第四章 細胞破碎技術(shù)

1、1第四章第四章 細胞破碎技術(shù)細胞破碎技術(shù)細胞：細胞：l細菌細菌l酵母酵母l霉菌霉菌l動物細胞動物細胞l植物細胞植物細胞生物分離的目的組分：生物分離的目的組分： 胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細胞破碎的難易：細胞破碎的難易：與細胞種類有關(guān)與細胞種類有關(guān)與目的物的穩(wěn)定性有關(guān)與目的物的穩(wěn)定性有關(guān)2一、細胞壁的結(jié)構(gòu)一、細胞壁的結(jié)構(gòu)1. 1. 細菌細胞壁結(jié)構(gòu)：細菌細胞壁結(jié)構(gòu)：nG G+ +: : 肽聚糖肽聚糖nG G- -: : 外壁層為外壁層為脂多糖脂多糖和和磷脂磷脂、脂蛋白脂蛋白；內(nèi)；內(nèi)壁層壁層肽聚糖肽聚糖。 （脂多糖需脂多糖需CaCa2+2+、MgMg2+2+才能穩(wěn)定）才能穩(wěn)定）32. 2.

2、酵母：由酵母纖維素組成，主要成分是葡聚糖和酵母：由酵母纖維素組成，主要成分是葡聚糖和甘露聚糖甘露聚糖3. 3. 霉菌：幾丁質(zhì)和葡聚糖霉菌：幾丁質(zhì)和葡聚糖4. 4. 植物細胞：纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等植物細胞：纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等5. 5. 動物細胞：無細胞壁動物細胞：無細胞壁4二、常用細胞破碎方法二、常用細胞破碎方法1. 1.實驗室方法實驗室方法( (小規(guī)模小規(guī)模) )：l 旋刀勻漿法旋刀勻漿法圖圖 通過固體剪切力進行破碎，劇烈通過固體剪切力進行破碎，劇烈 能完全破壞動、植物細胞，但酵母、細菌細胞不同能完全破壞動、植物細胞，但酵母、細菌細胞不同 注意防止升溫注意防止升溫l

3、研磨法研磨法圖圖 利用磨料與細胞間的剪切及碰撞作用，溫和，常在研缽利用磨料與細胞間的剪切及碰撞作用，溫和，常在研缽內(nèi)進行（或細胞勻漿器）內(nèi)進行（或細胞勻漿器） 常用磨料：石英砂、氧化鋁常用磨料：石英砂、氧化鋁 增效方法：預(yù)先冷凍樣液增效方法：預(yù)先冷凍樣液（一）機械破碎法（一）機械破碎法5旋刀勻漿器旋刀勻漿器6研磨法儀器研磨法儀器研缽研缽細胞勻漿器細胞勻漿器7l 高壓勻漿法高壓勻漿法2. 2.大規(guī)模方法大規(guī)模方法：過程：高壓過程：高壓( (可達可達50-100Mpa)50-100Mpa)噴出噴出碰撞碰撞釋放到低壓釋放到低壓高壓造成升溫高壓造成升溫2-3/10MPa2-3/10MPa，需注意冷卻料

4、液，需注意冷卻料液影響因素：壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度影響因素：壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度適用于酵母和絕大多數(shù)細菌，不適適用于酵母和絕大多數(shù)細菌，不適于團狀、絲狀菌于團狀、絲狀菌處理能力可達處理能力可達0.1-100 m3/h89l X X擠壓法（改進的高壓勻漿法）擠壓法（改進的高壓勻漿法） 濃縮的菌體懸浮液冷卻至濃縮的菌體懸浮液冷卻至-30 -25 -30 -25 形成冰晶體，利用形成冰晶體，利用500MPa500MPa以上的高壓沖擊以上的高壓沖擊 適用范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低、活性保留適用范圍廣、破碎率高、細胞碎片粉碎程度低、活性保留率高率高 主要用于實驗室主要用于實驗室 對冷凍融解敏感的

