聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是 60C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72 C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖 （5-3）的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn) 行控制。PCF原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性

2、解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。 在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。 因此，通過(guò)溫度變化控制 DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶耐熱DNA聚合酶-Taq酶可以耐受90 C以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于 DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的 寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA

3、經(jīng)加熱至93 C左右一定時(shí)間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 C左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合 ； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在 72 C、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） 的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得 更多的 半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2

4、4分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò) 目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。反應(yīng)準(zhǔn)備聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR反應(yīng)體系10X擴(kuò)增緩沖液10glP-F0.5ul4種dNTPB合物（終濃度）各 100 250卩 mol/LP-R0.5ul引物（終濃度）各520卩mol/LGo Taq 酶5ul模板DNA0.1 2 gg模板DNA0.5ulTaq DNA聚合酶5 10 UH2O3.5ulMg2+ （終濃度）1 3mmol/L補(bǔ)加雙蒸水100 gl其中dNTP、弓I物、模板 DNA、Taq DNA聚合酶以及 Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù) 實(shí)驗(yàn)調(diào)整。PCR反應(yīng)五要素：引物（PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段

5、RNA鏈）、酶、dNTP、 模板和緩沖液（其中需要Mg2+ ）。PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。模板即擴(kuò)增用的 DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即 鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有 DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)

6、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條 DNA單鏈為基準(zhǔn)（常 以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段 5端上的一小段DNA序列相同；3端引物 與位于待擴(kuò)增片段 3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非 特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3端的互補(bǔ)重疊。 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超

7、過(guò)70%，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。 引物的5端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，弓I入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子 等。模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù) PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也 可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和蛋白酶K

8、處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制 DNA ,經(jīng)酚、 氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作 PCR反應(yīng)模板。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)的控制 PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子關(guān)于PCR反應(yīng)條件控制 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA 聚合酶 2.5U(100ul ) 引物濃度一般為0.10.5umol/L 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時(shí)間 95 C, 30s退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 C左右，一般在4555 C延伸溫度和時(shí)間 72 C , 1min/kb(10

9、kb 內(nèi))Tm 值=4(G+C) +2(A+T)循環(huán)次數(shù)：一般為2530次。循環(huán)數(shù)決定 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加 循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增 加，出現(xiàn)了所謂的平臺(tái)期”。PCR reacti on volumeName of gRNAR3M3(200ng/ul)R2M2(200ng/ul)Positive con trol(12)Ge nome DNA(1-5ul) (50-100ng)0.60.60.6Primer F (10uM)0.70.

10、70.7Primer R (10uM)0.70.70.7Go Taq555Nucleasesfree water to 15ul1. PCR條件94 C2minu tesin itial den aturati on94 C30sden aturati on57 C20sL_34 Cycleann eali ng72 C1mi nuteexte nsion72 C5minu tesfinal exte nsion14Cforeverrefrigerati on聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)參數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)預(yù)變性模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對(duì) PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參 考試劑說(shuō)明書(shū)

11、，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性步驟循環(huán)中一般95 C,30秒足以使各種靶 DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步 驟時(shí)間變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物退火退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物延伸引物延伸一般在72 C進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度 較高時(shí),本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為

12、 1min/kbp。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)數(shù)大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最后延伸在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在 72 C維持10-30分鐘.使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退 火成雙鏈。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA變性(90 C -96 C)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈 DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)退火(60 C -65 C)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸(70 C -75 C):在Taq酶(在72 C左右，活性最佳梯度 PCR儀)的作用下，以dNTP 為原料，從引物的 3端開(kāi)始以從5

13、宀端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很 短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退 火和延伸同時(shí)在 60 C -65 C間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素(溴化乙錠，EB )染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手段。電泳法檢測(cè)特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜?jiǎn)捷易行，成為了主流檢測(cè)方法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)特點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR反應(yīng)的特異

14、性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合； 堿基配對(duì)原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； 靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的 特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶 基因片段 也就能 保持很高的正確度。再通過(guò)選擇 特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的， 能將皮克（pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò) 增到微克（卩g二6）水平。能從10

15、0萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為 3個(gè)細(xì)菌。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在 DNA擴(kuò)增液 和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在 24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用 電 泳分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。常見(jiàn)問(wèn)題PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消

16、失。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)假陰性不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有 模板核酸的制備， 引物的質(zhì)量與特異性， 酶的質(zhì)量及溴 乙錠的使用，PCR循環(huán)條件。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì), 化除凈，特別是染色體中的組蛋白， 變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)， 模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。 模板核酸 不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)陰性需注意的是有時(shí)忘加 Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想

17、、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看0D值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)， 而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。 如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)，電泳檢測(cè)，降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很

18、大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響 PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使 PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCR擴(kuò)增采用的體積為 20ul、30ul、50ul或100ul，應(yīng)用 多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì) PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物 與模板的結(jié)合而降低 PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水 溶鍋內(nèi)的變性、退火和延

19、伸溫度，這也是 PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失， 影響引物與模板特異性結(jié)合， 或因靶序列某 段 缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)假陽(yáng)性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需 重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉 污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入

20、 加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所 用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短， 但有一定的 同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物 聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、 退火溫度過(guò)低，及PC

21、R循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。 其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源 的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93 C變性，65 C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減 少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低 Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

22、反應(yīng)克隆 PCR產(chǎn)物1）克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？2） 最佳插入片段：載體必需實(shí)驗(yàn)確定。1:1 （插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù) 比1 : 8或8 : 1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用 5ul 2X連接液，50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss 單位的T4連接酶，插入片段共 10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4 C過(guò)夜。在這2種溫度下，缺 T-凸出端的載體會(huì)自連， 產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效 率，需4 C過(guò)夜。2）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化?如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。 如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很

23、高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3）如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋?zhuān)?ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul 后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生 1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA 的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含

24、10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000 克隆 X103 ng /鋪板 1 ng DNA ug=10 6cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10 8cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。C） 如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟 108cfu/ug感 受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去 T。可能是連接酶污染了 核酸酶T4DNA連接酶（M1801 , M1804， M1794 ）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy 載體，連接pGEM-T正

25、對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì) 胞（108cfu/ug ），按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40 藍(lán)斑，沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。4）對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4C過(guò)夜。B）插入片段帶有污染，使 3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑， 插入片段污染有核酸酶，使 pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。C） 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段

26、，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV 過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復(fù)功能的耐熱 DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú) A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和 核苷酸可在末端加 A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042 ）。E）高度重復(fù)序列 可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10 X擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol

27、模板DNA 0.12ugTaq DNA 聚合酶 2.5uMg2+1. 5mmol/L加雙或三蒸水至 100ulPCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+弓I物：弓I物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原則： 引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴(kuò)增跨度：以 200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基：參照引物設(shè)計(jì)的基本原則 避免引物內(nèi)

28、部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致 PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1lumol或10100pmol ,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好， 引物濃度偏 高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成 二聚體的機(jī)會(huì)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)

29、，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul 時(shí)），濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易 變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后， 以1M NaOH或1M Tris。 HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20 C冰凍保存。多次凍融會(huì)使 dNTP 降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意 4種dNTP的濃度要相等 （等摩

30、爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶K來(lái)消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶 解細(xì)胞膜上的脂類(lèi)與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR反應(yīng)。一般

31、臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解 病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng) 特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于 PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫

32、度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn) 反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095 C變性，再迅速冷卻至 4060 C,引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075 C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、 退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94 C變性，65 C左右退火與延伸（此溫度 Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。 變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93 C94 C 1min足以使模板 DNA變性，若低于93 C則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過(guò) 高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響

33、。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40 C60 C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。 退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度， 還有靶基序列的長(zhǎng)度。 對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50% 的引物，55 C為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（510 C ）在Tm值允許范圍內(nèi)，

34、選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 C 150核苷酸/S/酶分子 70 C 60核苷酸/S/酶分子55 C 24核苷酸/S/酶分子高于90 C時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075 C之間，常用溫度為 72 C，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb 以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min ;擴(kuò)增10Kb需

35、延伸至15min。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)各種變體1. 遞減PCR (touchdown PCR):前幾循環(huán)溫度逐漸下降。2. 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR):以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的 DNA為模板，由此產(chǎn)生出來(lái)的 DNA不帶有內(nèi)含子(基因中不具意義的段落)，常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。3. 熱啟動(dòng)PCR(hot start PCR):以高熱活化型核酸聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，減少非專(zhuān)一性產(chǎn)物。4. 即時(shí)PCR(real-time PCR) : PCR過(guò)程中利用螢光探針或染料定量檢測(cè)，又稱(chēng)定量 PCR(qua ntitative PCR)。5

36、. 巢式PCR(nested PCR):先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高 特異性引物擴(kuò)增。6. 多重PCR (multiplex PCR):在同一個(gè)管中使用多組引物。7. 復(fù)原條件PCR(reconditioning PCR): PCR產(chǎn)物稀釋10倍后重新放入原濃度的引物和dNTP等循環(huán)3次，以消除產(chǎn)物中的異二聚體。8. dsRNA 合成(dsRNA replicator):合并使用 high-fidelity DNA polymersae 、T7RNA 聚合酶與Phi6 RNA replicase ;從雙股 DNA轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的雙股 RNA(dsRNA)?？蓱?yīng)用于 RNAi實(shí)

37、驗(yàn)操作。9. COLD-PCR( co-amplification at lowerdenaturation temperature-PCR):用以檢測(cè)突變或特殊等位基因的 PCR應(yīng)用技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)臨床應(yīng)用用于治療感染性疾病，腫瘤及遺傳病聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)感染性疾病PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個(gè)病原體存在， PCR就可以檢測(cè)到。一般實(shí)驗(yàn)室也能檢出 10100基因拷貝，而目 前病原體抗原檢測(cè)方法一般需要 105-7個(gè)病原體才可檢測(cè)到。 PCR對(duì)病原體的檢測(cè)解決了 免疫學(xué)檢測(cè)的 窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。定量PCR研究

38、資料已表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。許多研究表明，人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染后，潛伏期長(zhǎng)短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關(guān)；也有研究表明，HIV病毒載量低于一定值時(shí)， 沒(méi)有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素治療對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)腫瘤癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多 腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。 PCR技術(shù)不但能 有效的檢測(cè)基因的突變， 而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量， 可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、 分型、 分期和預(yù)后判斷。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測(cè)到原癌基因易位導(dǎo)致的