分離后冷藏 4 4C C或冷凍或冷凍-20-20C C 2 2）尿液樣品）尿液樣品 應(yīng)立即測定，不能，應(yīng)加防腐劑后置冰箱冷藏應(yīng)立

36、即測定，不能，應(yīng)加防腐劑后置冰箱冷藏 4 4C C或冷凍或冷凍-20-20C C 3 3）唾液樣品）唾液樣品 A:A:須測唾液須測唾液pHpH值時(shí)，應(yīng)取樣后立即測定值時(shí)，應(yīng)取樣后立即測定 B:B:冷凍的樣品，須解凍后測定，解凍的樣品應(yīng)一次性測完冷凍的樣品，須解凍后測定，解凍的樣品應(yīng)一次性測完 C:C:冷凍的樣品，須解凍后充分?jǐn)嚢瑁瑴y定冷凍的樣品，須解凍后充分?jǐn)嚢?，測定 第二節(jié)第二節(jié) 生物樣品的預(yù)處理和制備生物樣品的預(yù)處理和制備 一一 生物樣品預(yù)處理的目的生物樣品預(yù)處理的目的 1.1.使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，測定其總濃度使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，測定其總濃度 2.2.生物樣品成分復(fù)雜、干擾多、含量低。經(jīng)預(yù)處理達(dá)到純生物樣品成分復(fù)雜、干擾多、含量低。經(jīng)預(yù)處理達(dá)到純 化、富集等目的化、富集等目的 3.3.為了適應(yīng)和符合測定方法的靈敏度為了適應(yīng)和符合測定方法的靈敏度 A:A:免疫分析法可不作預(yù)處理免疫分析法可不作預(yù)處理 B:B:紫外、熒光分析法樣品預(yù)處理十分必要紫外、熒光分析法樣品預(yù)處理十分必要 2 2）固相萃?。ǎ┕滔噍腿。⊿PESPE）將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)將不同填料作為固定相裝入微型小柱，