5、生物物質(zhì)不適合對冷凍融解敏感的生物物質(zhì)不適合l高速珠磨法（高速珠磨法（beadmillbeadmill）利用玻璃小珠與細胞懸液一起快速攪拌利用玻璃小珠與細胞懸液一起快速攪拌提高破碎效率的方法：提高攪拌速度、增加小珠量、降提高破碎效率的方法：提高攪拌速度、增加小珠量、降低細胞濃度、降低通過珠磨機的循環(huán)速率低細胞濃度、降低通過珠磨機的循環(huán)速率10高速珠磨機高速珠磨機113. 3. 超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasoundultrasound） 超聲波振蕩器，超聲波振蕩器，15-25kHz15-25kHz的超聲波的超聲波 超聲設(shè)備：槽式，探頭式超聲設(shè)備：槽式，探頭式 圖圖 超聲波作用機理：空

6、化作用超聲波作用機理：空化作用 破碎作用影響因素：超聲波的聲強、頻率、處理破碎作用影響因素：超聲波的聲強、頻率、處理時間、液體的溫度等時間、液體的溫度等 優(yōu)點：操作簡單，液量損失少。優(yōu)點：操作簡單，液量損失少。 缺點：易失活，噪聲，大容量時聲能不易傳遞、缺點：易失活，噪聲，大容量時聲能不易傳遞、不易散熱。不易散熱。 常用間歇處理，冰浴冷卻。多在實驗室規(guī)模用。常用間歇處理，冰浴冷卻。多在實驗室規(guī)模用。12超聲設(shè)備超聲設(shè)備探頭式探頭式（超聲細胞破碎儀）（超聲細胞破碎儀）槽式槽式（超聲清洗儀）（超聲清洗儀）13l 反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法 將細胞在將細胞在-15-15下急劇凍結(jié)、室溫緩融，反復(fù)多次下急劇

7、凍結(jié)、室溫緩融，反復(fù)多次 機理機理：冷凍促進細胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增強其親水性能；：冷凍促進細胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，增強其親水性能；胞內(nèi)水形成冰晶粒脹破細胞胞內(nèi)水形成冰晶粒脹破細胞 缺點：溶質(zhì)釋放、擴散慢缺點：溶質(zhì)釋放、擴散慢l 滲透壓破碎法（溶脹法）滲透壓破碎法（溶脹法） 機理：低滲溶液細胞溶脹，也稱滲透壓沖擊法機理：低滲溶液細胞溶脹，也稱滲透壓沖擊法 操作：一定體積的濃細胞液，加入操作：一定體積的濃細胞液，加入2倍體積的水中倍體積的水中 操作方法改進：細胞預(yù)先置于高滲介質(zhì)中操作方法改進：細胞預(yù)先置于高滲介質(zhì)中 特點：最溫和，用于易破碎的細胞，如動物細胞、特點：最溫和，用于易破碎的細胞，如動物

8、細胞、G-等等（二）物理破碎法（二）物理破碎法物理法總體不適于大規(guī)模生產(chǎn)，物理法總體不適于大規(guī)模生產(chǎn)，因破碎率低、效果較差因破碎率低、效果較差14 通過化學(xué)試劑使細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。通過化學(xué)試劑使細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。常用有：酸、堿、表面活性劑、有機溶劑等類別。常用有：酸、堿、表面活性劑、有機溶劑等類別。（三）化學(xué)破碎法（三）化學(xué)破碎法 表面活性劑、堿表面活性劑、堿溶解細胞壁上的脂質(zhì)或使細胞內(nèi)組分滲漏。溶解細胞壁上的脂質(zhì)或使細胞內(nèi)組分滲漏。表面活性劑如膽酸鹽、表面活性劑如膽酸鹽、SDSSDS、Triton X-100Triton X-100、TweenTween等。等。 酸酸

9、蛋白質(zhì)水解成氨基酸，常用蛋白質(zhì)水解成氨基酸，常用6M 6M HClHCl。 有機溶劑有機溶劑可溶解磷脂層，使細胞結(jié)構(gòu)破壞。如丁酯、丁醇、可溶解磷脂層，使細胞結(jié)構(gòu)破壞。如丁酯、丁醇、丙酮、氯仿、甲苯等。丙酮、氯仿、甲苯等。優(yōu)點優(yōu)點：產(chǎn)物釋出性好、細胞外形完整、碎片少、胞內(nèi)雜質(zhì)釋產(chǎn)物釋出性好、細胞外形完整、碎片少、胞內(nèi)雜質(zhì)釋放少，便于后步分離放少，便于后步分離缺點缺點：易引起目的物失活，可能給后續(xù)產(chǎn)物純化帶來困難，易引起目的物失活，可能給后續(xù)產(chǎn)物純化帶來困難，從而影響最終純度從而影響最終純度15細菌：溶菌酶，細菌：溶菌酶，G- G- 還需加入還需加入EDTAEDTA酵母：消解酶、酵母：消解酶、-葡

10、聚糖酶、甘露糖酶、蝸牛酶葡聚糖酶、甘露糖酶、蝸牛酶霉菌：幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶霉菌：幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶植物：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶植物：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶自溶法：細胞內(nèi)酶（調(diào)節(jié)溫度、自溶法：細胞內(nèi)酶（調(diào)節(jié)溫度、pHpH或添加有機溶或添加有機溶劑誘導(dǎo)細胞自溶）。劑誘導(dǎo)細胞自溶）。（四）酶法破碎法（四）酶法破碎法 應(yīng)用酶破壞細胞壁，可部分或完全破壞細胞壁，再應(yīng)用酶破壞細胞壁，可部分或完全破壞細胞壁，再結(jié)合其他方法破壞細胞壁。結(jié)合其他方法破壞細胞壁。n酶法優(yōu)點酶法優(yōu)點：條件溫和、反應(yīng)迅速、選擇性強；：條件溫和、反應(yīng)迅速、選擇性強；n缺點缺點：價格貴、通用性差、有時存在產(chǎn)物抑制、難適用于：價格

11、貴、通用性差、有時存在產(chǎn)物抑制、難適用于大規(guī)模工業(yè)操作，受影響因素多大規(guī)模工業(yè)操作，受影響因素多16細胞破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞細胞破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分比數(shù)。數(shù)量的百分比數(shù)。即： Y=(N0-N)/N0100% N N0 0原始細胞的數(shù)量原始細胞的數(shù)量 NN經(jīng)細胞破碎處理后余下的完整細胞數(shù)經(jīng)細胞破碎處理后余下的完整細胞數(shù)三、細胞破碎率的評價三、細胞破碎率的評價細胞數(shù)的計算方法：細胞數(shù)的計算方法：直接計數(shù)法直接計數(shù)法：血球計數(shù)板血球計數(shù)板間接計數(shù)法間接計數(shù)法：細胞破碎后，測定細胞懸浮液中特定細胞細胞破碎后，測定細胞懸浮液中特定細胞釋出物的濃度釋出物的濃度17應(yīng)從

12、以下方面考慮：應(yīng)從以下方面考慮：細胞的處理量細胞的處理量細胞壁的結(jié)構(gòu)、強度細胞壁的結(jié)構(gòu)、強度目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性破碎程度破碎程度具體的操作條件應(yīng)從以下三方面進行權(quán)衡：具體的操作條件應(yīng)從以下三方面進行權(quán)衡： 高的產(chǎn)物釋放率高的產(chǎn)物釋放率 低的能耗低的能耗 便于后續(xù)提取便于后續(xù)提取四、細胞破碎方法的選擇依據(jù)四、細胞破碎方法的選擇依據(jù)18實際應(yīng)用中，常采用多種方法結(jié)合：實際應(yīng)用中，常采用多種方法結(jié)合：主要為機械法與非機械法的結(jié)合，如主要為機械法與非機械法的結(jié)合，如n酶酶+ +高壓勻漿高壓勻漿n酶酶+ +超聲超聲其他如：化學(xué)法其他如：化學(xué)法+ +凍融法凍融法19五、基因

13、工程包含體的純化方法五、基因工程包含體的純化方法包含體：外源基因在細胞內(nèi)高度表達蛋白，因此包含體：外源基因在細胞內(nèi)高度表達蛋白，因此凝集而成的無活性固體顆粒。凝集而成的無活性固體顆粒。 包含體為致密凝聚體，密度較大，低速離心便包含體為致密凝聚體，密度較大，低速離心便可沉淀，與細胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離?？沙恋恚c細胞碎片和可溶性產(chǎn)物分離。分離純化包含體蛋白的分離純化包含體蛋白的基本步驟基本步驟： 收集細胞收集細胞破碎細胞破碎細胞分離包含體分離包含體包含體洗滌包含體洗滌溶解包含體（目標(biāo)蛋白變性溶解）溶解包含體（目標(biāo)蛋白變性溶解）蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原（目標(biāo)蛋白的復(fù)性復(fù)原（目標(biāo)蛋白的復(fù)性）20溶解包含體：加變性劑溶解溶解包含體：加變性劑溶解 常用常用6 mol/L6