慢病毒載體構(gòu)建步驟研究

1、-作者xxxx-日期xxxx慢病毒載體構(gòu)建步驟研究【精品文檔】一、簡介慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體, 然后轉(zhuǎn)移

2、到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，為基因功能的研究提

3、供了更強(qiáng)有力的工具。 在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶啟動子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3端形成14個(gè)U。U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶依賴的啟動子，其特點(diǎn)是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small ha

4、irpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶啟動子和45T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14 個(gè)U 3 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體（篩選）。二、實(shí)驗(yàn)流程（大致的簡單過程）慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體(自己構(gòu)建)和包裝質(zhì)粒（購入）同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在293T細(xì)胞(

5、購入)中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。 大致的實(shí)驗(yàn)流程： 1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體；（即質(zhì)粒構(gòu)建，已構(gòu)建好，質(zhì)?？梢杂谰帽４妫?2. 對于測序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒； 3. 使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒（購入）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞1，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液； 4. 濃縮、純化病毒液； 5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞(293T細(xì)胞)； 6. 通

6、過定量PCR精確測定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細(xì)胞克隆株具有長期的表達(dá)穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實(shí)驗(yàn)。 三、重組質(zhì)粒構(gòu)建流程 1.基因的獲得: shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)和合成(將正確序列克隆入載體中，退火形成雙鏈，PCR擴(kuò)增) 2.回收 A 酶切產(chǎn)物的膠回收：一般做50-100ul 體系，然后跑電泳回收，回收量一般為30ul。 B PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收原理：首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然

7、后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設(shè)計(jì)獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。 實(shí)驗(yàn)儀器：1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機(jī)4、單面刀片5、恒溫水浴鍋試劑 ：1、DNA回收試劑盒2 2、50TAE3（電泳緩沖液Tris-乙酸）3、ddH2O4、瓊脂糖凝膠4步驟：1）使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（分離DNA作用）5。2）在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去

8、多余的瓊脂糖。放入離心管中。3）按每100mg瓊脂糖加入300600l 溶膠液6的比例加入溶膠液（本實(shí)驗(yàn)加500ul），置55水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，期間每2分鐘顛例混勻一次促溶。4）將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室溫離心1分鐘，倒掉收集管中的液體。再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室溫靜置1分鐘后， 12000rpm 室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室溫離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。7） 12000rpm 室溫空離

9、心1分鐘。8）將吸附柱放入一個(gè)干凈的的離心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后， 12000rpm 室溫離心1分鐘（為提高回收效率可再洗脫一次），將離心管(DNA)貯存于-20。9）瓊脂糖凝膠電泳（鑒定作用）檢測回收產(chǎn)物。 注意事項(xiàng)：1）切膠時(shí)應(yīng)快速操作，在紫外燈下時(shí)間長容易傷害到眼睛；2）溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時(shí)應(yīng)使用長波長紫外燈，切膠時(shí)間盡量短。3）膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。4） 把洗脫液加熱，使用時(shí)有利于提高洗脫液效率3連接器材：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面離心管

10、架，臺式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。 試劑：T 載體，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌dd Water 。操作步驟 ：PCR產(chǎn)物（已純化回收）與T載體直接連接： （1） 事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416C。 （2） 取4個(gè)滅菌的200ul微量離心管，加入：（需要調(diào)整）4ml 目的基因 ；1ml T載體 ；0.5ml T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 連接酶緩沖液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，總量10ml 體系。 （3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C干式恒溫儀（或14C水中）中保溫過夜（12-16h）。

11、 （4） 連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4C冰箱備用。 4. 轉(zhuǎn)化原理：目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0）時(shí)處理快速生長的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。在一定條件下，經(jīng)過連接后的片段與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫，可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞的分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。

12、 目的：連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒。器材：恒溫?fù)u床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機(jī),無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機(jī), 分光光度計(jì),微量移液槍。試劑：1.LB固體和液體培養(yǎng)基7 固體培養(yǎng)基3.100mM CaCl2溶液。4.待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備步驟：1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB液體培養(yǎng)基 ，37振蕩培養(yǎng)過夜（12h左右），直至對數(shù)生長期。LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)23h，至OD600值達(dá)到0.5-0.6之間。3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min。4）4離心10min（4000r/mi

