做青過程中酶學(xué)及香氣變化研究

1、 做青實質(zhì)上是一個生物化學(xué)和物理化學(xué)的過程,其主要技術(shù)環(huán)節(jié)與酶的作用密切相關(guān),香氣成分在此過程中變化明顯。許多研究表明,酶與茶葉中的可溶性糖、氨基酸及香氣物質(zhì)等的形成有關(guān)。因此,研究酶在做青過程中的作用機理和生化變化,對于提高茶葉品質(zhì)具有重要的理論和實踐意義。隨著微量分析技術(shù)的日臻完善,研究者對做青的研究也在逐步深入和系統(tǒng)化,除了對香氣物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和鑒定外,還開展了做青過程中香氣物質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化機理的研究。本文就目前國內(nèi)外做青中酶學(xué)和香氣的研究狀況作一綜述。1 做青期間的酶學(xué)研究烏龍茶做青過程中酶的催化作用是烏龍茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵,與烏龍茶品質(zhì)形成關(guān)系較密切的有氧化還原酶類和水解酶類。1.1 氧化

2、還原酶類1.1.1 多酚氧化酶(PPO)活性與相關(guān)生化成分的變化 禹利君,史云峰等研究表明,整葉的PPO活性在做青過程中呈低高低的變化規(guī)律。后人與其研究結(jié)果一致。PPO是一種末端氧化酶,對底物氧化需要氧的參與。PPO活性與在制品含水量呈正相關(guān)。做青過程中水分散失,氣孔關(guān)閉,做青前期PPO對多酚類物質(zhì)的氧化所導(dǎo)致的多酚類物質(zhì)下降是極其微小的;多酚類物質(zhì)氧化主要發(fā)生在做青后期,此時由于脂質(zhì)過氧化的加劇,細胞質(zhì)膜通透性顯著增加,多酚類物質(zhì)的氧化才得以實現(xiàn)。PPO對烏龍茶品質(zhì)形成的生理作用可能主要在膜透性增大后通過跨膜方式實現(xiàn)多酚類物質(zhì)的氧化;同時,若該途徑在膜透性進一步加大后,又會造成多酚類物質(zhì)的過

3、氧化或造成多酚類物質(zhì)與其它蛋白質(zhì)聚合沉積,對茶葉品質(zhì)不利。1.1.2 過氧化物酶(POD)活性與相關(guān)生化成分的變化POD最適的pH為4.15.0。整葉,葉芯的POD活性變化主要由在制品本身的生理條件決定,而葉緣的POD活性變化還與做青時的脅迫條件關(guān)系密切。從POD的活性和含水量的偏相關(guān)性分析得知,POD活性與在制品含水量呈正相關(guān)。但試驗中發(fā)現(xiàn)葉緣含水量的減少,反而促進了POD活性的發(fā)揮,這是由于POD屬于保護性酶類,對逆境脅迫常以升高自身酶活力做出反應(yīng),以保護機體的生理活性。因而在做青中葉緣表現(xiàn)出POD活性強,做青時葉緣表現(xiàn)出POD活性先升高再降低的變化規(guī)律。整葉的POD活性呈低高低的變化規(guī)律

4、,這與在制品的pH值條件變化對POD活性的抑制、促進有關(guān)。茶樹的抗逆性研究發(fā)現(xiàn)POD在水分脅迫和寒冷脅迫的條件下活性增強,這正是POD保護性機制的表現(xiàn)。1.2 水解酶做青時葉片生理機能未失,水解酶類的活性仍在。茶葉中研究得比較多的水解酶主要有果膠酶、纖維素酶、糖苷酶、蛋白酶和淀粉酶等。許多研究表明,水解酶與茶葉中的可溶性糖、氨基酸及醇類香氣物質(zhì)等的形成關(guān)系密切。1.2.1 蛋白酶活性與相關(guān)生化成分的變化蛋白酶可將茶葉中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸,不僅能改善茶葉的香氣和鮮爽度,而且可減少不溶性的復(fù)合物產(chǎn)生,提高茶湯的品質(zhì)。王若仲,楊偉麗等的試驗結(jié)果表明:曬青和做青均有利于蛋白酶的活化。搖青加速了葉

