細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的注意事項(xiàng)及試劑配制

1、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的考前須知及試劑配制國(guó)一.常用設(shè)備準(zhǔn)備室的設(shè)備：?jiǎn)握麴s水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜放置未消毒 物品、儲(chǔ)品規(guī)放置消毒過(guò)的物品、包裝臺(tái)。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平稱(chēng)量藥品、PH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)用液PH值、磁力攪拌器配置溶液室攪拌溶液。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲(chǔ)品柜存放雜物、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱-80 C、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄。必須放在無(wú)菌間的 設(shè)備:離心機(jī)收集細(xì)胞、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO孵箱孵育培養(yǎng)物、 水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4 C冰箱放置serum和培養(yǎng)用液。二. 無(wú)菌操作無(wú)菌室的滅菌：1. 定期清掃無(wú)菌室：每周清掃

2、一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等， 然后用3%。來(lái)蘇爾或者新潔爾滅或者0.5 %過(guò)氧乙酸擦拭。2. CC2孵箱培養(yǎng)箱滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者 0.5 %過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射3. 實(shí)驗(yàn)前滅菌：翻開(kāi)紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4. 實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75%酒精3%o新潔爾滅擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的 載物臺(tái)。實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：1. 肥皂洗手。2. 穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3. 用75%酒精棉球擦凈雙手。無(wú)菌操作的演示：1. 但凡帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75%酒 精擦拭瓶子的外外表2

3、. 靠近酒精燈火焰操作。3. 器皿使用前必須過(guò)火滅菌4. 繼續(xù)使用的器皿如瓶蓋、滴管要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。5. 各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6. 吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。三. 器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：1新的玻璃器皿的洗消：1. 自來(lái)水刷洗，除去灰塵。2. 烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5%稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、 鉛、砷等物。3. 刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來(lái)水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來(lái)水沖干凈 后用烤箱烘干。4. 泡酸、清洗：用清潔液重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml浸 泡1

4、2小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來(lái)水沖洗 15次，最后蒸餾水沖洗3-5 次和用雙蒸水過(guò)3次。5. 烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙油光紙包裝。6. 高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，翻開(kāi)開(kāi)關(guān)和平安閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉平安閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。7. 高壓消毒后烘干2舊的玻璃器皿的洗消：1 刷洗、烘干：使用過(guò)的玻璃器皿可直接泡入來(lái)蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過(guò) 來(lái)蘇爾溶液洗滌劑的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。2. 泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液酸液，12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來(lái)水沖洗防止蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗，再用蒸餾水沖洗3次。3.

5、烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙油光紙等包裝，以便于消 毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。4. 高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，翻開(kāi)開(kāi)關(guān)和平安閥，隨著溫度的上升平安閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉平安閥，氣壓 表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開(kāi)關(guān)維持20-30分鐘即可。玻 璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上5. 烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。 金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來(lái)水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來(lái)水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放 入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)

6、15磅高壓30分鐘消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來(lái)水和蒸餾水沖 干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：1 .針式濾器帽不能泡酸液,用NaOHfi 6-12小時(shí)，或者煮沸20分鐘，在包裝之前 要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上凹向上，然后將螺旋稍微擰松一些， 放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使 用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。2. 膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘用過(guò)的膠塞只要用沸水處理30 分鐘，自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30分鐘，再用自來(lái)水，蒸餾水， 三蒸水洗凈，烘干

7、。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)切記時(shí)間 不能過(guò)長(zhǎng)，自來(lái)水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30分鐘，再用自來(lái)水，蒸 餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。4. 膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。5. 塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：6. 其他消毒方法：有的物品既不能枯燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用 70%酒精 浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿翻開(kāi)蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線下消毒。 也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。 用20000- 100000rad的r射

8、線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫(xiě)墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫(xiě)墨水， 在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水 不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫(xiě)墨水的配 制：氯化鉆(CoCL 6H2o)2g，30%鹽酸10m1,蒸餾水88m1考前須知：1. 嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高 壓時(shí)燒干，水不能過(guò)多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏瑁?會(huì)降低高壓消毒效果。檢查安 全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。2. 安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否那么起不到過(guò) 濾的作用。3. 注意

9、人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷 害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面， 會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸 液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。四. 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素純潔水系統(tǒng)、電子 天平、PH計(jì)、 磁力攪拌器。具體步驟：(1) 水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純潔，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、 三蒸水或純潔水PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS女口： Hanks, D-Hanks液的配制)：1. 溶解定容：將藥品(NaCI 8.0g，KCl 0.2g，NaHPO HO1.5

10、6g，KHPO 0. 2g ) 倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn) 確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。2. 移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi)，蓋上膠帽，并插 上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸 發(fā)掉的水份。(3) 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或 者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反響不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用 時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37C時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶 時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消