13、n）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡懸浮細(xì)胞，立即冰浴30min7）4離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul一份，4保存。 暫且不用的貯存于-70可保存半年。 取其中一份進(jìn)行轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1）取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42水浴鍋中保溫90s（90s一定要精確，不要搖動試管）3）將試管迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1-2min4）每管加800u l LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h5）取適當(dāng)體積（100ul）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在含有適當(dāng)抗生素

14、的LB固體培養(yǎng)基上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻，室溫正置30min6）倒置平皿37，1216h，出現(xiàn)菌落為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： 1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。 5

15、抽提質(zhì)粒（堿裂解法提取質(zhì)粒DNA)原理： 本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。1）用SDS處理細(xì)菌后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA和染色體DNA。兩種DNA在強(qiáng)堿環(huán)境都會變性。2）當(dāng)加入pH4.8的酸性乙酸鉀降低溶液pH值后，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而染色體DNA分子巨大，難以復(fù)性。3）通過離心，大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)沉淀（SDS的作用下）除去，而質(zhì)粒DNA留在上清中。4）再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及

16、共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時(shí)。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。試劑：1.溶液: 50mM(mmol/L)葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，）。），0.5M EDTA（）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4。2.溶液：0.2N NaOH

17、，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置（NaOH作用是使細(xì)胞裂解）。3.溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，。5M KAc 300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆谩?. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（）1ml，0.5M EDTA（），加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7. 5TBE：Tris堿54g，硼酸，加ddH2O至100

18、0ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存?zhèn)溆谩?溴化乙錠（EB）：10mg/ml 9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20。 10. 6loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳

19、子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5TBE），即可上樣。儀器：(1)塑料離心管架（30孔）；(2) 10、100、1000L微量加樣器；(3) 1.5mL塑料離心管（又稱EPPendorf離心管）；(4)低溫高速離心機(jī)（20 000 rmin）一臺；(5)無菌工作臺(6)高壓鍋，(7)常用玻璃儀器及滴管等。 質(zhì)粒提取步驟：1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。2.取培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g1min，棄上清，將離心管倒置，

20、使液體盡可能流盡。3.將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液（50mM葡萄糖，)，）中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻，（且不至于沉淀）。4.加200l新鮮配制的溶液，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。5.加入150l預(yù)冷的溶液（醋酸甲AcK），將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6.加入450l的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4離心12000g 10min。沒有用PDS沉淀干凈的

21、蛋白質(zhì)置于下層7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4離心12000g15min。預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4離心8000g7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。9.沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩?重組質(zhì)粒克隆的鑒定 1）通過PCR方法鑒定：以重組質(zhì)粒為模板，PCR產(chǎn)物的特異性引物或載體的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳鑒定。 2）酶切鑒定：雙酶切鑒定時(shí)只要出現(xiàn)質(zhì)粒條帶和你的插入片段的目的條帶就行了7. 質(zhì)粒DNA的含量及純度鑒定實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒DNA儀器：(1)

22、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 (2) 可調(diào)微量移液器(3)水平電泳槽 （4）紫外分光光度計(jì)(5)紫外透射儀等試劑：（1）電泳緩沖液：Tris-硼酸（1TBE）pH8.0。（2）加樣緩沖液（6）：0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖（3) 溴化乙錠（EB）溶液：10mg/ml含量測定：紫外吸收法 溴化乙錠熒光強(qiáng)度法純度鑒定：紫外吸收法和瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度的方法有兩種：紫外光吸收法：核酸在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進(jìn)行定量。但有時(shí)也會因?yàn)樗幦芤旱膒H值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。溴化乙錠熒光強(qiáng)

23、度法：當(dāng)DNA含量很低以及樣品中雜質(zhì)含量高時(shí)，會影響紫外光吸收值的測定，這時(shí)，可以采用測定嵌入DNA中溴化乙錠分子受紫外光激發(fā)而發(fā)射出的熒光強(qiáng)度，因?yàn)檫@種熒光的強(qiáng)度與DNA總質(zhì)量數(shù)成正比。測定質(zhì)粒DNA純度的方法瓊脂糖凝膠電泳四、慢病毒包裝流程實(shí)驗(yàn)材料4.1.1、細(xì)胞株：293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM8(含10% FBS)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。4.2.2、菌株：大腸桿菌菌株DH5。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。4.2.3、病毒載體系統(tǒng)組成a) pGC-LV重組載體（已制備好的）；b) pHelper 1.0；c) pHelpe