5、片細胞結(jié)構(gòu)的損傷和器官結(jié)構(gòu)的改變,酶與底物接觸的可能性增大,導(dǎo)致氨基酸的含量在做青前期不斷增大。做青后期,葉內(nèi)水分大量散失,再加上酶促降解產(chǎn)物的增多,對酶的活性產(chǎn)生一定的反饋抑制作用,從而使酶的活性大大降低,此時由可溶性蛋白水解成氨基酸的量降低。梁月榮,陸建良等研究結(jié)果表明,可溶性蛋白隨做青進程逐步下降,做青強度大,下降幅度也加快,做青過程中蛋白酶活性增強。說明可溶性蛋白質(zhì)下降,主要是以水解或者其他物質(zhì)如多酚類物質(zhì)結(jié)合成不溶性物質(zhì)的方式而減少。但做青過程中氨基酸總量并未顯著增加,可以認為部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離氨基酸,參與了茶葉品質(zhì)的形成。做青過程中盡管蛋白酶不能使氨基酸和可溶性蛋白在量上有較大的

6、積累,但是就其進一步參與各種反應(yīng),轉(zhuǎn)化形成一系列的芳香物質(zhì)來看,蛋白酶對于烏龍茶特有品質(zhì)的形成,尤其是香氣物質(zhì)的形成發(fā)揮了十分重要的作用。1.2.2 淀粉酶活性與相關(guān)生化成分的變化淀粉含量在做青階段減少主要是由淀粉酶的作用造成的這與淀粉酶的活性變化有關(guān)。王若仲楊偉麗等的試驗結(jié)果表明:淀粉酶活性與可溶性碳水化合物之間無相關(guān)性。原因:一,-淀粉酶、-淀粉酶只能共同作用于淀粉中-1,4-糖苷鍵,它必須與異淀粉酶協(xié)同作用,才能最終把淀粉水解成葡萄糖等可溶性碳水化合物;二,因淀粉不只是可溶性碳水化合物的唯一來源,還存在其它多糖類物質(zhì)如纖維素、半纖維素和果膠等,它們也可以在其相應(yīng)的水解酶的作用下水解成可溶

7、性碳水化合物;三,可溶性碳水化合物可能在搖青過程中轉(zhuǎn)化成其它物質(zhì)。1.2.3 果膠酶活性與相關(guān)生化成分的變化 果膠酶有兩種:(1)果膠甲酯酶(PEM)(2)多聚半乳糖醛酸酶(PG),PG主要作用于多聚半乳糖醛酸的糖苷鍵,使果膠解聚。現(xiàn)有研究認為,在植物組織采后生理中,PG的功能主要在于加速果膠物質(zhì)的降解,破壞細胞初生壁的結(jié)構(gòu)和消除胞間區(qū)隔,增加細胞間的透性,加速呼吸代謝,從而促進水分散發(fā)和區(qū)間分配運輸;此外,胞壁的降解可使某些低聚塘、蛋白質(zhì)及其他胞壁酶類釋放出來的活性.在曬青后緩慢上升,之后總體呈現(xiàn)迅速上升趨勢,并在三搖、靜置后達到活性高峰。而這一階段正是在制品物質(zhì)轉(zhuǎn)化和呼吸代謝逐步活躍的時期

8、。說明搖青工藝促使PG活性增強、變幅明顯加大,可能對在制品內(nèi)在物質(zhì)轉(zhuǎn)化起著重要作用。PG作為胞壁水解酶,一方面通過增加可溶性果膠含量使在制品水溶性物質(zhì)含量增加,另一方面同時通過降解細胞間質(zhì),促進做青過程在制品中的物質(zhì)代謝。唐顥,楊偉麗等研究顯示,PG的活性在一搖或二搖時就能達到峰值,與此相應(yīng)的是可溶性糖在此期間的積累也較高,說明在做青前期有效激發(fā)了PG的活性,促進可溶性糖類較多的積累,為后續(xù)搖青中可溶性糖的轉(zhuǎn)化及其他品質(zhì)化學(xué)成分的形成奠定了基礎(chǔ)。唐顥,楊偉麗等最近的研究也表明,搖青工藝促使PG活性增加,變幅明顯加大,可能對抑制在制品內(nèi)在物質(zhì)的轉(zhuǎn)化起著增效作用。外源Ca2+能顯著抑制PG活性,并

9、通過抑制PG活性使在制品可溶性糖含量明顯減少。經(jīng)Ca2+處理的茶青在搖青過程中不能正常走水,葉緣紅變,并出現(xiàn)“死青”,說明PG的活性可能與在制品組織區(qū)隔間的水分運輸和再分配有關(guān),而Ca2+可能抑制了PPO和與呼吸代謝密切相關(guān)的酶類的作用,使在制品呼吸代謝受阻,出現(xiàn)“死青”現(xiàn)象。1.2.4 纖維素酶細胞壁降解釋放了束縛在胞壁中的蛋白質(zhì),并分解出一些低聚糖。這些低聚糖可能對許多反應(yīng)起著引發(fā)劑的作用,并可以刺激乙烯產(chǎn)生和其他脅迫響應(yīng)。烏龍茶的做青時,葉片逐步失水,葉細胞內(nèi)各種酶系的代謝方向,強烈地趨向于水解。唐顥、楊偉麗等的實驗研究結(jié)果來表明,纖維素酶的活性在一搖或二搖時就能達到峰值,與此相應(yīng)的是可

10、溶性糖也在此期間的積累量較高,說明在做青前期有效地發(fā)揮纖維素酶的活性,促使可溶性糖類較多的積累,為后續(xù)搖青中可溶糖的轉(zhuǎn)化與保留以及其他可溶性成分的生成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。1.2.5 糖苷酶糖苷酶是作用各種糖苷或寡糖使糖苷鍵水解的酶的總稱。-葡萄糖苷酶是一種對茶葉香氣的形成具有重要作用的水解酶類。近年來-葡萄糖苷酶的研究勢頭有增無減,主要是該酶與萜烯類香氣前驅(qū)體關(guān)系密切,使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。2000年,安徽農(nóng)大張秀云對烏龍茶萎凋做青過程中-葡萄糖苷酶活性研究認為,-葡萄糖苷酶活性呈曲線波動變化。烏龍茶在做青過程中,通過搖青使葉緣細胞破損,細胞液的糖苷與糖苷水解酶充分接觸,因而加快了鍵合態(tài)香氣的釋

11、放速度。做青工藝不同,葉片失水速度不一致,細胞破損程度也有差異,導(dǎo)致酶活性高低有別。重做青過程中,細胞破損程度較大,酶活性的變化幅度也大,達0.204個OD單位,而做青過程中,酶活性變化基本呈平穩(wěn)上升,變化幅度只有0.161個OD單位。通過研究與分析還發(fā)現(xiàn),在整個萎凋、做青過程中,酶活性均呈雙峰變化趨勢,兩次高峰分別出現(xiàn)在萎凋結(jié)束和做青結(jié)束前約2h。有研究表明,氧化還原酶的強活性能抑制水解酶的活性。做青臨近結(jié)束時,由于茶鮮葉失水較多,細胞膜透性增大,多酚類物質(zhì)的酶促氧化作用增強,對-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用,因此做青結(jié)束時-葡萄糖苷酶活性不是繼續(xù)升高,而是呈下降的趨勢。2 做青過程中的香

12、氣變化做青是烏龍茶香氣形成的重要階段,做青工藝使烏龍茶類醚浸出物或芳香物質(zhì)含量比其它茶類高。做青過程中,低沸點的青草氣成分得以揮發(fā)和轉(zhuǎn)化,高沸點的花、果香成分顯露出來;同時伴隨著內(nèi)含物質(zhì)的一系列變化,新的芳香物質(zhì)大量形成。2.1 做青過程中香氣變化的條件和特點烏龍茶香氣成分轉(zhuǎn)化和形成的重要條件和顯著特點是:一,適當?shù)牟铇淦贩N或較成熟的鮮葉中芳香物質(zhì)及前體豐富;二,嫩莖中的內(nèi)含物通過“走水”輸送至葉細胞以增進香氣的形成;三,曬青和做青促進了萜烯糖苷水解和香氣的釋放;四,適度的氧化限制了脂質(zhì)降解產(chǎn)物和低沸點醛、酮、酸、酯等成分的大量積累。2.2 做青過程中的香氣變化規(guī)律做青過程,香精油總量、高沸點

