灌注后細(xì)胞凋亡分析論文

1、灌注后細(xì)胞凋亡分析論文【論文關(guān)鍵詞】缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述 【論文摘要】細(xì)胞過度凋亡參與了缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的發(fā)生。我國傳統(tǒng)中藥丹參可在細(xì)胞、分子、基因水平調(diào)控IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對IRI具有良好的防治作用。 在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的細(xì)胞死亡形式中，凋亡也是一種常見而重要的形式1-4。組織細(xì)胞一旦壞死，目前人們尚無辦法干預(yù)；但細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制的過程，人們有可能通過干預(yù)死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)，對IRI時(shí)細(xì)胞過度凋亡有

2、抑制作用，本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。 1丹參對IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的抑制作用 Wu.W等5利用原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)實(shí)驗(yàn)觀察到：左大腦中動脈結(jié)扎后24h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆?fàn)詈巳毖獏^(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，2448h達(dá)到高峰；預(yù)先給予丹參則在相應(yīng)部位只見到少量凋亡細(xì)胞；且與對照組比較，24h時(shí)間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡對腦IRI發(fā)揮保護(hù)作用。丹參是否對其他器官也有類似作用目前尚未明了。 2丹參抑制IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)

3、制 21減少蛋白酶表達(dá) 細(xì)胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1-convertingenzyme,ICE)組成的級聯(lián)反應(yīng)。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為175KD的IL-1，屬于ICE蛋白酶超家族。 目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員，根據(jù)其序列同源性分為3個(gè)亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現(xiàn)被稱為半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三個(gè)亞家族分別稱為caspase-1、cas

4、pase-2和caspase-3亞家族。它們的過度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生6。 張金濤等7利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn)，前腦IRI后1d，大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽性反應(yīng)，第3天達(dá)高峰，第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類似的現(xiàn)象，ICE免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達(dá)明顯減少，特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此，作者認(rèn)為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。 22阻斷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 大多數(shù)情況下，來自于細(xì)胞外的誘導(dǎo)因素，如自由基、細(xì)菌、病毒等作用于細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡信號，并通過

5、胞內(nèi)不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DNA片段化斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)6。丹參經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可干預(yù)下列已知的凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而實(shí)現(xiàn)其抗凋亡作用。 221死亡因子及其受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此被稱為死亡因子6。介導(dǎo)它們誘導(dǎo)凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi)，TNF主要由巨噬細(xì)胞(M)分泌。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，丹參不僅可有效抑制

6、M分泌TNF-，還可以在基因水平抑制TNF-在肝、腎、心等組織中的蛋白表達(dá)8,9,10,18。所以，丹參可能通過抑制TNF-的生成和釋放，減少IRI時(shí)細(xì)胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-B還是JNF/AP-1則目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。 222第二信使鈣誘導(dǎo)的凋亡 Ca2+是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中重要的信息分子。Ca2+i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活，DNA片段化。應(yīng)用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測定術(shù)同步觀察H2O2誘導(dǎo)人類肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)凋亡時(shí)不同時(shí)限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的

7、影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：H2O2作用后05h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當(dāng)Ca2+i400nmol/L后1h出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后，Ca2+i持續(xù)升高，早期凋亡細(xì)胞(Annexia-V+)、死亡細(xì)胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細(xì)胞和胞漿或胞核紅染的死亡細(xì)胞。同時(shí)Ca2+i上升了一個(gè)數(shù)量級；在Rax處理組H2O2作用8h后Ca2+i尚未超過400nmol/L，與對照組比較差異顯著(P400nmol/L很可能是細(xì)胞凋亡啟動的早期信號。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，由此可能減少其在核內(nèi)促進(jìn)凋亡基因信號傳遞中的作用及其后引起

8、的細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷。分析其機(jī)理可能是：作為咖啡?？s酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發(fā)生氧化反應(yīng)，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的損傷，減少Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細(xì)胞內(nèi)；因肝細(xì)胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開放所致11。 223由線粒體損傷后啟動的細(xì)胞凋亡新近的研究證實(shí)，由活性氧(ROS)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要觸發(fā)機(jī)制11,12。當(dāng)這些死亡信號到達(dá)線粒體后，首先引起線粒

9、體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白，包括細(xì)胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。IRI時(shí)ROS生成過多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體受損，誘導(dǎo)細(xì)胞過度凋亡6。丹參具有強(qiáng)大的清除自由基、減輕鈣超載、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導(dǎo)因素的產(chǎn)生，阻斷了此通路啟動的細(xì)胞凋亡13-15,17。 23調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞凋亡是級聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。目前已知細(xì)胞凋亡相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種，根據(jù)功能不同分為三類：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl

10、-2，其中對Bcl-2的研究最為詳細(xì)而系統(tǒng)；促進(jìn)凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因，如J-myc、Bclk等。正常情況下，促進(jìn)凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對立統(tǒng)一狀態(tài)，IRI時(shí)這種平衡被打破，組織細(xì)胞凋亡增多2。 張金濤等7報(bào)道BcL-2在前腦缺血2h就有表達(dá)，于6h達(dá)高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說明BcI-2主要在細(xì)胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30min給予后，BcL-2的表達(dá)明顯增加。趙明中等15采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進(jìn)一步證實(shí)復(fù)方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽性表達(dá)數(shù)(PEI)明顯增加，還可使心肌細(xì)胞凋亡指

11、數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復(fù)方丹參滴丸的劑量加大而進(jìn)一步降低(P 綜上所述，丹參作用廣泛，對IRI細(xì)胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過程中因細(xì)胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”，從而表現(xiàn)出對IRI顯著的保護(hù)作用。因此，丹參對減輕IRI來說是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景；同時(shí)丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過度引起的疾病提供了一條新思路。 參考文獻(xiàn) 1冷靜,彭韜,馮振卿,等.大鼠缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的研究.江蘇醫(yī)藥,1998，24(12):865. 2趙明中,陳運(yùn)貞,李媛媛,等.大鼠心肌再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡、Fas基因表達(dá)及

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