當(dāng)歸感染根腐病后CAT活性的變化

1、目錄摘要2關(guān)鍵詞2Abstract .21. 引言：32. 實驗與材料32.1.材料32.2.實驗方法42.2.1 菌懸液的制備42.2.2 材料培養(yǎng)與接種處理42.2.3 當(dāng)歸生理生化指標的測定52.2.3.1 當(dāng)歸體內(nèi)H2O2的測定方法52.2.3.2當(dāng)歸體內(nèi)CAT活性的測定方法52.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析53.結(jié)果分析53.1當(dāng)歸感染根腐病菌后H2O2的變化53.2當(dāng)歸感染根腐病菌后CAT活性的變化64.討論74.1根腐病菌對當(dāng)歸H2O2含量的影響74.2根腐病菌對當(dāng)歸CAT活性的影響7參考文獻8致 謝8 當(dāng)歸（Angelica sinensis）感染根腐病后CAT活性的變化李 亞指導(dǎo)教

2、師：趙慶芳（教授）摘要：當(dāng)歸Angelica sinensis(O liv. ) Diels是傘形科當(dāng)歸屬一種多年生草本植物。其干燥的貯藏根是我國一味常用中藥材，而當(dāng)歸中的岷歸是我省主產(chǎn)中藥材之一。多年來，已進行大面積種植，但產(chǎn)量一直很低，平均畝產(chǎn)最高不過百多斤。因此，在藥用上，長期以來，存在著供不應(yīng)求的矛盾。當(dāng)然，導(dǎo)致當(dāng)歸減產(chǎn)的因素是多方面的，不過應(yīng)該認為當(dāng)歸的根腐病是其主要原因之一。在本實驗中以健康的當(dāng)歸植株為材料，人工接種不同當(dāng)歸根腐病菌，每隔7d采樣測定不同病株體內(nèi)過氧化氫酶（CAT）活性的變化，最終結(jié)果表明，當(dāng)歸感染根腐病菌后，不同病株體內(nèi) CAT活性隨接種時間的延長，呈現(xiàn)出先升高后

3、降低的變化趨勢，并且都在第天達到峰值后下降。關(guān)鍵詞：當(dāng)歸 ； 根腐病菌 ； CAT活性The change of CAT activity in Angelica sinensis after infected with root rot fungusLi YaInstructor: Zhao Qingfang(Professor)Abstract :Angelica sinensis the mbelliferae Angelica perennial herbaceos plants，of which the dry storage root is commonly used in tra

4、ditional Chinese medicine.The Angelica in Min to the province is one of the main producing medicines.It has beenplanted in large area for many years，But the highest average yield is hundred kilos.Therefore，There is a contradiction in short supply Of medicinal for a long time.Certainly，the factors th

5、at lead to theproductionof Angelicain many aspects.however，thinking root rotof Angelica sinensis is one of the main cause.In this experiment we studied the changes of CAT activity in different plants in angelica root rot after infection.The final results show that，When Angelica sinensis are inoculat

6、ed with different strains of root rot， the activities of CAT increase first but then decline along with the passing of the inoculation time， at 7 days CAT reach its peak respectively.Keywords: Angelica sinensis ; root rot fungus; CAT activity1 引言：當(dāng)歸Angelica sinesis (Oliv. )Diels為傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物，其根可入藥，

7、是最常用的中藥之一。是一種高山植物，要求涼爽、濕潤的氣候條件，具有喜肥、怕澇、怕高溫的特性，海拔低的地區(qū)栽培，不易越夏，氣溫過高易死亡，種子在10-25范圍內(nèi)發(fā)芽良好，10-15天出苗，然后進行育苗移栽，第三年即可采挖。多年來在我國已進行大面積栽墻，但產(chǎn)量一直很低，平均畝產(chǎn)最高不過百斤。因此，在藥用上，長期以來，存在著供不應(yīng)求的矛盾。當(dāng)然，導(dǎo)致當(dāng)歸減產(chǎn)的因素是多方面的，不過應(yīng)該認為當(dāng)歸的根腐病是其主要原因之一。我們知道當(dāng)植物遭受逆境脅迫時都會使植物體內(nèi)活性氧增加，對植物造成不可逆的氧化損傷，SOD、 POD 、CAT是抗氧化系統(tǒng)中的保護酶，在清除活性氧自由基，防止氧自由基對細胞造成破壞以及在保

8、護細胞免受氧化損傷中都具有重要的意義，在本文中主要研究當(dāng)歸感染根腐病菌后CAT活性的變化。CAT主要存在于過氧化物酶體與乙醛酸循環(huán)體中，它是生物氧化過程一系列抗氧化酶的終端，是第一個純化和結(jié)晶的抗氧化酶。它可以催化H2O2生成H2O和O2，從而保護膜的正常結(jié)構(gòu)。CAT通過對H2O2的清除還阻遏了Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生.OH，也避免了過多的H2O2向葉綠體內(nèi)滲透而減弱葉綠素的降解反應(yīng)【1】。另外，CAT還是C3植物中清除H2O2的關(guān)鍵酶【2】。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是活性氧重要的代表之一，激素等信號以及生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生

9、和積累。植物在正常生長條件下，H2O2的產(chǎn)生和清除過程基本保持一種精細的平衡狀態(tài)，這樣既保證了植物體內(nèi)H2O2具有一定的生理功能，同時也將其對植物的傷害效應(yīng)降到最低【3】。如果打破H2O2產(chǎn)生和清除的這種平衡，出現(xiàn)H2O2的積累，由于它具有較高的氧化還原活性，所以能引起細胞內(nèi)大分子氧化損傷，如酶、蛋白質(zhì)分子之間或分子內(nèi)不同亞基之間的二硫鍵發(fā)生交鏈，從而使含巰基的多種酶或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體蛋白活性降低，甚至完全失活，最終抑制植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)，影響植物體內(nèi)的調(diào)控和代謝【4】。2 實驗與材料2.1 材料 植物材料：當(dāng)年生泯縣當(dāng)歸種子，購于甘肅省渭源縣藥材市場， 供試菌種：當(dāng)歸根腐病病原菌由實驗室分

10、離自甘肅渭源當(dāng)歸大田中具有典型根腐病癥狀的發(fā)病當(dāng)歸植株，在分離純化并嚴格按照柯赫氏法則作致病性檢測后，保存在PDA斜面培養(yǎng)基上備用，其在GeneBank 基因庫中的序列號為JQ（6號），JQ（8號）5。 儀器設(shè)備：儀器名稱生產(chǎn)廠家/產(chǎn)地Backman冷凍離心機美國eppendorf 微量移液器德國DK-8D型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司HVE-50高壓滅菌鍋Hirayama/日本分析天平Switzerland微波爐格蘭仕制冰機日本三洋公司-80超低溫冰箱美國HARRIS公司紫外-可見分光光度計2.2 實驗方法2.2.1 菌懸液的制備將6號和8號菌種在PDA平板培養(yǎng)基上25恒溫培養(yǎng)6天

11、后，向培養(yǎng)皿中加入20 mL無菌水，用無菌涂棒刮取菌絲，兩層紗布過濾后調(diào)整其孢子濃度，分別制得6號、8號、混合（1:1）的三種菌液濃度均為1106個/mL的孢子懸浮液。2.2.2 材料培養(yǎng)與接種處理取一定量的飽滿、大小均勻的當(dāng)歸種子，去翅后放入2530的溫水中浸泡24 h，再放入到3%的NaClO溶液中消毒處理15 min，用清水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3次后，然后在每盆土壤已高溫滅菌的小花盆中種植10個處理過的種子，共10盆，光照培養(yǎng)39 d（22光照16 h，18黑暗培養(yǎng)8 h）。待當(dāng)歸種子子葉完全舒展，幼苗長出3片真葉時，用蒸餾水完全澆濕每個花盆土壤，挑選拔出健康完整、大小均勻的當(dāng)歸幼苗

12、，將根部用自來水沖洗干凈后放入10 mol/L次氯酸鈉溶液中殺菌10 min，再用無菌水沖洗3次，栽種于直徑為12 cm高15 cm的土壤經(jīng)高溫滅菌過的花盆中，每盆一株，共15盆，在室溫下培養(yǎng)，待幼苗生長健壯株高約為15 cm左右時進行人工接種處理，用傷根后灌根的方法，每盆當(dāng)歸根部用滅菌刀片造成33 mm的輕微傷口后，分別灌入6號、8號、混合（1:1）三種菌液濃度均為1106個/mL的孢子懸浮液各50 mL，以滅菌水（CK）處理為對照，每個處理接種3盆，總共12盆，接種后黑暗保濕培養(yǎng)24小時，然后在室溫下正常光照培養(yǎng)（室內(nèi)溫度為1925），每隔45 d澆一次水，保持土壤濕度為5060%。在接種

13、后第0 d、7 d、14 d、21 d 、28d分別取樣，每處理相同時間采集相同部位的葉片進行生理指標測定6。2.2.3 當(dāng)歸生理生化指標的測定2.2.3.1 當(dāng)歸體內(nèi)H2O2的測定方法H2O2含量的測定參照 Sergiev7的方法。取當(dāng)歸植株相同部位稱取0.5 g葉片，加入預(yù)冷的5mL 0.1%的三氯乙酸( TCA )研磨，后離心12 000 r 20 min，取上清液加以備用。另取試管加入0.7mL 10 mmolL-1的磷酸緩沖液和1.4 mL 1molL-1的碘化鉀后，再加入0 .7 mL上清液混勻，在390 nm處用分光光度計測其OD值，單位以 ngg-1Fw表示。2.2.3.2當(dāng)歸

14、體內(nèi)CAT活性的測定方法CAT活性的測定參照 Aebi8的方法。取當(dāng)歸植株相同部位稱取0.5 g葉片，加入2 mL預(yù)冷的50 mmolL-1 PBS (pH7.8)緩沖液，內(nèi)含有0.1% PVP、0.1 mmol/L EDTA，冰浴研磨后4離心12000 r30 min，取上清液加以備用。另取試管加入3 mL 50 mmolL-1PBS（pH7.0）緩沖液，再加入100 L上清液，在25C下溫育5 min后，加40 L 0.05% H2O2啟動反應(yīng)，在240 nm處以20 s為間隔作2 min的時間掃描，測定其OD值，以1 min內(nèi)OD240減少0.1為1個CAT酶活性單位，以(gmin)-1

15、表示。2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析以上處理和對照均設(shè)三個重復(fù)，每次每項指標測定三次，取其平均值，用Microsoft Excel 2003軟件作圖及進行數(shù)據(jù)分析，用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，并用CoreIDRAW 9 對各圖進行了處理。3 結(jié)果分析3.1當(dāng)歸感染根腐病菌后H2O2的變化圖1.當(dāng)歸接種根腐病菌后H2O2含量變化Fig 1. Changes of SOD in Angelica sinensis infected with root rot fungus中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值標準誤差，不同字母表示同一時間不同處理間存在顯著差異（P0.05）當(dāng)歸感染根腐病菌后，葉片

16、內(nèi)H2O2含量的變化如圖1所示，隨著接種時間的延長各實驗組H2O2含量整體上呈現(xiàn)上升的趨勢，只有對照組基本保持不變。如圖所示，在接種后014d里，各實驗組H2O2含量開始有所增加，其中8號菌的增量比6號菌與它倆混合菌增量小，并且增長幅度不大。第14 d之后各實驗組H2O2含量增加幅度逐漸增大，第21 d較第14 d時H2O2含量顯著增加（P0.05），到第28 d時達到最大，分別為72.58 ngg-1(6號)、67.84 ngg-1(8號)、77.30 ngg-1(混合)，與接種前(18.40 ngg-1)相比，分別是接種前的3.94倍、3.69倍、4.20倍，差異極顯著（P0.01）；與對

17、照組(23.36 ngg-1)相比，分別增加了210.70%、190.41%、230.91%，差異極顯著（P0.01），其中混合菌侵染的當(dāng)歸H2O2含量最高。 3.2當(dāng)歸感染根腐病菌后CAT活性的變化圖2.當(dāng)歸接種根腐病菌后CAT含量變化Fig 2. Changes of POD in Angelica sinensis infected with root rot fungus 當(dāng)歸植株接種根腐病不同致病菌后，體內(nèi) CAT活性變化整體上仍呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，如圖2所示接種后0-7d內(nèi)CAT酶活性急劇上升，在第7d時達到了峰值，整體上仍呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，為336.13 U

18、(gmin)-1（6號）、287.30 U(gmin)-1（8號）、364.18 U(gmin)-1（混合），與接種(152.50 U(gmin)-1)前相比，分別是接種前的2.20倍、1.86倍、2.39倍，差異極顯著（P0.01）；與對照組(225.49 U(gmin)-1)相比，分別比對照增加了49.07%、27.41%、61.51%，差異顯著（P0.05），且第7 d時不同病株間CAT活性也差異顯著（P0.05）。第7 d之后CAT活性開始下降，第14 d較第7 d 時CAT活性顯著下降（ P0.05 ），第28 d時降為最低，為173.25 U(gmin)-1(6號)、 205.8

19、U(gmin)-1(8號)、 168.57 U(gmin)-1(混合），與對照組(187.52 U(gmin)-1)相比，分別是對照的92.39%、109.75%、89.89%。 4 討論4.1 根腐病菌對當(dāng)歸H2O2含量的影響過氧化氫是活性氧重要的代表之一，作為植物體內(nèi)活性氧的一種，其含量積累過多會對植物細胞產(chǎn)生傷害，研究認為H2O2對植物的傷害有2個方面，一方面可能與其本身的毒害有關(guān)，H2O2可以抑制Calvin循環(huán)中的酶，降低葉綠體中的AsA含量，氧化鐵氧還素9；另一方面可能是H2O2與O2-相互反應(yīng)形成活性最強的OH ，可直接引發(fā)脂質(zhì)過氧化，嚴重時導(dǎo)致植物細胞死亡。同時H2O2也可作為

20、第二信使來激活防衛(wèi)基因的表達，提高植物的抗性。本實驗中，當(dāng)歸接種根腐病菌后，在脅迫前期由于抗氧化酶活性的迅速升高，使H2O2含量增加不明顯，到14 d時，H2O2發(fā)生明顯積累，到后期由于植株抗氧化能力的減弱及當(dāng)歸生理代謝的變化，使H2O2大量積累，對當(dāng)歸產(chǎn)生更大的傷害，其中混合侵染的當(dāng)歸葉片中H2O2積累最多。4.2 根腐病菌對當(dāng)歸CAT活性的影響 CAT是植物體內(nèi)控制H2O2的水平和植物細胞的氧還平衡的重要酶類。CAT活性降低就會導(dǎo)致H2O2增加，GSH(Glutathione)庫氧化，抗壞血酸減少，使植物不能產(chǎn)生足夠的還原力，不能持續(xù)進行抗壞血酸谷胱甘肽再循環(huán)，破壞細胞內(nèi)的氧還平衡【10】

21、；CAT活性低的植物對鹽和除草劑等環(huán)境脅迫特別敏感，離子滲漏、膜脂過氧化加重，光合色素破壞，導(dǎo)致光合活性和PSII效率降低【11】。根腐病菌侵染當(dāng)歸后，葉片CAT活性隨接種時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，說明根腐病菌的侵染激活了植物的防御酶系，使當(dāng)歸植株體內(nèi)CAT活性迅速升高，抗氧化酶活性的升高是植株抵抗根腐病菌侵染的一種抗性反應(yīng)，有利于活性氧的清除和抗性物質(zhì)的形成，從而進一步阻止活性氧的侵入與擴展，活性氧清除酶活性的變化是根腐病菌對當(dāng)歸病害脅迫的生理響應(yīng)。 參考文獻1陳金峰，王宮南，程素滿 . 過氧化氫酶在植物脅迫響應(yīng)中的功能研究進展J.西北植物學(xué)報，2008，28(1):0188-01

22、932南芝潤，范月仙 . 植物過氧化氫酶的研究進展J.安徽農(nóng)學(xué)通報.2008，14(5)3宋鳳鳴，鄭重，葛秀春 . 活性氧及膜脂過氧化在植物病原物互作中的作用J . 植物生理學(xué)通訊，1996，32(5): 377-385.4杜秀敏等.植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機制J.生物工程學(xué)報，2001，17(2):121-1255 趙文考. 當(dāng)歸（Angelica sinensis）根腐病致病菌的分離與鑒定D蘭州：西北師范大學(xué)，2012.6趙慶芳，張玉芳，唐文菊，等.：當(dāng)歸感染根腐病菌后生理活性變化的研究J .西北師范大學(xué)學(xué)報，2014，50 (2)7李合生，孫群， 趙世杰， 等. 植物生理生化實驗原理及技術(shù)M. 北京: 高等教育出版2