13、香精油變化趨勢相同,一般是鮮葉原料較低,曬青、搖青過程中不斷增加,至殺青前達到較高水平。竹尾忠一認為烏龍茶的典型香氣是由萎調(diào)初期加溫處理誘發(fā),因搖青而加速形成的。魏新林、王登良等人試驗發(fā)現(xiàn),嶺頭單樅烏龍茶做青過程,香精油總量從53.87%上升至65.6%,香氣物質(zhì)的種類也從萎調(diào)葉的43種增加到做青結(jié)束時的54種。由此說明,鮮葉經(jīng)萎調(diào)和搖青,蛋白質(zhì)、淀粉的水解和不飽和脂肪酸氧化降解產(chǎn)生的氨基酸、葡萄糖及六碳醇、醛為烏龍茶香氣的發(fā)展提供了先質(zhì)。山西貞研究認為,搖青使己酸-順-3-己烯酯、苯甲酸順-3-己烯酯、順-茉莉酮、苯乙氰、-法尼烯、橙花叔醇、茉莉內(nèi)酯、苯乙酸和吲哚含量明顯增加。王日為認為,做

14、青過程中含量增加的組分有苯甲醇、鄰苯二甲酸二丁酯、橙花叔醇、水楊酸順-3-己烯酯,含量減少的組分有E-2-己烯醛、順-3-己烯醇、芳樟醇、乙酸苯甲酯。伍錫岳等研究認為,做青使芳樟醇氧化物、己醛、庚醛、4-甲基-3-戊烯-2-酮、3,7-二甲基-1,5 ,7-辛三烯-3-醇、-法尼烯、香葉醇、順茉莉酮、橙花叔醇、吲哚、己酸-順-3-己烯酯等含量增加,而使芳樟醇含量減少。苗愛清等研究認為,做青使己醛、順-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、芳樟醇及其氧化物、3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇、己酸己酯、順-己酸-3-己烯酯、反,反-2,4-癸二醛、苯乙氰、橙花叔醇、3-己烯醇苯酯等含量增加

15、,黃金桂和翠玉兩品種做青過程中-法尼烯含量大量增加。2.2.1 做青強度不同對烏龍茶香氣變化規(guī)律的影響梁月榮,陸建良等研究結(jié)果表明搖青作用是烏龍茶香氣形成的必要條件,做青強度的提高有利于烏龍茶特征品質(zhì)的提早出現(xiàn)。不同做青強度下香氣主要組分在做青過程中的變化趨勢是高度一致的。表明這些香氣組分的高低對于烏龍茶品質(zhì)具有重要的影響,是烏龍茶特征香氣組分,這與前人的研究結(jié)果基本一致。黃福平,陳榮冰等以武夷肉桂品種為原料,其試驗結(jié)果表明:做青強度對烏龍茶香氣組成有明顯影響。在一定的外界環(huán)境條件下,搖青可以促進香精油總量大幅度增加,適當增加搖青次數(shù)可以促進香精油的積累,橙花叔醇、芳樟醇、-法尼烯等主要香氣組

16、分相應(yīng)增加。藏隸賢,陳國本等研究表明:嶺頭單樅隨著加工的進行,醇類物質(zhì)明顯增加,做青強度增加,吲哚、已酸-3-已烯酯、植醇、茉莉酮酸甲酯組分等含量增加,而3-已烯-l-醇、苯甲醇、芳樟醇等的組分含量減少,與上述研究結(jié)果有所出入,這可能是由于品種和加工工藝的不同引起的。戴素賢等研究認為,白葉單樅茶做青強度增加,吲哚、己酸-3-己烯酯、植醇、茉莉酮酸甲酯含量增加,而3-己烯-1-醇、苯甲醇、芳樟醇等含量減少。2.2.2 不同溫濕度做青對香氣變化的影響不同溫濕度做青對香氣變化的影響主要在于溫濕度對酶促反應(yīng)的調(diào)節(jié),其中主要是對萜烯類和芳香類配糖體的酶促水解反應(yīng)、脂肪酸的氧化裂解反應(yīng)及類胡蘿素的氧化降解

17、反應(yīng)的調(diào)控。魏新林,王元風(fēng)的試驗表明:溫度25,相對濕度80%的處理,具有輕微花香的芳樟醇氧化物達最高含量,有固香作用的1,2-苯二甲酸酯類含量較高,橙花叔醇含量較高。孫云,金心怡等實驗表明:將冷做青溫度控制在2223,香氣組分以乙酸乙酯、1-戊烯、6-甲基-5-戊烯-2-酮、葉醇等酯類、酮類為主。張方舟在相同的溫度條件下,在75%的相對濕度下做青,香高且持久。魏新林,王元風(fēng)研究中還發(fā)現(xiàn):在密閉的恒溫恒濕環(huán)境下做青,毛茶芳香物質(zhì)含量高,種類多,這可能與恒溫恒濕有利于酶促反應(yīng)的穩(wěn)定及封閉系統(tǒng)做青香氣散失較少有關(guān)。生產(chǎn)上利用恒溫恒濕封閉系統(tǒng)做青來提高烏龍茶的香氣是一個值得研究的課題。2.3 做青過

18、程中的香氣變化機理已經(jīng)證實:烏龍茶中脂質(zhì)降解產(chǎn)物和偶聯(lián)氧化產(chǎn)物較少,而糖苷水解產(chǎn)物及其他高沸點成分的含量較多,長時間做青或“重搖”都有利于增加高沸點成分的比例。2.3.1 脂質(zhì)降解產(chǎn)物脂質(zhì)降解產(chǎn)物,如脂肪酸、低級醇和低級醛類。在烏龍茶長時間的曬青、搖青過程中,葉組織由于機械損傷和脫水造成傷害,使構(gòu)成葉細胞細胞壁的中性脂肪、磷脂在類脂水解酶作用下水解生成大量的不飽和脂肪酸,這些脂肪酸在活性不斷上升的脂肪氧化酶和氧的作用下發(fā)生氫過氧化作用,又在過氧化物分解酶作用下裂解成C6醛,然后發(fā)生異構(gòu)、脫氫作用,生成青葉醇和青葉醛。順式青葉醇具有強烈的青草氣,但微量的青葉醇和反式青葉醇則具有清香。在烏龍茶曬青

19、和搖青過程中,青葉醇大部分都揮發(fā)掉,只有少部分異構(gòu)成的反式青葉醇以及極少量的青葉醇,使茶葉帶有清香。偶聯(lián)氧化產(chǎn)物,如-紫羅酮、二氫海葵內(nèi)酯。茶鮮葉中含有大量的胡蘿卜素類。在烏龍茶曬青、搖青過程中,細胞組織受到破壞,類胡蘿卜素由結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)變。伴隨著兒茶素的酶促氧化,胡蘿卜素發(fā)生氧化降解形成-紫羅酮、二氫?？麅?nèi)酯、茶螺烯酮等香氣物質(zhì)。2.3.2 偶聯(lián)氧化產(chǎn)物2.3.3 糖苷水解產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化物糖苷水解產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化物,如香葉醇、芳樟醇及其氧化產(chǎn)物。在植物受到機械損傷時,次生代謝途徑磷酸戊糖(PPP)途徑增加。黃福平,陳榮冰等研究結(jié)果表明,做青葉內(nèi)糖類大量減少,這與可溶性糖參與烏龍茶香氣形成有關(guān)。茶鮮葉中以糖苷形式存在的配糖體有萜烯醇類、芳香醇類和部分青葉醇。在烏龍茶加工過程中,受搖青葉組織機械損傷的觸發(fā),在葡萄糖甙酶的作用下,累積在葉中的單萜烯醇配糖體水解,使沉香醇和香葉醇游離出來,散發(fā)出花果香,而水解出的一部分沉香醇經(jīng)過加氧、脫氫反應(yīng),變成氧化沉香醇和