11、化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+ Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+ Mg2+ 的BSS女口： D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終 止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。1. 稱(chēng)取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25 %，用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取粉劑溶入 小燒杯中的雙蒸水(假設(shè)用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右)或PBS( D-hanks)液中。 攪拌混勻，置于4C內(nèi)過(guò)夜。2. 用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以備使用。青、鏈霉素溶液的配制于消毒1. 所用純潔水(

12、雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。2. 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙 蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。3. 使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位=1微克？ .RPMI1640的制備與消毒：1. 溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑參加培養(yǎng)液體積 2/3的雙蒸水中,并用 雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并參加培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙猓?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品然后用注射器向培養(yǎng)基中參加配制好的青鏈霉 素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然

13、后用一個(gè)當(dāng)量的鹽 酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。2. 安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和 支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3. 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。4. 分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于 4C冰箱內(nèi)待用。5. 使用前要向100ml培養(yǎng)液中參加1ml谷氨酰胺溶液(4C時(shí)兩周有效)。血清的滅活：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在 56r水浴中滅火30分鐘后，再 經(jīng)過(guò)抽濾方可參加培中使用。(7) HEPES 溶液：HEPES勺化學(xué)全稱(chēng)位羥乙基呱嗪乙硫磺酸

14、(N -a-hydroxythylpiperazine-N-ethanesulfanic acid )。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng) 時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含 20mmol/LHEPES卩可到達(dá)緩沖能力。1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取HEPTS 238.3g,參加新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4C保 存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPE為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制， 但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES勺終濃度仍然為20mmol/L。如：稱(chēng)取4.766克HEPES 溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除

15、菌后可完全(20ml)參加1L培養(yǎng)液中，或者每100ml 培養(yǎng)液中參加2ml即可。(8) 谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4 r下放置1周可分解50%，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20 r冰箱中保存，用前參加培養(yǎng)液。 加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4r冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新參加原來(lái)的谷氨酰 胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液 貯存，用時(shí)參加培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺 2.9

16、22g溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20 r保存， 使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中參加1ml谷氨酰胺溶液。(9) 肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素參加全培養(yǎng)液中最終濃度為 50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為-C。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中參加1ml (精確可參加0.9ml)即可。(10) I型膠原酶：0.1 %I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)镮型膠原酶 分子顆粒

17、比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20 C保存。(11) .明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1 %明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備 過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱(chēng)量 0.1克(配成100ml 溶液)一即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中，4C保存。(12) 其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，考前須知：1. 配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。2. 安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑 0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.4

18、5的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。3. 配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要參加小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了 保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。五. 細(xì)胞傳代培養(yǎng)(消化法)具體操作：(1) 傳代前準(zhǔn)備：1. 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2. 用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。3. 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4. 點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。5. 準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。6. 取出

19、預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好前方 能放入超凈臺(tái)內(nèi)。7. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯 微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。8. 翻開(kāi)瓶口：將各瓶口翻開(kāi)，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。胰蛋白酶消化；1. 參加消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用 PBS清洗(沖洗)，參加適量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最正確消化溫度是37C。2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，假設(shè)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之 間不再連接成片，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞消化適度。3. 吸棄消化液參加培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，參加新鮮的培養(yǎng)液。(3)吹打分散細(xì)胞

20、：1. 吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2. 吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。3. 平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。 4棄上清液，參加新培養(yǎng)液：棄去上清液，參加 2ml培養(yǎng)液，用滴管輕 輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。(4) 分裝稀釋細(xì)胞：1. 分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，參加適量培養(yǎng)基旋緊 瓶蓋。2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密 度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于 5X 105/ml。最后要 做好標(biāo)記。(5) 繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，

21、放入 CO培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積 25% 時(shí)為一個(gè)+,占50%為+ + ,占75%時(shí)為+ + +。傳代細(xì)胞培養(yǎng)考前須知：1. 嚴(yán)格的無(wú)菌操作2. 適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類(lèi)、 配制時(shí)間、參加培養(yǎng)瓶中的 量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮， 連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA(0.02 %乙二胺四乙酸二鈉)消化液配方：EDTA 0.20g, NaCl 8.00g，KCl 0.20g， KH2PQ0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5 % 酚紅4ml，參加蒸餾水定容

22、至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié) PH值 到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否那么再培養(yǎng)時(shí) 細(xì)胞容易脫壁。六. 細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原那么-快速融化：必須將凍存在-196 C液氮中的細(xì)胞快速融化至37C,使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，防止冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié) 晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作(1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1. 將水浴鍋預(yù)熱至37 C2. 用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。3. 在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。取出凍存管：1. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。2. 從液氮罐中取出細(xì)

23、胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。迅速解凍：1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)， 使管中的液體迅速融化。2. 約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外 壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。平衡離心：用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min(5)制備細(xì)胞懸液：1. 吸棄上清液。2. 向離心管內(nèi)參加10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。6細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5X 105/ml為宜。7培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入 37C和 5%CO的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)或者24-48小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)

24、間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37 C。2. 水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。3. 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞喪失。4. 一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。七. 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)， 通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞 的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：1準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按照?傳代 細(xì)胞培養(yǎng)消化法?中的傳代方法繁 殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。2細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25 %的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，參加培養(yǎng)液 或Hanks液或

25、PBS等平衡鹽溶液，吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。3細(xì)胞計(jì)數(shù)：1. 蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。2. 制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸 5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，參加5 滴臺(tái)盼藍(lán)染液0.4 %或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，參加染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。3. 將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿 蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿(mǎn)懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓 懸液流入旁邊槽中。4. 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并 移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻每個(gè)大格含有 16個(gè)中鉻

26、中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。5. 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml =四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4X2X104說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了 4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1： 1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm 長(zhǎng)X 1.0mm寬X 0.1mm 高=0.1mm 而 1ml = 1000miri4細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：1. 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2. 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否那么影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。3. 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸

27、液，尤其時(shí)屢次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每 次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；4. 數(shù)細(xì)胞的原那么是只數(shù)完整的細(xì)胞，假設(shè)細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞 計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，那么只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否那么?重新計(jì)數(shù)。(5) 初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。(6) 本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱(chēng)取4克臺(tái)盼藍(lán)，參加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升, 用濾紙過(guò)濾，4 C保存。使用液：使用時(shí)，用PBS

28、稀釋母液至0.4 %即可。八. 細(xì)胞的凍存1. 先將凍存管放入4C冰箱，約40min。2. 接著置于-20 C冰箱，約30-60min。3. 置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。4. 置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。 考前須知：1. 使用DMSOU，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMS對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。2. 不宜將凍存細(xì)胞放置在0C-60 C這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生 在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)。3. 注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

29、細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)國(guó)細(xì)胞凍存、解凍方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)一、細(xì)胞冷凍保存1、材料：生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO(Sigma D-2650)、無(wú)菌塑料冷凍保存管 (Nalgene5000-0020)、0.4 %( w/v) trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片、等速降溫 機(jī)(KRYO10Seriesll)2、冷凍保存方法：(1 )傳統(tǒng)方法：冷存管置于4C 10分鐘-20C 30分鐘-80C 1618小時(shí)(或隔夜)- 液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20C不可超過(guò)1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大， 造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入

30、-80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。(2) 程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1-3C /分鐘之速度由室溫降至(-80C以下)-120C，再放在液氮槽 vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。3、步驟：(1) 冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。(2) 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，參加培養(yǎng)基、血清，逐滴參加二甲基亞 砜(DMSO至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。(3) 離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù) 細(xì)胞濃度及凍前存活率。(4 )取與細(xì)

31、胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴參加細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO最后濃度為510%)，使細(xì)胞濃度為15X 106cells/ml ,混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，12ml/vial ，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱(chēng)、代 數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。4、考前須知：(1) 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為8090%致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。(2) 細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無(wú)限時(shí)間，而不會(huì)影響細(xì)胞活力；在-70度可保存數(shù)月。(3) 注

32、意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSC應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micronFGLP Telflon過(guò)濾或是直接購(gòu)置無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510ml小體積分裝，4C避光保存，勿作屢次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可防止DMSOt接參加時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴參加細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲，可降低細(xì)胞受損。DMSOT能引起局部白血病細(xì)胞株 的分化，可換用10%甘油凍存。(4 )冷凍保存之細(xì)胞濃度： normal human fibroblast:13X

33、106cells/ml hybridoma:13X 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24小時(shí)后死去。 adhere nt tumor lin es:57X 106，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Ade nocarci noma 解凍后須較高之濃度，而 HeLa只需 13X 106cells/ml other suspensions:510X 106cells/ml ， human lymphocyte 須至少 5X 106cells/ml。(5) 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10% DMSO假設(shè)是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup

34、 culture，以防止冷凍失敗。(6 )凍存可用10%90%勺血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4度時(shí))，復(fù)蘇存活率在 80%- 90%以上，對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞，以 90%血清 凍存更為有效。二、冷凍細(xì)胞活化1、 冷凍細(xì)胞之活化原那么為快速解凍，以防止冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。2、 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單 株抗體或是其它蛋白質(zhì))。3、材料37 C恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器4、步驟:(1 )操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂

35、之傷害。(2) 自液氮或干冰容器中取岀冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松 掉。(3) 將新鮮培養(yǎng)基置于 37C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。(4) 取岀冷凍管，立即放入37C水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在 1分鐘內(nèi)全部融化， 以70% 酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。(5 )取岀解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩參加有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:101:15)，混合均勻，放入C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取 0.1ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。(6) 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑 (例如DMSC或glycerol)，依細(xì)胞種類(lèi)而異，一般而言， 大都不

36、需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟假設(shè)要立即去除，那么將解凍之細(xì)胞懸浮液參加含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，參加新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(7) 假設(shè)不需立即去除冷凍保存劑，那么在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試1、原理：(1) 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercou nter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。(2) 血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中 4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mn。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mmZ 0.1mm=1.0x10 -4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)， 再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。(3) 存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion