微陣列分析導論課件

1、微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件生物芯片原理與技術生物芯片原理與技術微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件課程學時安排課程學時安排u學時：50學時u安排：講課34學時，實驗16學時u學分：3分u成績：考試占70，實驗和出勤占30微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件生物芯片相關書籍 et al. 2005微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件在許多情況下，生物在許多情況下，生物學問題最終的解決都學問題最終的解決都源于技術上的突破。源于技術上的突破。 Mark Schena 微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件 本書共分為十六章，分屆于三大部本書共分為十六章，分屆于三大部分，第一部分為分，第一部分

2、為基礎知識基礎知識，包括概述、，包括概述、微陣列基因芯片制備和檢測技術以及統(tǒng)微陣列基因芯片制備和檢測技術以及統(tǒng)計學基礎；第二部分內(nèi)容是計學基礎；第二部分內(nèi)容是數(shù)據(jù)處理方數(shù)據(jù)處理方法法，包括實驗設計、圖像的獲得和數(shù)據(jù)，包括實驗設計、圖像的獲得和數(shù)據(jù)的前處理、數(shù)據(jù)的須處理和歸一化、差的前處理、數(shù)據(jù)的須處理和歸一化、差異表達基因分析、芯片數(shù)據(jù)的可靠性分異表達基因分析、芯片數(shù)據(jù)的可靠性分析、聚類分析和可視化以及微陣列實驗析、聚類分析和可視化以及微陣列實驗中的分類方法；第三部分主要是與中的分類方法；第三部分主要是與數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)挖掘和應用挖掘和應用相關的內(nèi)容，包括微陣列技相關的內(nèi)容，包括微陣列技術的標難化、基

3、因芯片數(shù)據(jù)的基因注釋術的標難化、基因芯片數(shù)據(jù)的基因注釋和功能分析、系統(tǒng)生物學及基因調控網(wǎng)和功能分析、系統(tǒng)生物學及基因調控網(wǎng)絡、基因芯片技術的應用絡、基因芯片技術的應用從基因篩從基因篩選到臨床診斷、主要數(shù)據(jù)分析軟件的介選到臨床診斷、主要數(shù)據(jù)分析軟件的介紹和展望。紹和展望。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件芯片打印儀芯片打印儀微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件芯片雜交儀芯片雜交儀微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件芯片掃描儀芯片掃描儀微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件生物芯片技術簡介u 每個組織和細胞中包含各種生物大分子，如蛋白質、DNA和RNA，為了解生物大分子與生命現(xiàn)象的關系，需要研究生

4、物中所有不同種類蛋白質和核酸的功能，而傳統(tǒng)檢測方法一次只能檢測一個生物大分子，生物芯片技術提供了高通量檢測生物大分子的方法。u生物芯片生物芯片：把生物活性大分子（如蛋白質和核酸）或細胞等，密集排列在固定的固相載體上，形成微型的檢測器件，固相載體通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龍膜等。u 狹義：微陣列芯片，主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、蛋白質微陣列和小分子化合物微陣列等u 廣義：能對生物成分或生物分子進行快速并行處理和分析的厘米見方的固體薄型器件，主要還包括微流體芯片和“芯片實驗室”。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件生物芯片主要特點u 微型化u 自動化u 網(wǎng)絡化微陣列分析導論課件微陣列

5、分析導論課件生物芯片類型u基因芯片gene chipu蛋白質芯片protein chipu組織芯片tissue microarrayu微流體芯片和縮微芯片實驗室微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列微陣列(microarray):(microarray):是一種平面的基質載體，它是一種平面的基質載體，它上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因產(chǎn)物。上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因產(chǎn)物。細胞細胞什么是微陣列？什么是微陣列？微陣列芯片微陣列芯片 基因表達資料基因表達資料mRNA對對mRNA進行標記進行標記雜交雜交定量定量微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件How?靶標靶標標記探針標記探針gen

6、emRNA微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析u 微陣列分析（microarray analysis):利用微陣列芯片通過一些實驗步驟來研究生物、化學及物理方面的問題。u在微陣列分析中，從細胞中抽提得到mRNA，把mRNA進行熒光標記，然后和含有基因序列的玻璃芯片進行雜交。芯片上每個點能和雜交液中的熒光標記的特異性cDNA雜交，使得每個點的熒光信號和基因表達的豐度成正相關。u能夠在基因組規(guī)模上對基因表達譜、患者基因型、藥物代謝、疾病的發(fā)生和進展過程進行快速和定量的分析。u應用領域：醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列的起源u生物芯片是隨人類基因組計劃啟動和實施應

7、運而生；u1991年Fodor等人首先提出DNA芯片的概念；u1991年Affymetrix率先生產(chǎn)世界上第一塊基因芯片；u1995年第一塊以玻璃為載體的基因芯片在美國斯坦福大學P.O.Brown實驗室誕生，由Schena及其同事研究出來的。目的是研究擬南芥的轉錄因子，從而快速而準確的研究植物的基因表達過程，標志著生物芯片技術步入廣泛研究和應用時期；u生物芯片技術已成為功能基因組研究中最基本的實驗手段微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件基因芯片技術的產(chǎn)生和發(fā)展uDNA體外聚合u重組DNA技術uPCR（聚合酶鏈反應）技術uDNA雜交技術微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列

8、分析導論課件核酸分子固相雜交方法u菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）uSouthern印跡雜交（Southern blot）uNorthern印跡雜交（Northern blot）u斑點雜交（Dot blot）u組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）u反向雜交，基因芯片的前身微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件探針u探針標記 放射性同位素標記，125I、32P、33P和35Su非放射性標記 熒光法，化學發(fā)光法，電化學發(fā)光法，生物發(fā)光，顯色法u探針種類（Probe type） 基因組探針 cDNA探針 寡聚核苷酸探針（Oli

9、go）微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件探針的來源探針的來源uDNA探針根據(jù)其來源有3種：u一種來自基因組中有關的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；u另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA，再通過逆轉錄得到的探針，稱為cDNA 探針（ cDNA probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。u此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。 微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列是如何定義的？u 微陣列必須符合：有規(guī)則的；顯微尺度的；平面的；特異性的。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件 吸附在玻璃基片上的靶標吸

10、附在玻璃基片上的靶標DNA分子。單鏈的靶標分子。單鏈的靶標DNA分子和溶液中分子和溶液中熒光素標記的探針發(fā)生雜交結合，使得芯片上的點呈現(xiàn)出熒光信號，信熒光素標記的探針發(fā)生雜交結合，使得芯片上的點呈現(xiàn)出熒光信號，信號的強度和對應的基因表達水平成正相關，熒光信號的強度按照彩色模號的強度和對應的基因表達水平成正相關，熒光信號的強度按照彩色模式來賦予不同的顏色，基因的表達情況能夠通過檢測芯片上不同位置的式來賦予不同的顏色，基因的表達情況能夠通過檢測芯片上不同位置的熒光信號來定量。熒光信號來定量。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件規(guī)則的微陣列 規(guī)則的陣列是指陣列上待分析的單元按照行和列的方式進行排列的

11、集合規(guī)則的陣列是指陣列上待分析的單元按照行和列的方式進行排列的集合 微陣列上的點按照行和列規(guī)則地排列而非無規(guī)則排列；點的大小和點間微陣列上的點按照行和列規(guī)則地排列而非無規(guī)則排列；點的大小和點間距均一而非不均一；點的位置明確而非模棱兩可。距均一而非不均一；點的位置明確而非模棱兩可。微陣列定義微陣列定義微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件顯微尺度的點u顯微尺度（microscopic):是一個物體若沒有顯微鏡的幫助，不能清楚地被看見。一般以小于1mm為界。u微陣列：光引導原位合成的點：1530m 點制的點：50350m 組織芯片的點：200600m微陣列定義微陣列定義微陣列分析導論課件微陣列分析導

12、論課件平面基片u平面基片是像玻璃、塑料、硅片一樣平行不能彎曲的基質載體。玻片是微陣列中用得最為廣泛的基質載體。u非平面基片：尼龍膜、硝酸纖維素膜等。u平坦的表面優(yōu)點：適合大規(guī)模自動化生產(chǎn)；為光掩膜、接觸式針點樣、噴墨式非接觸點樣和其它制備工序提供了精密的距離，確保制備微陣列的高質量；使掃描和成像變得容易。微陣列定義微陣列定義微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件特異性吸附u 微陣列上的每一個點能與標記好的探針混合物中的一種分子發(fā)生吸附，才能對此基因或基因產(chǎn)物進行精確的檢測微陣列定義微陣列定義微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件u探針混合物中一種標記好的探針分子能和cDNA微陣列芯片上唯一的一個c

13、DNA靶標進行雜交，或者與寡聚核昔酸微陣列芯片上的一組相應的寡聚核苷酸進行雜交。含有短的寡聚核苷酸陣列上的靶標和單一的探針分子雜交時常會產(chǎn)生不能分辨的多個雜交信號。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列的類別微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件實驗設計 每次微陣列分析實驗應該包括陽性對照、陰性對照和陽性對照、陰性對照和實驗對象實驗對象u陽性對照陽性對照是指在微陣列上的點，不管實驗對象得到的是什么樣的結果，這些點都能產(chǎn)生可按識別的信號。陽性對照產(chǎn)生的可識別信號極大地改善了評估實驗數(shù)據(jù)的能力，特別在實驗對象得到陰性結果時尤顯突出。陽性對照得到了強烈信號后，就能排除對實驗失敗的錯誤解釋，例如可排

14、除問題出在雜交、清洗、掃描或數(shù)據(jù)分析的步驟上。只有陽性對照中也末產(chǎn)生可識別的信號，才能對微陣列分析的陰性結果下一個確切的結論。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件u 陰性對照陰性對照是指在微陣列上的點，不管實驗對象得到的是什么樣的結果，這些點都不能產(chǎn)生信號。陰性對照能排除或減小非特異性反應(如染色和交叉雜交)帶來的信號而增加實驗數(shù)據(jù)的可信度。若分析時沒有陰性對照做參考而對微陣列分析實驗下結論是一件很冒險的事。u實驗對象實驗對象是指在實驗中要尋找的新信息。這些信息包括基因表達譜、基因型、其他生物過程或途徑。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件Expressio

15、n profiling with DNA microarrayscDNA “A”Cy5 labeledcDNA “B”Cy3 labeledHybridizationScanningLaser 1 Laser 2+AnalysisImage Capture微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件A yellow spot a gene that hybridized to both green and red cDNA: expressed both in healthy cells and cancer cells!微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件實驗設計 生物學問題生物學問題“根和葉的基因

16、根和葉的基因表達有和不同？表達有和不同？” 樣品制備樣品制備mRNA分離、探針標記、分離、探針標記、PCR、微陣列點制、微陣列點制生化反應生化反應 雜交、基片處理、雜交、基片處理、 封閉、清洗封閉、清洗檢測檢測選擇熒光通道、激光選擇熒光通道、激光設置、生成圖像設置、生成圖像數(shù)據(jù)分析和建立模型數(shù)據(jù)分析和建立模型數(shù)據(jù)定量、計算比率、數(shù)據(jù)定量、計算比率、聚類分析聚類分析微微陣陣列列分分析析的的五五個個步步驟驟微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件基因芯片的數(shù)據(jù)挖掘微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析的一些應用u發(fā)育u人類疾病u藥物研發(fā)u遺傳篩選和診斷微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件 微陣

17、列分析能用于檢測不同組織中的基因表達譜。微陣列分析能用于檢測不同組織中的基因表達譜?；虮磉_的信號強度按照彩虹圖模式來顯示，高水平表基因表達的信號強度按照彩虹圖模式來顯示，高水平表達用紅色表示，低水平用黑色表示。達用紅色表示，低水平用黑色表示。微陣列分析應用微陣列分析應用發(fā)育發(fā)育微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析應用微陣列分析應用人類疾病人類疾病 正常人和阿爾茨海默癥患者的腦組織樣品用微陣列正常人和阿爾茨海默癥患者的腦組織樣品用微陣列技術進行定量分析后顯示了一個在患者腦組織中表達技術進行定量分析后顯示了一個在患者腦組織中表達上調的基因。這個基因可能與疾病的發(fā)生有關。上調的基因。這個

18、基因可能與疾病的發(fā)生有關。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件微陣列分析應用微陣列分析應用藥物研發(fā)藥物研發(fā) 疾病發(fā)生伴隨著一個基因被激活和兩個基因受抑制。用疾病發(fā)生伴隨著一個基因被激活和兩個基因受抑制。用A藥物處理后，變化異常的基因回復到正常水平。用藥物處理后，變化異常的基因回復到正常水平。用B藥物藥物處理后，原來變化異常的基因表達也回復到正常水平，但處理后，原來變化異常的基因表達也回復到正常水平，但又兩個新的基因受到抑制，預示又兩個新的基因受到抑制，預示B藥物可能存在副作用藥物可能存在副作用微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件總結u微陣列分析是20世紀90年代早期發(fā)展的一項革命性新技術。該技術使用了微型化（微陣列芯片）來對基因和基因產(chǎn)物做定量的分析。有較高的分析速度和較好的分析精度，可一次分析人的整個基因組，在10min內(nèi)定量獲得3萬多個基因的表達情況。u其發(fā)展歷史可追溯到20世紀50年代，期間包括發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶、重組DNA技術和PCR技術。u具有網(wǎng)絡化、微型化和自動化特點。u主要包括五個步驟。u可用于發(fā)育、人類疾病、藥物發(fā)現(xiàn)、診斷等研究。微陣列分析導論課件微陣列分析導論課件CGH比較基因組雜交技術u是一種將消減雜交、熒光染色體原位雜交（fluorescence in