細胞工程課件二--實驗室教學(xué)資料

1、清洗滅菌室：本間不要求無菌環(huán)境。清洗滅菌室：本間不要求無菌環(huán)境。 容容器具洗滌滅菌器具洗滌滅菌,培養(yǎng)用液配制等培養(yǎng)用液配制等.主要大型主要大型儀器有高壓蒸汽滅菌鍋儀器有高壓蒸汽滅菌鍋,電熱干燥箱電熱干燥箱、蒸蒸餾水處理器、餾水處理器、酸缸、酸缸、冰箱等冰箱等. 制備室：培養(yǎng)基及有關(guān)培養(yǎng)用試劑的制備。制備室：培養(yǎng)基及有關(guān)培養(yǎng)用試劑的制備。 需要相對無菌的操作，尤其是制備培養(yǎng)基用需要相對無菌的操作，尤其是制備培養(yǎng)基用的水必須無菌；所用器材盡量作到無菌要的水必須無菌；所用器材盡量作到無菌要求。通常用到的器材有天平、磁力攪拌器、求。通常用到的器材有天平、磁力攪拌器、pH計等。配制好的培養(yǎng)液通常需要在無

2、菌計等。配制好的培養(yǎng)液通常需要在無菌操作臺內(nèi)過濾除菌并進行分裝。注意分裝操作臺內(nèi)過濾除菌并進行分裝。注意分裝非常重要。非常重要。儲藏室：儲藏室的基本要求是材料的取儲藏室：儲藏室的基本要求是材料的取放方便、清潔無塵。主要的器材：冰放方便、清潔無塵。主要的器材：冰箱（常用及超低溫）、液氮罐、儲物箱（常用及超低溫）、液氮罐、儲物柜等。柜等。培養(yǎng)室培養(yǎng)室 ：是細胞培養(yǎng)實驗中對無菌操作最為：是細胞培養(yǎng)實驗中對無菌操作最為嚴格的一個環(huán)節(jié)。無菌操作室是相對密封、嚴格的一個環(huán)節(jié)。無菌操作室是相對密封、防塵、防菌的工作間，在結(jié)構(gòu)和消毒方面防塵、防菌的工作間，在結(jié)構(gòu)和消毒方面有其基本要求。應(yīng)包括更衣間、緩沖間、有

3、其基本要求。應(yīng)包括更衣間、緩沖間、操作間。操作間。細胞學(xué)鑒定室（分析室）：對培養(yǎng)物的觀察分細胞學(xué)鑒定室（分析室）：對培養(yǎng)物的觀察分析和培養(yǎng)物計數(shù)等。一般設(shè)在培養(yǎng)室的隔壁。析和培養(yǎng)物計數(shù)等。一般設(shè)在培養(yǎng)室的隔壁。 對無菌沒有無菌操作間嚴格，但同樣需要防對無菌沒有無菌操作間嚴格，但同樣需要防塵以及相對無菌的清潔環(huán)境。放置顯微鏡、塵以及相對無菌的清潔環(huán)境。放置顯微鏡、打印機及其它分析設(shè)備等。打印機及其它分析設(shè)備等。 細胞培養(yǎng)實驗室細胞培養(yǎng)實驗室1.準備室準備室2.緩沖室緩沖室 準備室風(fēng)淋3.培養(yǎng)室培養(yǎng)室動物細胞工程的實驗室設(shè)置制備存儲、觀察和培養(yǎng)室制備存儲、觀察和培養(yǎng)室清洗、消毒室清洗、消毒室無菌操

4、作無菌操作室室內(nèi)內(nèi)外外常用的儀器設(shè)備常用的儀器設(shè)備:倒置顯微鏡倒置顯微鏡 超凈工作臺超凈工作臺CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱 冰箱冰箱 細胞計數(shù)板細胞計數(shù)板離心機離心機 細胞冷凍儲存器細胞冷凍儲存器 壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器 電熱干燥器箱電熱干燥器箱 過濾除菌裝置過濾除菌裝置 純水儀純水儀超凈工作臺超凈工作臺 側(cè)流式側(cè)流式(或稱垂直式或稱垂直式)外流式外流式(或稱水平層流式或稱水平層流式)外流式超凈工作臺外流式超凈工作臺 n二氧化碳培養(yǎng)箱通過對周圍環(huán)境條件的控二氧化碳培養(yǎng)箱通過對周圍環(huán)境條件的控制制造出一個能使細胞制制造出一個能使細胞/組織更好地生長的組織更好地生長的環(huán)境，條件控制的結(jié)果就會形成一個穩(wěn)

