牛病毒病的多重檢測完稿

1、journal of immunologicalmethodsdevelopment and evaluation of a luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpesvirus1,parainfluenza 3 virus, bovine viral diarrhoea virus, and bovine respiratory syncytial virus, with comparison to existing elisa detection methods steve anderson,

2、 phil wakeley, guy wibberley, kath webster, jason sawyer 摘要在臨床上，牛的皰疹病毒(bhv-1) , 副流感病毒(pi3v) ,腹瀉病毒(bvdv) ，牛呼吸道合胞體病毒(brsv)的診斷和監(jiān)測常用elisa方法。目前利用luminex技術(shù)在血清學(xué)檢測的基礎(chǔ)上同時(shí)檢測幾種病毒的所有抗體的方法已經(jīng)成為發(fā)展趨勢在luminex體系中，病毒的抗原和熒光微球偶聯(lián)，檢測血清樣品。elisa檢測作為對照。與單獨(dú)的elisa檢測相比，bhv-14和 pi3v luminex的多重檢測表現(xiàn)出相似的敏感性和特異性。bvdv和brsv的檢測不是很成功，可能

3、因?yàn)檫@些抗原的信號強(qiáng)度較弱，不能有效區(qū)分陽性和陰性樣品。在luminex體系中，bvdv的重組抗原在信號強(qiáng)度方面比未加工的bvdv抗原有所增加。研究背景牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒(bhv-1)，副流感病毒(pi3v)，牛病毒性腹瀉病毒（bvdv)和牛呼吸道合胞體病毒(brsv）引起的牛的呼吸道傳染病。bvdv 和 bhv-1也引起繁殖障礙，導(dǎo)致先天性流產(chǎn)和死胎。elisa是常用的血清學(xué)檢測方法，也適用于高通量篩選。在標(biāo)準(zhǔn)品阻斷elisa檢測方法中所用的捕獲抗原，是未經(jīng)處理的病毒或來自組織培養(yǎng)病毒收獲的細(xì)胞裂解液中純化的病毒抗原，或者是純化的具免疫原性的重組病毒蛋白但是elisa方法的局限是在

4、一個(gè)樣品中只能使用一種生物素標(biāo)記。因此，同樣的血清樣品必須用幾種單獨(dú)的elisa 進(jìn)行血清學(xué)檢測在同樣的測定體系中能夠檢測幾種靶標(biāo)的多重檢測技術(shù)對常規(guī)的血清學(xué)檢測將有利于減少人力和物 力，是一種新型的實(shí)驗(yàn)室檢測方法luminex多重檢測原理液相芯片（liquid array)檢測系統(tǒng)是由聚苯乙烯材料所制作的大小均一的圓形微球（直徑為5.6um)，在其制作過程中包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑兩種熒光染料，而產(chǎn)生100種不同比例顏色微球，每個(gè)微球都有獨(dú)特的色彩編號，具有其獨(dú)特的地址。100種微球可依不同研究目的而偶聯(lián)100種探針（如抗原、抗體、核酸、酶、各種受體等），這樣可以同時(shí)對一個(gè)待測樣本中

5、的100種不同的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測。在檢測過程中，微球單個(gè)逐一通過檢測通道，微球通過檢測通道時(shí)受到兩束激光的同時(shí)照射，第一束635nm紅色激光微球內(nèi)部的突光物質(zhì)，根據(jù)焚光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比率也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開來（定性、分類）；第二束紫色激光激發(fā)報(bào)告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報(bào)告分子（如sa-pe)的數(shù)量，從而確定目標(biāo)分子數(shù)量（定量）系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時(shí)出現(xiàn)的綠色熒光信號，不記錄未結(jié)合的報(bào)告分子熒光信號。最后通過分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，分析兩道激光所

6、激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣木中有無待檢測病原體存在，或檢測同時(shí)存在幾種或數(shù)十種病原體。文章布局樣品（陽性抗血清的制備；田間樣品的采集）抗原制備elisa檢測抗原和luminex微球的偶聯(lián)（2步法）luminex多重檢測多重檢測的可行性分析試驗(yàn)抗原的最佳稀釋度確定陽性抗血清的特異性檢測田間樣品平行試驗(yàn)批內(nèi)和批間的變異性分析bvdv 的e2重組蛋白作為抗原的分析試驗(yàn)結(jié)果討論2.11 陽性抗血清的制備 陽性對照抗血清來自試驗(yàn)感染的動物， bhv1抗血清來自斷奶牛犢，鼻內(nèi)或靜脈接種bhv1的1和2亞型。 bvdv抗血清來自于隔離培養(yǎng)的無特定病原體動物，鼻內(nèi)和靜脈注射bvdv的11亞型。 br

