PCR方法快速檢驗HBV

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗論文pcr方法快速檢驗hbv 2006年12月29日pcr方法快速檢驗hbv日期：2006-12-29 作者： 劉曉林 王遠賀 王瑞靜 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院04級六班【摘要】乙型肝炎的預(yù)防、檢測和治療變的尤為重要。模板dna的變性：模板dna與引物的退火(復(fù)性)：引物的延伸：標準的pcr反應(yīng)體系：本次實驗的pcr反應(yīng)體系：本次實驗的pcr反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：標號“7”的陽性標本一份。標號“8”“9”的待測標本各一份（由老師提供的待檢人員的血清dna提取液）。標號“”的陰性標本一份在實驗中，一大部分的工作是微量試劑的滴加，這要求我們有過硬的動手能力?！娟P(guān)鍵詞】 pcr hbv 乙型肝炎 快速

2、檢測一、前言乙型肝炎病毒（hbv）是乙型肝炎的病原體，主要經(jīng)輸血、注射、性行為和母嬰傳播。本病起病緩慢，部分患者可轉(zhuǎn)為慢性，少數(shù)可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。據(jù)估計全世界hbsag攜帶者約3.5億，其中我國約1.2億人，包括中國在內(nèi)的東南亞、非洲等國際為hbv感染的高流行區(qū)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ,pcr)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一dna片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中

3、擴增出足量的dna供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用pcr幾小時便可完成。pcr技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。但是由于pcr技術(shù)的高度靈敏性，使得實驗中易出現(xiàn)假陽性的情況，影響了pcr應(yīng)用的可信度。對乙型肝炎進行實驗室診斷，最常采用血清學(xué)方法檢測患者血清hbv標志物，而血清hbv dna是hbv感染、復(fù)制、血液有傳染性的直接標志，所以近年常采用pcr技術(shù)對乙型肝炎進行研究和診斷。二、實驗?zāi)康暮鸵饬x乙型肝炎級大的威脅著現(xiàn)代人的餓生命，影響著人們的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為全世界人們的公敵。所以乙型肝炎的預(yù)防、檢測和治療變的尤為重要。本次實驗，我們應(yīng)用技術(shù)方面比較成熟、

4、易操作的pcr技術(shù)，通過擴贈hbv dna來檢測hbv的存在性，從而檢測待測血清中是否含有hbv，待測人員是否為乙肝患者或乙型肝炎的攜帶者。通過這次實驗，我們應(yīng)該清楚當(dāng)前hbv檢測的常用方法，著重掌握pcr技術(shù)在檢驗乙肝病毒中的應(yīng)用。通過實驗，加強自身對乙肝的認識，正確對待乙肝患者和攜帶者，做好自身的預(yù)防工作。三、實驗原理【pcr技術(shù)的基本原理】類似于dna的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板dna的變性：模板dna經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引

5、物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板dna與引物的退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板dna單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：dna模板-引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍?！緲藴实膒cr反應(yīng)體系】： 10擴增緩沖液 10ul 4種dntp混合物 各200umol/l 引物 各10

6、100pmol 模板dna 0.12ug taq dna聚合酶 2.5u mg2+ 1.5mmol/l 加雙或三蒸水至 100ul本次實驗的pcr反應(yīng)體系：試劑名稱試劑量終濃度10xbuffer3.0l1xbuffer10xdntp3.0l0.2m25mm mgcl21.8l1.5mmprimer10.6l0.5mprimer20.6l0.5mdna template2.0l1.0ngtaq dna polymerase0.3l1.5upure ddh2o18.7l 合計30.0l本次實驗的pcr反應(yīng)循環(huán)參數(shù)： 94 5min 94 1min 3 1min 30個循環(huán) 72 1min 72 1

7、0min四、實驗準備【實驗材料】引物：5tgacaagaatcctcacaata3 5agccctacgaaccactgaac3pureddh2o 10xbuffer 10xdntp 25mmmgcl2 taqdna聚合酶 溴酚藍 溴化乙錠 tbe緩沖液 瓊脂糖 標號“7”的陽性標本一份標號“8”“9”的待測標本各一份（由老師提供的待檢人員的血清dna提取液）標號“”的陰性標本一份【實驗儀器】pcr擴贈儀 水平式電泳槽 紫外透射儀 凝膠成像分析儀 微量加樣器等五、實驗步驟1、取一支eppendorf管，按如下順序和計量，依次加入。 pure ddh2o 112.2l 10xbuffer 18l

8、 10xdntp 18l 25mm mgcl2 10.8l primer1 3.6l primer2 3.6l taq dna聚合酶 1.8l2、另取5支eppendorf管，分別表識“7” “8” “9” “一” “水”。從1號管中依次取出28.0l的混合液，分別加入五個管中。 然后按下表順序，向5管依次加入： 7號標本（陽性） 2ul 8號標本（待測） 2ul 9號標本（待測） 2ul “一”對照標本 2ul h2o（空白對照） 2ul 3、 將5支eppendorf管放入pcr擴增儀中進行擴增 4、 配制1.2%的瓊脂糖凝膠，注入水平式電泳槽中，冷卻成膠。5、依次從五個eppendorf

9、管中取出擴增后的液體，以5：1的比例與溴酚藍混合，依次加入凝膠孔中。 另一孔中加入mark6、近凝膠孔側(cè)接“”極，對側(cè)接“+”極，電壓80v,電泳30分鐘.7、取出凝膠,在紫外燈下觀察結(jié)果.六、實驗結(jié)果【圖像】從右到左，結(jié)果如下7號管（陽性）8號管（待測）9號管（待測）9號管（待測）陰性對照陰性對照空白對照mark陽性陽性陽性陽性陰性陰性陰性【結(jié)果分析】 8、9號標本為陽性標本。標本提供者為乙型肝炎患者或攜帶者。七、實驗總結(jié)【實驗內(nèi)容總結(jié)】 1、pcr的靈敏度極高，在操作中應(yīng)盡量避免。尤其實在向eppendorf管加試劑時，更應(yīng)格外小心，防止污染。 2、當(dāng)向每支eppendorf管中加的試劑量

10、十分少時，為避免誤差，可各管中相同的材料加在一起，在等份分開。 3、溴乙錠有毒，應(yīng)戴手套，實驗中注意保護自己。 4、由于是第一次的獨立實驗，實驗中對許多先進的儀器不了解，如紫外投射儀、凝膠成像分析儀，給實驗結(jié)果的記錄帶來了麻煩?！緦嶒炚w總結(jié)】 1、實驗準備不足 雖然我們在實驗前以為自己的準備工作已經(jīng)做的相當(dāng)充分了，在實驗過程中仍出了各種問題，對一些必要步驟的不清楚。 2、動手能力仍需加強 在實驗中，一大部分的工作是微量試劑的滴加，這要求我們有過硬的動手能力。但我們還是出現(xiàn)了滴加不完美的情況，只能有重復(fù)滴加做彌補。 3、自信心得到加強 這是我們大學(xué)期間的第一次的自主實驗，從查資料、確立實驗方法到實驗的具體實施，均由我們自己完成，最后實驗成功結(jié)束，我們對自己的能力有了更客觀的認識，今后的實驗中，更自信了！ 參考文獻：1、彭易紅.乙型