24、r 2.0 DNA溶液的制備（見上面具體步驟）：質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA 的A260/A280在1.82.0之間。4.2.4、試劑 臺盼蘭、 胎牛血清FBS、DMSO、DMEM、胰酶、Lipofectamine 2000 4.2.5、儀器熒光顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、Plus-20離心超濾裝置 4.2病毒包裝細(xì)胞293T的培養(yǎng)、活細(xì)胞計(jì)數(shù)（臺盼藍(lán)染色）用無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液中加入0.1 ml的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。、細(xì)胞株的凍存1 取培養(yǎng)23天

25、生長旺盛的細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成21062107/ml。2 在1 ml細(xì)胞凍存管中加入0.5 ml細(xì)胞懸液，0.4 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亞砜9(或甘油)，混勻后密封。置41小時(shí)，-202小時(shí)，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。、細(xì)胞復(fù)蘇1 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，應(yīng)帶有防護(hù)眼睛和手套。2 迅速放入盛有37水的水浴中，并不時(shí)搖動，盡快解凍。3 用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺上，吸出細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3 ml含10% FBS（胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基，置溫箱培養(yǎng)。4 次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。、細(xì)胞傳代1 棄去舊培養(yǎng)液，加入5 ml滅菌PBS溶

26、液，輕輕晃動，洗滌細(xì)胞生長面，然后棄去PBS溶液。2 加入2 ml胰酶消化液，消化1- 2 min直到細(xì)胞完全消化下來。3 加入含10%胎牛血清和100 U/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基5 ml，用刻度吸管吹打數(shù)次，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來。4 混勻細(xì)胞后分至兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3 慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染1) 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2 x 107細(xì)胞/20 ml，重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h待細(xì)胞密度達(dá)70%80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，因此需要保證良

27、好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。2) 轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3) 向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pGC-LV載體20 15g，pHelper 2.0載體10 g)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM10混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 ml，在室溫下溫育5分鐘。4) 將Lipofectamine 2000試劑輕柔搖勻，取100l Lipofectamine 2000試劑在另一管中與2.4 ml Opti-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。5) 把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合。6) 混合后

28、，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine 2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7) 將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 , 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8) 培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20 ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。9) 每瓶細(xì)胞中加入含10% 血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml，于37 、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。4.4病毒的收獲及濃縮1 收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)（轉(zhuǎn)染即可為0小時(shí)計(jì)起）的293T細(xì)胞上清液。2 于4 ，4000 g 離心10

29、 min，除去細(xì)胞碎片。3 以0.45 m濾器過濾上清液于40 ml超速離心管中。4 把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中（最多19 ml），蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。5 組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。6 在4000 g離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時(shí)間為10-15分鐘。7 離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。8 將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。9 離心力不超過1000g,時(shí)間為2分鐘。過高轉(zhuǎn)速會導(dǎo)致樣品損失。把離心杯從樣品收集杯上移開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。10 將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80 度長期保存。取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴

30、度測定。4.5 慢病毒滴度測定1) 孔稀釋法測定滴度1測定前一天，為測定滴度所需的細(xì)胞（英茂盛業(yè)公司用的293T細(xì)胞：貼壁生長）鋪板，96孔板，每個(gè)孔加4104個(gè)細(xì)胞，體積為100 l。2根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備710個(gè)無菌的Ep管。在每個(gè)管中加入90 l的無血清培養(yǎng)基。3取待測定的病毒原液10l加入到第一個(gè)管中，混勻后，取10 l加入到第二個(gè)管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。4選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 l培養(yǎng)基，丟棄。加入90 l稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。524小時(shí)后，加入完全培養(yǎng)基100 l。小心操作，不要吹起細(xì)胞。64天后，觀察熒光表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。說