7、sv和pi3v的陽性對照抗血清由疫苗接種獲得。2.12 田間樣品的采集實(shí)驗(yàn)組血清來自于一定區(qū)域內(nèi)不同品種，不同飼養(yǎng)場，圈養(yǎng)或散養(yǎng)的牛群（公畜或母畜）采集對象為診斷有呼吸系統(tǒng)疾病動物：如腹瀉，抑郁，消瘦等。以及一些有繁殖障礙或死亡的家畜2.2 抗原制備bhv1, pi3v, bvdv 和 brsv的病毒抗原來自于未處理的細(xì)胞增值的病毒。bhv1 (oxford ed6株) , pi3 (ti 株)來自于牛腎細(xì)胞增值的的病毒， brsv 來自牛腎單層細(xì)胞增值的病毒，bvdv來自小牛睪丸細(xì)胞增值的病毒，待細(xì)胞病變達(dá)到80-90時(shí)，收集病毒，1500 g離心，收取上清液。作為陽性抗原，陰性對照為沒有增

8、值病毒的細(xì)胞離心后的上清液。2.3 elisa 檢測 （1）bhv1, pi3v, bvdv ，brsv 抗原及其對應(yīng)的 陰性對照抗原 用包被緩沖液分別做1:1500, 1:900, 1:600 and 1:500 稀釋，每孔加60 ul。（2）4孵育過夜，用含0.05% tween 20的pbs沖洗酶標(biāo)板3次，（3）每孔加入50ul 1:100稀釋的bhv 1, pi3v 和 brsv，1:50 稀釋的bvdv的血清，實(shí)驗(yàn)組和陽性血清對照組每孔都分別做兩個(gè)重復(fù)。bhv 1, pi3v 和 brsv組室溫避光孵育2 h，bvdv37孵育1 h（4）洗滌液沖洗酶標(biāo)板5次。（5）每孔加入50ul辣

9、根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛的二抗。（6）bhv1, pi3v 和brsv室溫避光孵育1h。bvdv 37孵育1h。（7）每孔加入50 ul tmb 37避光顯色5-10 min（8）每孔加入50 ul 2 m 硫酸終止反應(yīng)。（9）檢測od值2.4 抗原和luminex 微球的偶聯(lián)2步法：包括微球活化，微球和抗原的偶聯(lián)步法：包括微球活化，微球和抗原的偶聯(lián)（1）bhv-1, pi3v, bvdv和 brsv和陰性對照樣品用500ul的0.1m的pbs稀釋（2）微球儲存液超聲漩渦震蕩20s，取80ul（含106個(gè)微球）微球儲存液于1.5ml 的離心管 （3）13,000g離心3 min，超聲20s（4

10、）小心棄去上清（5）用0.1m的活化緩沖液磷酸鹽清洗微球兩次，然后用80ul的活化緩沖液懸浮 微球（6）先后加入10 ul 新鮮配制的sulfo- nhs 溶液( 50 mg/ml) 、10 ul edc 溶液( 50mg/ml) , 混勻, 室溫避光振搖20 min。（9）然后離心，棄上清。用含0.05%吐溫的0.1 m pbs （交聯(lián)緩沖液）清洗兩次，（10）加入陽性和陰性抗原稀釋液，并用交聯(lián)緩沖液補(bǔ)足體積至500 ul。室溫避光溫和振蕩2 h。離心微球，棄上清。沉淀加入1ml交聯(lián)緩沖液清洗兩次。然后加入250 ul封閉/貯存液重懸微球，4 避光保存。2.5 luminex多重檢測每孔加入

11、100ul 儲存緩沖液，500 g 離心30 s偶聯(lián)有bhv1, pi3v, bvdv和brsv陽性和陰性抗原的8種微球14000 g離心3 min，超聲漩渦震蕩分散微球調(diào)整微球濃度至8105 beads/ml，在濾板的每個(gè)檢測孔加入10稀釋好的微球（每孔含偶聯(lián)微球總個(gè)數(shù)約為8000個(gè)）。待檢血清樣品用稀釋緩沖液（含0.05% 吐溫 20, 0.05% 疊氮鈉,1% 魚明膠的pbs）按 300比例稀釋，每個(gè)樣品孔加入100 ，每個(gè)樣品做孔重復(fù)；在對照孔中加入100 ul陰性血清稀釋液個(gè)）放置于平板混勻器，室溫避光孵1 h。每孔用100 ul的緩沖液洗滌，500g離心30 sluminex多重檢

12、測每孔加入1 50稀釋的生物素標(biāo)記的鼠抗牛igg抗體100ul。室溫避光孵育1 h。 洗滌，每孔加入4ug/ul的鏈霉素藻紅蛋白（sa-pe）100 ul。放置于平板混勻器，室溫避光孵育30 min。每孔加入10 0ul的洗滌緩沖液清洗兩次，然后加入100ul的分析緩沖液重懸微球，luminex檢測，設(shè)置儀器每次只檢測相應(yīng)編碼的熒光微球?qū)⒎磻?yīng)板放入luminex檢測系統(tǒng)中讀取每孔mfi值。bhv1, pi3, bvdv 和 brsv與之偶聯(lián)的微球編號分別為035, 033,037 和 042，相應(yīng)的陰性抗原偶聯(lián)的微球分別為036, 034, 038 和 043。2.6 多重檢測的可行性試驗(yàn)在l

13、uminex實(shí)驗(yàn)中，用未處理的細(xì)胞毒作為抗原在實(shí)驗(yàn)的可行性方面和elisa做了一個(gè)比較。bhv1,pi3v, bvdv ， brsv抗原及其分別對應(yīng)的陰性抗原用偶聯(lián)緩沖液10倍稀釋，分別和8種不同編號的微球偶聯(lián)。4種病毒的陽性抗血清進(jìn)行系列稀釋，每個(gè)稀釋孔3個(gè)重復(fù)。然后用luminex多重檢測檢測，平行試驗(yàn)用elisa分別檢測。2.7 抗原稀釋度的最優(yōu)化在可行性實(shí)驗(yàn)中，與微球偶聯(lián)的病毒抗原10倍稀釋。為了確定病毒抗原稀釋后是否能改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果，和微球偶聯(lián)前將抗原分別作10倍，100倍，500倍，1000倍稀釋。結(jié)果用300倍稀釋的bhv1, pi3 ，brsv 和 bvdv的陽性抗血清進(jìn)行檢測。

14、（抗原稀釋后有利于田間樣品檢驗(yàn)。）2.8 陽性抗血清的特異性檢測 bhv1,pi3v, bvdv 和 brsv陽性對抗血清的特異性檢測，已在2.3和2.5中利用elisa和luminex技術(shù)進(jìn)行了檢測。2.9 田間樣品平行試驗(yàn) 用luminex和elisa檢測了306個(gè)田間樣品，這些樣品中至少包含100個(gè)陽性對照，和100個(gè)陰性對照樣品，每個(gè)檢樣孔做兩個(gè)重復(fù)。 luminex多重檢測的平均熒光強(qiáng)度（mfi）為陽性樣品產(chǎn)生的信號值減去陰性對照樣品產(chǎn)生的熒光信號值。 roc曲線可最大限度的展示luminex檢測的敏感性和特異性。2.10 批內(nèi)和批間變異性分析 將含針對四種抗原的陽性抗血清300倍稀

15、釋，分別進(jìn)行7個(gè)單獨(dú)的多重檢測，每組設(shè)2-4個(gè)重復(fù)，一共21個(gè)重復(fù)。批內(nèi)試驗(yàn)設(shè)置同批間試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前田間樣品已用elisa檢測，確保含有針對以上四種病毒的抗體。2.11 bvdv的重組e蛋白作為抗原的檢測 bvdv的e2基因亞克隆到桿狀病毒pbacpak9載體，將桿狀病毒和bvdve2基因共轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細(xì)胞，表達(dá)重組蛋白。 產(chǎn)生的重組蛋白用western blot方法，bvdv的特異性抗體檢測。 帶his標(biāo)簽的重組e2蛋白用鎳離子柱純化。 將重組的e2蛋白和陰性對照抗原，細(xì)胞培養(yǎng)獲得病毒抗原分別做1:50,1:109，1:350稀釋，偶聯(lián)微球，和相同稀釋度的bvdv的陽性抗血清反應(yīng)，比較重組

16、蛋白和bvdv未處理的細(xì)胞毒作為抗原產(chǎn)生的熒光信號值。luminex技術(shù)對含有4種病毒的抗體的陽性抗血清的多重檢測fig. 1. comparison of signals produced in the luminex multiplex assay by the four antigens when testing pooled control antiserum dilutions (containing antibodies to all four antigens). mfi=median fluorescent intensity.luminex和elisa檢測結(jié)果比較fig. 2

17、. comparison of signals from the luminex multiplex assay with the individual elisa tests, generated from testing dilutions of a pooled control antiserum sample, containing antibodies to all four antigens. the dotted line represents the elisa cut off. 抗原最佳稀釋度的確定 （1/500 for bhv1, 1/100 for pi3 and brs

18、v,and 1/10 for bvdv ）fig. 3. changes in signals resulting from conjugation of different dilutions of antigen to luminex beads and subsequent reaction with a control pooled antiserum sample. the negative antigen represents the signal produced by non-specific binding.陽性抗血清的特異性檢測用luminex多重檢測pi3v的抗血清時(shí)，

19、bvdv出現(xiàn)了弱的信號，同樣檢bvdv的抗血清時(shí)， pi3v也出現(xiàn)了弱的信號。用單獨(dú)的elisa檢測也證實(shí)了這一現(xiàn)象。不清楚是因?yàn)槎嘀伢w系本身導(dǎo)致的非特異性交叉反應(yīng)還是多重檢測體系比較精確地檢測到了非特異性抗體的存在。但是在檢測臨床樣品時(shí)并沒有發(fā)現(xiàn)很多交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，說明陽性抗血清中確實(shí)存在其它病毒的抗體，多重檢測體系也精確檢測到了此抗體的存在。以elisa檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，luminex檢測結(jié)果的roc曲線分析fig. 4. roc curve analysis for the different tests within the luminex multiplex assay using e

20、lisa as the gold standard. the areas under the curve (auc) are shown with the graphs.table 222 boxes for each test within the luminex multiplex assay.luminex相對elisa檢測的特異性和敏感性分析table 3diagnostic sensitivity and specificity of the four assays in the luminex multiplex assay relative to the individual e

21、lisa tests, determined after roc analysis to set cut-off values.luminex相對elisa檢測的特異性和敏感性分析fig. 5. scatter diagram illustrating the distribution of mfi signals for the different tests within in the luminex multiplex assay. data points on the left of the graphs are elisa negative samples; data points

22、on the right of the graphs are elisa positive samples.luminex檢測結(jié)果的散點(diǎn)圖分布table 4within and between assay variation of the different assays in the luminex multiplex assay.bhv1 和 pi3v的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)（cv）低于10%，說明二者的重復(fù)性較好批內(nèi)和批間的變異性分析fig. 6. comparison of signal produced with bvdv recombinant e2 proteinand bvdv

23、viral lysate antigen after testing a bvdv antiserum dilution serieson the luminex platform.（1.）重組抗原在陽性血清做1：12150稀釋時(shí)，產(chǎn)生的mfi和viral lysate antigen在陽性血清做1:50稀釋時(shí)產(chǎn)生的mfi值等同，在5000左右。（2.）在陽性抗血清做1:450稀釋時(shí)，陰性對照抗原產(chǎn)生的mfi有所減少，此時(shí)，重組抗原產(chǎn)生的mfi在3,0000左右具免疫原性的re2不具免疫原性的re2viral lysate antigen陰性對照討論1. 我們 利用luminex體系建立和評估

24、了檢測牛四種病毒的抗體的血清學(xué)多重檢測方法， 2. 利用細(xì)胞培養(yǎng)的病毒裂解物（elisa檢測中常用的抗原）作為抗原可以和微球有效偶聯(lián)，roc曲線可以將luminex多重檢測（相對elisa檢測結(jié)果）的結(jié)果敏感性和特異性上放大到最大化 3. 在luminex檢測中，bhv-1 和pi3v抗原比 pi3v 和 brsv的抗原更有效。bvdv and brsv 診斷結(jié)果的不理想主要是因?yàn)閙fi值較低，信噪比較弱。因此，和elisa相比，陽性和陰性樣品bvdv和brsv批內(nèi)和批間的變異系數(shù)相對bhv1和p13的變異較高，主要?dú)w因于bvdv and brsv產(chǎn)生的mfi值相對較低。較高的mfi值將可減少bvdv and brsv.的變異系數(shù)，在檢測pi3v陽性對照抗血清時(shí)， bvdv出現(xiàn)了弱的熒光信號。在檢測bvdv陽性對照抗血清時(shí)， pi3v也出現(xiàn)