第三章酶工程動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1、第三章第三章 動、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 與微生物細胞相比，動物細胞與微生物細胞相比，動物細胞和植物細胞具有各自不同的特性，和植物細胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。 植物細胞結構 植物、動物、微生物細胞的特性比較植物、動物、微生物細胞的特性比較細胞種類細胞種類植物細胞植物細胞微生物細胞微生物細胞動物細胞動物細胞細胞大小細胞大小/um20030011010100倍增時間倍增時間/h120.3-615營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求簡單簡單簡單簡單復雜復雜光照要求光照要求大多數(shù)要求大多數(shù)要求不要求不要求不要求不要求對剪切力對剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不

2、敏感非常敏感非常敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、色素、藥物、香精、酶等香精、酶等醇、有機酸、氨醇、有機酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫苗、激素、疫苗、激素、單克隆抗體、單克隆抗體、酶等酶等三者之間的差異主要有：三者之間的差異主要有：植物細胞植物細胞 動物細胞動物細胞 微生物細胞。微生物細胞。動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。光照。植物細胞和動物細胞對剪切

3、力敏感。植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從外植體中從外植體中選育植物細胞選育植物細胞高產(chǎn)穩(wěn)定細胞高產(chǎn)穩(wěn)定細胞培養(yǎng)培養(yǎng)各種產(chǎn)物各種產(chǎn)物 1.1.植物細胞培養(yǎng)的特點植物細胞培養(yǎng)的特點 提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質量提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質量 縮短周期縮短周期 易于管理易于管理 2.2.培養(yǎng)基特點培養(yǎng)基特點 需要大量無機鹽需要大量無機鹽 需多種維生素和激素需多種維生素和激素 氮源一般為無機氮氮源一般為無機氮 一般以蔗糖為碳源一般以蔗糖為碳源n應用最廣的是應用最廣的是msms培養(yǎng)基和培養(yǎng)基和

4、lsls培養(yǎng)基培養(yǎng)基 msms培養(yǎng)基是培養(yǎng)基是19621962年為煙草細胞培養(yǎng)而設年為煙草細胞培養(yǎng)而設計的培養(yǎng)基。計的培養(yǎng)基。lsls培養(yǎng)基是在其基礎上演變而培養(yǎng)基是在其基礎上演變而來的。來的。p82p82表表3-33-33.3.培養(yǎng)工藝：培養(yǎng)工藝：懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)工藝流程工藝流程外植體外植體細胞的獲取細胞的獲取細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)分離分離純化純化產(chǎn)物產(chǎn)物外植體選擇和處理外植體選擇和處理選取那些無病蟲害、生長旺盛、生長規(guī)則植株，把選取那些無病蟲害、生長旺盛、生長規(guī)則植株，把莖、葉、根、芽，花、果實等切成小片段或小塊。莖、葉、根、芽，花、果實等切成小片段或小塊。用用70%-75%70%-75

5、%乙醇，乙醇，0.1%0.1%升汞消毒，無菌水漂洗。升汞消毒，無菌水漂洗。外植體：外植體： 從植株取出，經(jīng)過預處理后，用于植物組織培養(yǎng)從植株取出，經(jīng)過預處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊。等）的片段或小塊。愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導培養(yǎng)基中，于將上述外植體植入誘導培養(yǎng)基中，于2525左右培左右培養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出小細胞團。養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出小細胞團。水稻的外植體（幼水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織胚）和愈傷組織外植體外植體愈傷組織愈傷組織植物細胞獲取植

6、物細胞獲取 直接分離法直接分離法 愈傷組織誘導法愈傷組織誘導法 原生質體再生法原生質體再生法細胞懸浮培養(yǎng)：轉新培養(yǎng)基，在生物反細胞懸浮培養(yǎng)：轉新培養(yǎng)基，在生物反應器中進行培養(yǎng)應器中進行培養(yǎng)分離純化：生化技術分離純化：生化技術機械法機械法酶法酶法 培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制溫度：室溫溫度：室溫2525phph：微酸性范圍。即：微酸性范圍。即ph 5.0-6.05.0-6.0通氣與攪拌通氣與攪拌光照的控制：強度和時間有一定要求光照的控制：強度和時間有一定要求前體的添加（飼喂）前體的添加（飼喂）刺激劑的應用刺激劑的應用4.4.植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例 以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)

7、超氧化物歧化酶（以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（sodsod）為例）為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導大蒜愈傷組織的誘導 選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然后無菌水漂洗然后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小塊，植入含有的小塊，植入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba 的半固體的半固體msms培養(yǎng)基中