5、定環(huán)境，條件控制的結(jié)果就會形成一個穩(wěn)定的條件：如的條件：如恒定的酸堿度（恒定的酸堿度（pH值：值：7.2-7.4）、穩(wěn)定的溫度（）、穩(wěn)定的溫度（37C）、較高的相）、較高的相對濕度（對濕度（95）、穩(wěn)定的）、穩(wěn)定的CO2水平水平（5%）。）。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱n使用使用CO2CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒。箱內(nèi)水槽中：滅菌蒸餾水箱內(nèi)水槽中：滅菌蒸餾水30003000毫升以保持箱毫升以保持箱內(nèi)濕度，避兔培

6、養(yǎng)液蒸發(fā)。內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱倒置顯微鏡倒置顯微鏡液氮容器液氮容器電熱干燥器箱電熱干燥器箱 純水儀純水儀n培養(yǎng)用器皿培養(yǎng)用器皿n培養(yǎng)器皿：供細胞接種、生長等用的器皿，可由培養(yǎng)器皿：供細胞接種、生長等用的器皿，可由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃或無毒而透明光透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成?；奶刂扑芰现瞥伞培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培培養(yǎng)器皿包括各種規(guī)格的玻璃、塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，吸管，離心管等。養(yǎng)皿，吸管，離心管等。 l培養(yǎng)瓶：由玻璃或塑料制成，主要用于培養(yǎng)、繁殖細胞。國培養(yǎng)瓶：由玻璃或塑料制成，主要用于培養(yǎng)、繁殖細胞。國產(chǎn)培養(yǎng)瓶

7、的規(guī)格常以容量表示，如：產(chǎn)培養(yǎng)瓶的規(guī)格常以容量表示，如：250ml、100ml、25ml等；進口培養(yǎng)瓶則多以底面積（等；進口培養(yǎng)瓶則多以底面積（cm2）表示。）表示。l培養(yǎng)皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分離、處理組織或作培養(yǎng)皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分離、處理組織或作細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞增殖細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞增殖等實驗使用。等實驗使用。分直徑分直徑30mm、60mm、120mm等。等。l多孔培養(yǎng)板：可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。多孔培養(yǎng)板：可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。其優(yōu)點是節(jié)約樣本及試劑，可同時測試大量樣

8、本。常用的有：其優(yōu)點是節(jié)約樣本及試劑，可同時測試大量樣本。常用的有：96孔、孔、24孔、孔、12孔、孔、6孔、孔、4孔等孔等。n液體儲存瓶：主要用于存放或配制各種培養(yǎng)用液體如培養(yǎng)液、液體儲存瓶：主要用于存放或配制各種培養(yǎng)用液體如培養(yǎng)液、血清及試劑等。常用規(guī)格有血清及試劑等。常用規(guī)格有500ml、250mln吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。刻度吸管用于移動液體。常用刻度吸管用于移動液體。常用1ml 和和10ml 兩種。短吸管也叫兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種滴管，分彎頭和直頭兩種 ，除可作吸取、轉(zhuǎn)移液體外，彎頭尖

9、，除可作吸取、轉(zhuǎn)移液體外，彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻傳代細胞吸管還常用于吹打、混勻傳代細胞n加樣器：用于吸取、移動液體或滴加樣本。常用微量加樣器，加樣器：用于吸取、移動液體或滴加樣本。常用微量加樣器，可保證實驗樣品含量精確，重復(fù)性良好?？杀ＷC實驗樣品含量精確，重復(fù)性良好。n離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和同形態(tài)各樣，常用于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者；后者則多為則

10、多為10ml 和和5ml。 n其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等 n其它用品其它用品 尚有放置試劑或臨時插置吸管用的試管，裝放吸管以便消尚有放置試劑或臨時插置吸管用的試管，裝放吸管以便消毒的大玻璃筒，用于存放小件培養(yǎng)物品便于高壓消毒的毒的大玻璃筒，用于存放小件培養(yǎng)物品便于高壓消毒的鋁飯盒或貯槽，套于吸管頂部的橡皮吸頭，封閉各種瓶、鋁飯盒或貯槽，套于吸管頂部的橡皮吸頭，封閉各種瓶、管的膠塞、蓋子，凍存細胞用的安瓿或凍存管，不同規(guī)管的膠塞、蓋子，凍存細胞用的安瓿或凍存管，不同規(guī)格的注射器，燒杯和量筒以及漏斗等。格的注射器，燒杯和量筒以及漏斗等。