31、明：第一個(gè)Ep管中加入10ul病毒原液，記為1E+1l；第二個(gè)Ep管中進(jìn)行了第一次十倍稀釋,所得病毒原液為第一個(gè)Ep中的1/10，記為1E+0l；第三個(gè)Ep管中進(jìn)行了第二次十倍稀釋，所得病毒原液為第二個(gè)Ep中的1/10，記為1E-1l；依次類推 第七個(gè)Ep管中進(jìn)行了第六次十倍稀釋，所得病毒原液為第六個(gè)Ep中的1/10，記為1E-5l；第八個(gè)Ep管中進(jìn)行了第七次十倍稀釋，所得病毒原液為第七個(gè)Ep中的1/10，記為1E-6l；2) Real time定量PCR法測定滴度樣品制備1. 檢測前一天，對293T細(xì)胞傳代，每個(gè)24孔中加1105個(gè)細(xì)胞，體積為500 l；2. 次日，準(zhǔn)備710個(gè)無菌的Ep管

32、，在每個(gè)管中加入90 l的培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）；3. 取待測定的病毒原液10l加入到第一個(gè)管中，混勻后，取10 l加入到第二個(gè)管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管；4. 選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 l培養(yǎng)基。加入稀釋好的病毒溶液。放入375%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5. 48小時(shí)后，加入新鮮培養(yǎng)基500l。小心操作，不要吹起細(xì)胞；6. 4天后，抽提RNA準(zhǔn)備做RT-qPCR。 總RNA抽提說明：根據(jù)Invitrogen公司的TRIZOL操作說明書進(jìn)行，均為RNase-free操作。1. 去細(xì)胞上清，每孔加入l TRIZOL吹打，室溫靜置5 min，后轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 ml移液管中。2

33、. 每管加入200 l氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置15 min。3. 4，12000 rpm，離心15min。4. 從每管中吸取上清至另一新的1.5 ml 移液管。加入等體積-20預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20沉淀10 min。5. 4，12000 rpm離心10 min后，去上清。6. 加入至少1 ml 4預(yù)冷的75%乙醇，洗滌沉淀及離心管壁。7. 4，10000 rpm離心5 min，棄上清。8. 4，10000 rpm再次離心5 min，吸去殘液，室溫干燥（不需完全干燥）。9. 加入20 l RNase-free水11，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。五、 慢病毒感染目的細(xì)胞

34、慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) A測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時(shí)，需要同時(shí)設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞(HEK293T，Hela）作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。 B在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí),可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。 慢病毒幾乎可以感染所有種類的細(xì)胞。加入puromycin12可以篩選穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系。 puromycin最優(yōu)濃度篩選:每種細(xì)胞對puromycin的敏感性不同，因此，準(zhǔn)備建立穩(wěn)定細(xì)胞系之前，需要確定能夠在3-5天殺死細(xì)胞的最優(yōu)puromycin濃度。方法如下：1. 在6孔板內(nèi)種植細(xì)胞，約

35、2x105/孔，共十孔，CO2孵箱過夜培養(yǎng)。2. 第二天，觀察細(xì)胞密度為80%-90%融合。稀釋puromycin至培養(yǎng)基，按照從1 g/ ml到10 g/ ml，每隔1g/ ml遞增的濃度，加至培養(yǎng)孔內(nèi)。3. 第三天觀察細(xì)胞，每隔一天換一次培養(yǎng)基，最優(yōu)濃度為在3-5天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的濃度。 慢病毒感染細(xì)胞和穩(wěn)定細(xì)胞系篩選第一天：在60mm培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密度為第二天細(xì)胞融合能達(dá)到70%-80%，CO2孵箱過夜培養(yǎng)。第二天：準(zhǔn)備3ml培養(yǎng)基，加入Polybrene13，終濃度為8 g/ ml。將步驟五制備的病毒顆粒0.5 ml加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60mm培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加

36、入含病毒培養(yǎng)基（Polybrene能夠增加病毒感染的效率，然而，有時(shí)候Polybrene對細(xì)胞有毒性。這時(shí)，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene）第三天：病毒感染后24小時(shí)，可以換用含最優(yōu)濃度puromycin的培養(yǎng)基。如果病毒對細(xì)胞有毒性，可以減少感染時(shí)間至4-6小時(shí)，然后換用新鮮培養(yǎng)基，24-48小時(shí)后換加含puromycin的培養(yǎng)基。最好設(shè)立一個(gè)對照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，觀察Polybrene是否對細(xì)胞有毒性；如果Polybrene沒有毒性，還可以加入puromycin，作為puromycin是否有效的對照。第四天以后：每隔一天換用新鮮含puromycin的培養(yǎng)基，以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。待抗性細(xì)胞長滿以后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿，同時(shí)，