8、，培養(yǎng)基中，在在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照條件下培養(yǎng)光照條件下培養(yǎng)18d18d，誘導得，誘導得到愈傷組織，每到愈傷組織，每1818天繼代一次。天繼代一次。(2)(2)大蒜懸浮細胞培養(yǎng)大蒜懸浮細胞培養(yǎng) 將上述在半固體將上述在半固體msms培養(yǎng)基上培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d18d的愈傷組的愈傷組織，在無菌條件下轉入含有織，在無菌條件下轉入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和 1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba （芐基腺嘌呤）（芐基腺嘌呤） 的液體的液體msms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，加入滅菌的玻璃珠，2525，600lux

9、600lux，12h/d12h/d光照條光照條件下震蕩培養(yǎng)件下震蕩培養(yǎng)18d18d，使愈傷組織分散成為小細胞團或，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。單細胞。 然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞團或單然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞團或單細胞轉入含有細胞轉入含有3mg/l 2,4-d3mg/l 2,4-d和和1.2mg/l 6-ba 1.2mg/l 6-ba 的液體的液體msms培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩光照條件下震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)18d18d。(3)(3)酶的分離純化酶的分離純化 細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞，經(jīng)過細胞細胞培養(yǎng)完成后，

10、收集細胞，經(jīng)過細胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。二、動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶 1.1.動物細胞培養(yǎng)的特點動物細胞培養(yǎng)的特點動物細胞可以產(chǎn)生各種有效高價值的物質動物細胞可以產(chǎn)生各種有效高價值的物質需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）細胞生長速度慢細胞生長速度慢細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感。細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感。反應過程成本高，產(chǎn)品價格貴反應過程成本高，產(chǎn)品價格貴細胞具有錨地依賴性。宜采用貼壁培養(yǎng)細胞具有錨地依賴性。宜采用貼壁培養(yǎng)原代細胞一般繁殖原代細胞一般繁殖5050代代2.

11、2.培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 (1)(1)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(2)(2)貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng) 滾瓶培養(yǎng)滾瓶培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)(microcarrier culture)(3)(3)固定化細胞培養(yǎng)固定化細胞培養(yǎng)包埋包埋(entrapment)(entrapment)和中空纖維和中空纖維(microencapsulation)(microencapsulation)培培養(yǎng)養(yǎng)3.工藝控制工藝控制 工藝流程工藝流程 種質細胞種質細胞 （體細胞；雜交瘤細胞）（體細胞；雜交瘤細胞） 分散成懸浮細胞分散成懸浮細胞 細胞懸浮或貼壁培細胞懸浮或貼壁培養(yǎng)養(yǎng) 收集收集 分離純化

12、分離純化 產(chǎn)物產(chǎn)物 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化培養(yǎng)條件的影響與控制培養(yǎng)條件的影響與控制溫度：一般控制在溫度：一般控制在36.5.36.5.phph值：一般控制在值：一般控制在7.0-7.67.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。的微堿性范圍內(nèi)。滲透壓滲透壓: : 應與細胞內(nèi)滲透壓相同。應與細胞內(nèi)滲透壓相同。溶解氧：根據(jù)情況隨時調(diào)節(jié)。溶解氧：根據(jù)情況隨時調(diào)節(jié)。4.產(chǎn)酶實例產(chǎn)酶實例以人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原以人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑為例激活劑為例纖溶酶原纖溶酶原 纖溶酶纖溶酶纖溶酶原激活劑纖溶酶原激活劑種質細胞用胰蛋白酶處理，分散，種質細胞用胰蛋白酶處理，分散，ph7.4ph7.4磷

13、酸磷酸鹽洗滌。稀釋成細胞懸浮液鹽洗滌。稀釋成細胞懸浮液接種到反應器中，與接種到反應器中，與37 co37 co2 2培養(yǎng)箱中，長成培養(yǎng)箱中，長成致密單層致密單層去培養(yǎng)液，用去培養(yǎng)液，用ph7.4ph7.4磷酸鹽沖洗細胞磷酸鹽沖洗細胞換無血清換無血清eagleeagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)每每3-43-4天，取出培養(yǎng)液分離純化天，取出培養(yǎng)液分離純化再加新鮮再加新鮮eagleeagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)親和層析進行分離親和層析進行分離細胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置細胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置 第一章第一章作業(yè)：作業(yè)：1.1.概念概念 酶活力單位酶活力單位 酶比活力酶比活力2.2.酶工程的主要任務和主要內(nèi)容是什么？酶工程的主要任務和主要內(nèi)容是什么？3.3.寫出酶活力測定的一般步驟。寫出酶活力測定的一般步驟。 第二章第二章作業(yè)：作業(yè)：1.1.概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的誘導誘導2.2.提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？3.3.試述發(fā)酵過程中對溶解氧進行控制的必要性及試述發(fā)酵過程中對溶解氧進行控制的必要性及其依據(jù)。其依據(jù)。4.4.影響酶生物合成模式