11、n器械培養(yǎng)板培養(yǎng)瓶二、器材的清洗與消毒二、器材的清洗與消毒n清洗清洗的主要目的是消除接觸細胞的器皿上表面的雜質(zhì)和微的主要目的是消除接觸細胞的器皿上表面的雜質(zhì)和微生物等成分。清洗完畢后的器皿在消毒之前必須進行嚴密生物等成分。清洗完畢后的器皿在消毒之前必須進行嚴密包裝，以便消毒及存儲，防止灰塵及消毒后再次被污染。包裝，以便消毒及存儲，防止灰塵及消毒后再次被污染。n消毒消毒-嚴格的消毒，包括器皿和培養(yǎng)基是必須的。嚴格的消毒，包括器皿和培養(yǎng)基是必須的。n超凈臺和無菌間的大面積消毒主要通過紫外燈；玻璃器皿、超凈臺和無菌間的大面積消毒主要通過紫外燈；玻璃器皿、濾器、膠塞、解剖用具、塑料槍頭等多通過高壓蒸汽

12、滅菌；濾器、膠塞、解剖用具、塑料槍頭等多通過高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)基因為其中含有不耐熱成分，所以多通過過濾除菌，培養(yǎng)基因為其中含有不耐熱成分，所以多通過過濾除菌，器皿的入口、移液器、操作者的手套等多為化學(xué)消毒。器皿的入口、移液器、操作者的手套等多為化學(xué)消毒。1、玻璃器皿的清洗與消毒、玻璃器皿的清洗與消毒n浸泡浸泡-自來水浸泡、自來水浸泡、5%鹽酸過夜鹽酸過夜。（細胞培養(yǎng)用過的玻璃。（細胞培養(yǎng)用過的玻璃瓶要立即浸泡到自來水中，防止干涸）。瓶要立即浸泡到自來水中，防止干涸）。n洗刷洗刷-浸泡過的玻璃瓶，用軟毛刷在洗衣粉中洗刷，不要留浸泡過的玻璃瓶，用軟毛刷在洗衣粉中洗刷，不要留下死角。下死角。n干燥干

13、燥n浸酸浸酸：通常用重鉻酸鉀：通常用重鉻酸鉀/濃硫酸濃硫酸/水以水以12：20：100（g:ml:ml）配制成酸洗液。洗刷過的玻璃器皿在其中浸泡）配制成酸洗液。洗刷過的玻璃器皿在其中浸泡過夜。過夜。n沖洗沖洗：自動洗滌裝置沖洗或手工操作：自動洗滌裝置沖洗或手工操作n倒置于防塵箱中涼干，牛皮紙包裝，高壓滅菌，倒置于防塵箱中涼干，牛皮紙包裝，高壓滅菌，50-70烘烘干備用干備用n清潔液可根據(jù)需要清潔液可根據(jù)需要,配制成不同的強度配制成不同的強度,常用的下列三種常用的下列三種: 重鉻酸鉀重鉻酸鉀(g) :濃硫酸濃硫酸(ml): 蒸餾水蒸餾水(ml) (A)強清潔液強清潔液 63:1000:200(B

14、)次強清洗液次強清洗液 120:200:1000 (C)弱清潔液弱清潔液 100:100:100. 清潔液配制時應(yīng)注意安全清潔液配制時應(yīng)注意安全,須穿戴耐酸手套和圍裙須穿戴耐酸手套和圍裙,并要保護好并要保護好面部及身體裸露部分面部及身體裸露部分.配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中,然后然后慢慢加濃硫酸慢慢加濃硫酸.并不停的用玻璃棒攪拌并不停的用玻璃棒攪拌,使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)使產(chǎn)生的熱量揮發(fā), 配配制溶液應(yīng)選擇塑料制品制溶液應(yīng)選擇塑料制品.配成后清潔液一般為棕紅色配成后清潔液一般為棕紅色. 2、膠塞的清洗與消毒、膠塞的清洗與消毒n新膠塞應(yīng)先在自來水中沖洗。新膠塞應(yīng)先在自來

15、水中沖洗。2%NaOH煮沸煮沸20min。自來水沖洗，。自來水沖洗，1%HCl浸泡浸泡20min，蒸，蒸餾水沖洗后涼干，牛皮紙包裝高壓滅菌（餾水沖洗后涼干，牛皮紙包裝高壓滅菌（115 10-15min），），50-70烘干備用。烘干備用。3、塑料器皿的清洗、塑料器皿的清洗n組織培養(yǎng)使用的塑料器皿主要有培養(yǎng)板、離心管及組織培養(yǎng)使用的塑料器皿主要有培養(yǎng)板、離心管及培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品多為一次性商品。培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品多為一次性商品。n若需重復(fù)使用，器皿經(jīng)沖洗干凈后，晾干，若需重復(fù)使用，器皿經(jīng)沖洗干凈后，晾干，2%NaOH浸泡過夜，自來水沖洗，浸泡過夜，自來水沖洗，5%鹽酸浸泡鹽酸浸泡30min，流水

16、徹底沖洗，蒸餾水漂洗，流水徹底沖洗，蒸餾水漂洗 n槍頭：裝盒后，包裝高壓滅菌，槍頭：裝盒后，包裝高壓滅菌，50-70烘干備用。烘干備用。4、不銹鋼濾器的清洗與消毒、不銹鋼濾器的清洗與消毒n自來水沖洗自來水沖洗30min，三蒸水沖洗，浸，三蒸水沖洗，浸泡過夜，防塵箱中涼干，錫箔包裝后泡過夜，防塵箱中涼干，錫箔包裝后再牛皮紙包裝，高壓滅菌，再牛皮紙包裝，高壓滅菌，50-70烘干備用。烘干備用。5、金屬器材、金屬器材n金屬器皿不能泡酸，洗滌時可先用洗金屬器皿不能泡酸，洗滌時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用用75酒精擦拭，再用自來水，然后酒精擦拭，再用自來水，

17、然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅磅高壓消毒，再烘干備用。高壓消毒，再烘干備用。 體外培養(yǎng)細胞無抗感染的能力，所以防止污染體外培養(yǎng)細胞無抗感染的能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件。為做到防是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件。為做到防止污染，要求實驗者在培養(yǎng)工作的每一個環(huán)止污染，要求實驗者在培養(yǎng)工作的每一個環(huán)節(jié)都必須做到最大限度的無菌。節(jié)都必須做到最大限度的無菌。三、動物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、動物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)-無菌操作無菌操作1、實驗前的準備、實驗前的準備-培養(yǎng)用品的消毒培養(yǎng)用品的消毒

18、-實驗器具實驗器具-參照前面說明參照前面說明。n根據(jù)所要進行的具體培養(yǎng)對象如組織塊貼壁原代培養(yǎng)、根據(jù)所要進行的具體培養(yǎng)對象如組織塊貼壁原代培養(yǎng)、血白細胞培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等，準備培養(yǎng)所需器械和物品，血白細胞培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等，準備培養(yǎng)所需器械和物品，清點無誤后進行清洗、包裝和消毒滅菌。清點無誤后進行清洗、包裝和消毒滅菌。-培養(yǎng)室的消毒培養(yǎng)室的消毒n培養(yǎng)室每天用培養(yǎng)室每天用0.2%的新潔爾滅或的新潔爾滅或2%5%的來蘇兒的來蘇兒拖洗地面一次（拖布專用），拖洗地面一次（拖布專用），30瓦紫外燈管照射消毒瓦紫外燈管照射消毒2030分鐘。分鐘。-超凈工作臺的消毒超凈工作臺的消毒n超凈工作臺臺面每次實驗前用超

19、凈工作臺臺面每次實驗前用75%酒精擦洗，然后紫酒精擦洗，然后紫外線消毒外線消毒30分鐘。分鐘。2、 洗手和著裝洗手和著裝n利用超凈工作臺進行培養(yǎng)時，在培養(yǎng)前利用超凈工作臺進行培養(yǎng)時，在培養(yǎng)前換上培養(yǎng)室專用的工作服和拖鞋，清洗換上培養(yǎng)室專用的工作服和拖鞋，清洗雙手，雙手，n然后用然后用75%酒精棉球擦洗雙手。酒精棉球擦洗雙手。n平時觀察細胞可以用經(jīng)紫外照射的工作平時觀察細胞可以用經(jīng)紫外照射的工作服。服。3、無菌培養(yǎng)操作、無菌培養(yǎng)操作-為保證無菌，除實驗所需物品需預(yù)先消毒外，實驗中還需保為保證無菌，除實驗所需物品需預(yù)先消毒外，實驗中還需保持無菌操作，操作幅度盡可能小。持無菌操作，操作幅度盡可能小。

20、-工作臺面上的用品要布局合理，品擺放應(yīng)該有規(guī)律，酒精燈工作臺面上的用品要布局合理，品擺放應(yīng)該有規(guī)律，酒精燈在中間，原則上是右手使用的東西置右側(cè)，左手使用的東西置在中間，原則上是右手使用的東西置右側(cè)，左手使用的東西置左側(cè)，酒精燈置中央；實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進左側(cè)，酒精燈置中央；實驗操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進行。行。-實驗前點燃酒精燈，一切操作如安裝吸管帽、打開或封閉瓶實驗前點燃酒精燈，一切操作如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行?？诘龋紤?yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。n注意：注意：（1）燒過的器械要冷卻后才能使用，如鑷子應(yīng)冷卻后才能夾?。^的器械要冷卻后才

21、能使用，如鑷子應(yīng)冷卻后才能夾取組織，否則可能造成組織細胞損傷；塑料、橡膠器件宜用組織，否則可能造成組織細胞損傷；塑料、橡膠器件宜用75%酒精擦洗，勿將酒精接觸里面。膠塞、橡皮頭等過燈時酒精擦洗，勿將酒精接觸里面。膠塞、橡皮頭等過燈時時間要短，時間要短，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞。以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞。（2）已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)）已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)等成分燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)等成分燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時會將其帶如培養(yǎng)液中；時會將其帶如培養(yǎng)液中；（3）開啟、關(guān)閉長有

22、細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防）開啟、關(guān)閉長有細胞的培養(yǎng)瓶時，火焰滅菌時間要短，防止因溫度過高燒死細胞；止因溫度過高燒死細胞；（4）進行培養(yǎng)操作時，不要用手觸及已消毒物品，如）進行培養(yǎng)操作時，不要用手觸及已消毒物品，如不慎接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換不慎接觸，要用火焰燒灼或取備用品更換（5）吸取不同液體、處理不同的細胞要用不同的）吸取不同液體、處理不同的細胞要用不同的吸吸管，以避免液體間、細胞間的交叉污染。管，以避免液體間、細胞間的交叉污染。（6）面向操作野時勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾）面向操作野時勿大聲講話或咳嗽，以免噴出的唾沫把細菌等帶入工作臺面造成污染。沫把細菌等帶入工作臺

23、面造成污染。（7）操作人員應(yīng)注意自身安全。）操作人員應(yīng)注意自身安全。（8）操作完畢后，清理物品，）操作完畢后，清理物品，75%酒精擦洗臺面。酒精擦洗臺面。培養(yǎng)基培養(yǎng)基基本要求基本要求營養(yǎng)成分營養(yǎng)成分:氨基酸、維生素、單糖、其它氨基酸、維生素、單糖、其它 成分成分 促生長因子和激素促生長因子和激素 pH：最適為：最適為7.2-7.4， 滲透壓滲透壓 四、動物細胞培養(yǎng)基的組成及配制四、動物細胞培養(yǎng)基的組成及配制無菌無菌 （一）培養(yǎng)基的成分（一）培養(yǎng)基的成分動物細胞對培養(yǎng)基要求高動物細胞對培養(yǎng)基要求高葡萄糖、必需氨基酸、維生素、無機鹽、微葡萄糖、必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、細胞生長因子及激

24、素等。量元素、細胞生長因子及激素等。1.1.葡萄糖：葡萄糖： 碳水化合物是細胞生長主要能量來源碳水化合物是細胞生長主要能量來源, ,其中有其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分. .主要有葡萄糖主要有葡萄糖, ,核糖核糖, ,脫氧核糖脫氧核糖, ,丙酮酸鈉和醋酸等。細胞對葡丙酮酸鈉和醋酸等。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。 體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。2 2、氨基酸：是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。在培養(yǎng)基、氨基酸：是細

25、胞合成蛋白質(zhì)的原料。在培養(yǎng)基中添加至少中添加至少1212種必須氨基酸。種必須氨基酸。 此外還需要此外還需要谷氨酰胺谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源的來源.3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。都是培養(yǎng)基常有的成分。 4.無機離子與微量元素：無機離子與微量元素：培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維

26、持滲透壓培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡平衡.此外此外,通過提供鈉通過提供鈉,鉀和鈣離子鉀和鈣離子,幫助細胞調(diào)節(jié)幫助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功能細胞膜功能.培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素因素.細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。銅、錳、鉬、釩等。 5、生長因子和激素、生長因子和激素已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的

27、作用。有細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。 (二）常用培養(yǎng)基二）常用培養(yǎng)基 n 動物細胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、動物細胞的培養(yǎng)基一般分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種，此外細胞培養(yǎng)還需要無血清培養(yǎng)基幾種，此外細胞培養(yǎng)還需

28、要一些常用的溶液。一些常用的溶液。1天然培養(yǎng)基 血清：常用胎牛血清（血清：常用胎牛血清（FBS）、小牛）、小牛血清（血清（CS），一般濃度），一般濃度10。 雞血漿：含纖維蛋白原和一些營養(yǎng)成雞血漿：含纖維蛋白原和一些營養(yǎng)成分分 水解乳蛋白水解乳蛋白 鼠尾膠原鼠尾膠原優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好。缺點：成分復(fù)雜，個體差異大，來源有限缺點：成分復(fù)雜，個體差異大，來源有限l動物細胞培養(yǎng)中血清的作用 （1）營養(yǎng)）營養(yǎng) 提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。所缺乏的營養(yǎng)物

29、質(zhì)。 （2）提供結(jié)合蛋白）提供結(jié)合蛋白，結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶，結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。起重要作用。 （3）提供貼壁細胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和伸展因子，使細胞提供貼壁細胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和伸展因子，使細胞很好地貼壁很好地貼壁 （4）保護保護 提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。提供蛋白酶抑制劑，使細胞免受蛋白酶的損傷。 一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶

30、，血清中含有抗蛋白酶一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。代。 （5）解毒）解毒 血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如如SeO3,硒等。硒等。 n血清的缺點：成分復(fù)雜，影響實驗分析。血清的缺點：成分復(fù)雜，影響實驗分析。n血

31、清的消毒：過濾除菌血清的消毒：過濾除菌n血清的儲存：血清的儲存：4，或，或-20 以下長期存放。以下長期存放。血清可能引發(fā)的問題血清可能引發(fā)的問題n（1 1）所有的血清都是一種成分不確定的混合物，）所有的血清都是一種成分不確定的混合物，批與批血清之間的組分存在差異；批與批血清之間的組分存在差異；（2 2）血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物）血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物質(zhì)或抑制物質(zhì)，對某些細胞的體外培養(yǎng)有去分化質(zhì)或抑制物質(zhì)，對某些細胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。作用。 ( (血清來源于動物，有可能攜帶傳染源，包括病血清來源于動物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質(zhì)，對正在生長的細胞系或者

32、制品帶毒和有毒物質(zhì)，對正在生長的細胞系或者制品帶來風(fēng)險來風(fēng)險) )（3 3）血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給）血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等細胞疫苗、細胞因子、單克隆抗體等細胞產(chǎn)品的分離純化帶來很大困難。產(chǎn)品的分離純化帶來很大困難。 另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。本高，限制了它的大量使用。 2、合成、合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基l人工合成培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。人工合成培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。n合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于合成培養(yǎng)基的種類相當(dāng)多。合成培養(yǎng)基成分已知，便于對實驗條件的控制。但

33、與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的對實驗條件的控制。但與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細胞未知成分尚無法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細胞培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)中使用的基礎(chǔ)合成培養(yǎng)基還必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。是加入小牛血清。n人工合成培養(yǎng)基，人工合成培養(yǎng)基，常用如下常用如下 (1).MEM(minimum essential medium)細胞培養(yǎng)基系列細胞培養(yǎng)基系列 (2).DMEM（Dulbeccos modified

34、Eagle medium)細胞細胞培養(yǎng)基系列培養(yǎng)基系列(3)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列細胞培養(yǎng)基系列(4).M199細胞培養(yǎng)基系列細胞培養(yǎng)基系列 (7)F-10,F-12細胞培養(yǎng)基系列細胞培養(yǎng)基系列(8) DMEM-F12由由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成組成. 無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應(yīng)用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊動物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。脊動物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。3、無血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基1)無血清培養(yǎng)基的添加成分無血清培養(yǎng)基的添加成分 n 細胞外基質(zhì)：幫助

35、細胞附著和貼壁。細胞外基質(zhì)：幫助細胞附著和貼壁。n 酶抑制劑：保護細胞不受培養(yǎng)基內(nèi)殘留酶的損傷。酶抑制劑：保護細胞不受培養(yǎng)基內(nèi)殘留酶的損傷。n 生長因子和激素：促細胞生長和增殖。生長因子和激素：促細胞生長和增殖。n 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如牛血清白蛋白。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如牛血清白蛋白。2 2）使用方法）使用方法: : 細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度，從降低血清濃度，從10%10%減少到減少到5%5%，3%3%，1%1%，直至無血清培養(yǎng)。，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是

36、否有部分在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。以保證細胞的特性不發(fā)生變化。 l使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)

37、點 (1(1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)）可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的和實驗結(jié)果的準確性準確性、重復(fù)性。重復(fù)性。（2）避免血清源性污染。）避免血清源性污染。（3）避免血清組分對實驗研究的影響。）避免血清組分對實驗研究的影響。（4）有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。）有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。（5）可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純）可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化?；?。n已應(yīng)用的領(lǐng)域有：已應(yīng)用的領(lǐng)域有：（1）研究細胞的分化條件；）研究細胞的分化條件；（2）用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的）用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究；研究；

38、（3）用于從多種細胞混雜的培養(yǎng)基中選擇目的細胞；）用于從多種細胞混雜的培養(yǎng)基中選擇目的細胞；（4）腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究；）腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究；n（5）用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生）用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品。物制品。缺點：主要表現(xiàn)為細胞的適用范圍窄，細胞在無血清培缺點：主要表現(xiàn)為細胞的適用范圍窄，細胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響。養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學(xué)因素的影響。(三）細胞三）細胞培養(yǎng)的其他常用溶液培養(yǎng)的其他常用溶液1 1、 水與平衡鹽溶液水與平衡鹽溶液 （balance saline balance saline sol

39、ution,BSSsolution,BSS）：）： 1 1）培養(yǎng)用水）培養(yǎng)用水: :體外培養(yǎng)的細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要體外培養(yǎng)的細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細胞死亡。用金屬蒸餾也會影響細胞的存活和生長，甚至導(dǎo)致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或用水。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或

40、超純水凈化裝置制備的超純水。存放時間一般不應(yīng)超過超純水凈化裝置制備的超純水。存放時間一般不應(yīng)超過2 2周。周。 2. 平衡鹽溶液：平衡鹽溶液：n 主要是由無機鹽、葡萄糖組成。主要是由無機鹽、葡萄糖組成。作用：作用：n提供緩沖系統(tǒng)，維持細胞滲透壓平衡，保持維持細胞滲透壓平衡，保持pHpH穩(wěn)穩(wěn)定定n提供細胞生存所需的能量和無機離子成分。提供細胞生存所需的能量和無機離子成分。n用于洗滌組織、細胞的漂洗、配制其他培養(yǎng)用液。用于洗滌組織、細胞的漂洗、配制其他培養(yǎng)用液。幾種常用的幾種常用的BSSnRingernPBSnEarlenHanksnD-Hanks配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有配制

41、溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。過濾除菌或高溫滅菌。 3、PH調(diào)整液：調(diào)整液：nNaHCONaHCO3 3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，溶液用是培養(yǎng)基中必須添加的成分，溶液用3.7%3.7%、5.6%5.6%、7.4%NaHCO7.4%NaHCO3 3溶液溶液n HEPESHEPES液（液（羥乙基哌嗪乙硫磺酸羥乙基哌嗪乙硫磺酸 ），使用終濃），使用終濃度為度為0.010.010.5mol/L。 HEPES是一種非離是一種非離子兩性緩沖液子兩性緩沖液,其在其在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力。，一般培養(yǎng)液內(nèi)含較好的緩沖能力。，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEP