第三章酶工程動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1、第三章第三章 動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。 植物細(xì)胞結(jié)構(gòu) 植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類(lèi)細(xì)胞種類(lèi)植物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小細(xì)胞大小/um20030011010100倍增時(shí)間倍增時(shí)間/h120.3-615營(yíng)養(yǎng)要求營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜復(fù)雜光照要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求對(duì)剪切力對(duì)剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不

2、敏感非常敏感非常敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、香精、酶等香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激素、疫苗、激素、單克隆抗體、單克隆抗體、酶等酶等三者之間的差異主要有：三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞植物細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 微生物細(xì)胞。微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切

3、力敏感。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從外植體中從外植體中選育植物細(xì)胞選育植物細(xì)胞高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)各種產(chǎn)物各種產(chǎn)物 1.1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) 提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量 縮短周期縮短周期 易于管理易于管理 2.2.培養(yǎng)基特點(diǎn)培養(yǎng)基特點(diǎn) 需要大量無(wú)機(jī)鹽需要大量無(wú)機(jī)鹽 需多種維生素和激素需多種維生素和激素 氮源一般為無(wú)機(jī)氮氮源一般為無(wú)機(jī)氮 一般以蔗糖為碳源一般以蔗糖為碳源n應(yīng)用最廣的是應(yīng)用最廣的是msms培養(yǎng)基和培養(yǎng)基和

4、lsls培養(yǎng)基培養(yǎng)基 msms培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是19621962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。計(jì)的培養(yǎng)基。lsls培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來(lái)的。來(lái)的。p82p82表表3-33-33.3.培養(yǎng)工藝：培養(yǎng)工藝：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程工藝流程外植體外植體細(xì)胞的獲取細(xì)胞的獲取細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)分離分離純化純化產(chǎn)物產(chǎn)物外植體選擇和處理外植體選擇和處理選取那些無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)規(guī)則植株，把選取那些無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)旺盛、生長(zhǎng)規(guī)則植株，把莖、葉、根、芽，花、果實(shí)等切成小片段或小塊。莖、葉、根、芽，花、果實(shí)等切成小片段或小塊。用用70%-75%70%-75

5、%乙醇，乙醇，0.1%0.1%升汞消毒，無(wú)菌水漂洗。升汞消毒，無(wú)菌水漂洗。外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)從植株取出，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）的片段或小塊。等）的片段或小塊。愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于將上述外植體植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于2525左右培左右培養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。養(yǎng)一段時(shí)間，從外植體的切口部位長(zhǎng)出小細(xì)胞團(tuán)。水稻的外植體（幼水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織胚）和愈傷組織外植體外植體愈傷組織愈傷組織植物細(xì)胞獲取植

6、物細(xì)胞獲取 直接分離法直接分離法 愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織誘導(dǎo)法 原生質(zhì)體再生法原生質(zhì)體再生法細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：轉(zhuǎn)新培養(yǎng)基，在生物反細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：轉(zhuǎn)新培養(yǎng)基，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)分離純化：生化技術(shù)分離純化：生化技術(shù)機(jī)械法機(jī)械法酶法酶法 培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制溫度：室溫溫度：室溫2525phph：微酸性范圍。即：微酸性范圍。即ph 5.0-6.05.0-6.0通氣與攪拌通氣與攪拌光照的控制：強(qiáng)度和時(shí)間有一定要求光照的控制：強(qiáng)度和時(shí)間有一定要求前體的添加（飼喂）前體的添加（飼喂）刺激劑的應(yīng)用刺激劑的應(yīng)用4.4.植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實(shí)例植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實(shí)例 以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)

7、超氧化物歧化酶（以大蒜細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（sodsod）為例）為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實(shí)、飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害的大蒜蒜瓣，去除外選取結(jié)實(shí)、飽滿(mǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然后無(wú)菌水漂洗然后無(wú)菌水漂洗3 3次。次。 在無(wú)菌條件下，切成在無(wú)菌條件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小塊，植入含有的小塊，植入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba 的半固體的半固體msms培養(yǎng)基中

8、，培養(yǎng)基中，在在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照條件下培養(yǎng)光照條件下培養(yǎng)18d18d，誘導(dǎo)得，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每到愈傷組織，每1818天繼代一次。天繼代一次。(2)(2)大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)大蒜懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 將上述在半固體將上述在半固體msms培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d18d的愈傷組的愈傷組織，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入含有織，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和 1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba （芐基腺嘌呤）（芐基腺嘌呤） 的液體的液體msms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，加入滅菌的玻璃珠，2525，600lux

9、600lux，12h/d12h/d光照條光照條件下震蕩培養(yǎng)件下震蕩培養(yǎng)18d18d，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。單細(xì)胞。 然后在無(wú)菌條件下，經(jīng)過(guò)篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單然后在無(wú)菌條件下，經(jīng)過(guò)篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba 的液體的液體msms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩光照條件下震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)18d18d。(3)(3)酶的分離純化酶的分離純化 細(xì)胞培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)完成后，

10、收集細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有效高價(jià)值的物質(zhì)動(dòng)物細(xì)胞可以產(chǎn)生各種有效高價(jià)值的物質(zhì)需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢細(xì)胞體積大，無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感。細(xì)胞體積大，無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)剪切力敏感。反應(yīng)過(guò)程成本高，產(chǎn)品價(jià)格貴反應(yīng)過(guò)程成本高，產(chǎn)品價(jià)格貴細(xì)胞具有錨地依賴(lài)性。宜采用貼壁培養(yǎng)細(xì)胞具有錨地依賴(lài)性。宜采用貼壁培養(yǎng)原代細(xì)胞一般繁殖原代細(xì)胞一般繁殖5050代代2.

11、2.培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 (1)(1)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(2)(2)貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng) 滾瓶培養(yǎng)滾瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)(microcarrier culture)(3)(3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)固定化細(xì)胞培養(yǎng)包埋包埋(entrapment)(entrapment)和中空纖維和中空纖維(microencapsulation)(microencapsulation)培培養(yǎng)養(yǎng)3.工藝控制工藝控制 工藝流程工藝流程 種質(zhì)細(xì)胞種質(zhì)細(xì)胞 （體細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞）（體細(xì)胞；雜交瘤細(xì)胞） 分散成懸浮細(xì)胞分散成懸浮細(xì)胞 細(xì)胞懸浮或貼壁培細(xì)胞懸浮或貼壁培養(yǎng)養(yǎng) 收集收集 分離純化

12、分離純化 產(chǎn)物產(chǎn)物 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制溫度：一般控制在溫度：一般控制在36.5.36.5.phph值：一般控制在值：一般控制在7.0-7.67.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。的微堿性范圍內(nèi)。滲透壓滲透壓: : 應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)滲透壓相同。應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)滲透壓相同。溶解氧：根據(jù)情況隨時(shí)調(diào)節(jié)。溶解氧：根據(jù)情況隨時(shí)調(diào)節(jié)。4.產(chǎn)酶實(shí)例產(chǎn)酶實(shí)例以人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原以人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑為例激活劑為例纖溶酶原纖溶酶原 纖溶酶纖溶酶纖溶酶原激活劑纖溶酶原激活劑種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶處理，分散，種質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶處理，分散，ph7.4ph7.4磷

13、酸磷酸鹽洗滌。稀釋成細(xì)胞懸浮液鹽洗滌。稀釋成細(xì)胞懸浮液接種到反應(yīng)器中，與接種到反應(yīng)器中，與37 co37 co2 2培養(yǎng)箱中，長(zhǎng)成培養(yǎng)箱中，長(zhǎng)成致密單層致密單層去培養(yǎng)液，用去培養(yǎng)液，用ph7.4ph7.4磷酸鹽沖洗細(xì)胞磷酸鹽沖洗細(xì)胞換無(wú)血清換無(wú)血清e(cuò)agleeagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)每每3-43-4天，取出培養(yǎng)液分離純化天，取出培養(yǎng)液分離純化再加新鮮再加新鮮eagleeagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)親和層析進(jìn)行分離親和層析進(jìn)行分離細(xì)胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置細(xì)胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置 第一章第一章作業(yè)：作業(yè)：1.1.概念概念 酶活力單位酶活力單位 酶比活力酶比活力2.2.酶工程的主要任務(wù)和主要內(nèi)容是什么？酶工程的主要任務(wù)和主要內(nèi)容是什么？3.3.寫(xiě)出酶活力測(cè)定的一般步驟。寫(xiě)出酶活力測(cè)定的一般步驟。 第二章第二章作業(yè)：作業(yè)：1.1.概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的誘導(dǎo)誘導(dǎo)2.2.提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？3.3.試述發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶解氧進(jìn)行控制的必要性及試述發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶解氧進(jìn)行控制的必要性及其依據(jù)。其依據(jù)。4.4.影響酶生物合成模式