淺探轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良

1、淺探轉(zhuǎn)基因顯微注射中的基因裝液方法改良摘要：目前常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、精子載體法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、人工酵母染色體法及電轉(zhuǎn)移法等1 r。其中 顯微注射仍是最可靠、最廣泛使用的一種方法，因其外源基因整合效率高，對(duì)目的 基因無(wú)大小限制，且可以直接獲得純系樣 廠，但其過程煩瑣且要求嚴(yán)格，將基因 液裝入微注射針是其成功的關(guān)鍵前提910J。當(dāng)前各實(shí)驗(yàn)室普遍使用可編程微量注射儀,該儀器要求將基因液面倒吸至注射針的直管部以獲得穩(wěn)定平衡壓力，但僅用其吸入功能無(wú)法達(dá)到，導(dǎo)致培養(yǎng)液倒吸，基因液被稀釋，從而大大影響了轉(zhuǎn) 基因成功率。筆者建立一種簡(jiǎn)單有效的方法以克服這一缺點(diǎn)。關(guān)鍵詞：

2、 動(dòng)物 遺體修飾 小鼠 轉(zhuǎn)基因 顯微注射 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)1 材料與方法儀器和材料卩1 30拉針儀，肝9血煅針儀，則可編程微量注射儀（日本Narishige公司）；倒置顯微鏡,顯微操作儀（日本 Olympus公 司），；1川薄壁毛細(xì)玻璃管（1 x 90 mm日本Narishige公司）或叫 也薄壁 毛細(xì)玻璃管（X 100 mm北京正天易科貿(mào)有限責(zé)任公司），玻璃管（x 200 mm北 京正天易科貿(mào)有限責(zé)任公司）,一次性培養(yǎng)平皿（美國(guó)BDFALCO公司）,顯微注 射用基因液,M2培養(yǎng)液，石蠟油（M8410,美國(guó)Sigma公司）。儀器參數(shù)注射針拉針儀：主磁61,副磁23;溫度70 C；煅針儀：彎針溫度2

3、025 C?？删幊涛⒘孔⑸鋬xIn put : 60100 psi （1 psi= kPa ）; CLR 6070 psi, s ; BALN psi ; FILL : 60 psi,60 s ; INJ :psi, s 。方法注射針制備 設(shè)定對(duì)應(yīng)的拉針儀參數(shù)，裝上毛細(xì)玻璃管，用固定旋鈕固 定好,按下拉針儀開關(guān)，將其拉制成開口小于1卩m的注射針；取下注射針裝在煅 針儀的持針架上，將注射針移至玻璃球側(cè)面，使其內(nèi)徑20卩m處靠近玻璃球，設(shè)定 好煅針儀的溫度參數(shù)，點(diǎn)壓加熱開關(guān),將其彎成25。微載管制備用兩把鑷子夾住直徑為mm的玻璃管兩端，將其中部置于酒精燈火焰上灼燒，待其軟化后，快速向外拉伸。在距肩部

4、約910 cm處用砂 輪裁斷細(xì)部，將細(xì)部的尖端在鍛針儀上鍛燒，使開口邊緣變光滑。這樣制備的微載 管外直徑約200400卩m,用于將石蠟油裝入顯微注射針?；蛞旱难b載及比較將相同參數(shù)下制備的注射針分成 2組,每組3根，分別按照下面2種方法將基因液裝入針內(nèi)。針尖倒吸法（A法）將注射針裝到顯微操作儀持針器上，并與可編程微量注射儀相連接，調(diào)好可編程微量注射儀各部分參數(shù)，打開“ BALN功能；在培 養(yǎng)皿蓋子上作一個(gè)3卩L基因液液滴，覆蓋上石蠟油，將其置于倒置顯微鏡的載物 臺(tái)上,調(diào)整注射針角度，使其進(jìn)入基因液滴，按下注射儀的“ FILL”按鍵,將基因 液倒吸進(jìn)入注射針，按下注射儀的“ FILL”按鍵數(shù)次，

5、觀察注射針內(nèi)液面的變化。改良法（B法）用微載管吸取少量（約510卩L）滅菌石蠟油并從顯微注射針的背部注入，直到液面到達(dá)注射針的直管部（圖1）,小心取出微載管， 通過橡膠管將注射針背部與注射器相連，按壓注射器活塞對(duì)石蠟油輕輕施壓，使 得針內(nèi)液面向針口緩慢移動(dòng)，最終充滿整個(gè)注射針尖部；后續(xù)操作同。圖1顯微注射針各部分示意圖（略）Fig 1Represe ntati on of each part ofmicroinjectio n pipette顯微注射模擬及比較平衡壓力的觀察保持顯微注射儀所有參數(shù)不變，將M2培養(yǎng)液裝填于mm培養(yǎng)皿蓋并置于倒置顯微鏡的載物臺(tái)上，調(diào)整注射針角度，驅(qū)動(dòng)顯微操作臂使 其

6、緩緩下降進(jìn)入M2培養(yǎng)液中,在倒置顯微鏡20X物鏡下調(diào)節(jié)焦距至基因液液面 清晰,觀察注射針內(nèi)基因液液面的位置變化，以判斷此時(shí)顯微注射儀提供的平衡 壓力是否能夠抵消培養(yǎng)液的虹吸效應(yīng)，產(chǎn)生使基因液緩慢外流的正壓。模擬注射后液面變化保持顯微注射儀所有參數(shù)不變，調(diào)好注射儀的“INJ”功能,反復(fù)按壓“ INJ”按鍵模擬顯微注射過程30次后,按壓“ CLR 按鍵10次,在倒置顯微鏡20X物鏡下觀察注射針內(nèi)液面變化情況。液面變化數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)處理調(diào)節(jié)焦距至基因液液面清晰，記錄此時(shí)基因液液面在目鏡測(cè)微尺上的刻度（起始位置）,10 min后再次觀察并記錄液面在 目鏡測(cè)微尺上的刻度（終止位置）。將2組注射針內(nèi)基因液液面

7、在10 min的位置 變化差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并作配對(duì)資料t檢驗(yàn),采用MicroCal Origin軟件中的t 檢驗(yàn)（two population/pared）,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取 a =。2 結(jié)果基因液的裝載及比較用A法裝載基因液后，按壓“ FILL”按鍵，基因液倒吸入注射針內(nèi)，當(dāng)液面上升到注射針尖細(xì)部一定位置后，再按壓“ FILL”按 鍵多次,注射針內(nèi)液面沒有明顯變化。而 B法的注射針內(nèi)石蠟油與基因液界面仍 然可以上升，甚至到達(dá)注射針直管部。顯微注射模擬及比較平衡壓力的觀察分別使用2種方法裝載基因液后，將注射針緩緩下 降進(jìn)入M2培養(yǎng)液中,在倒置顯微鏡20X物鏡下都觀察到注射針內(nèi)基因液液面緩 慢向針尖

8、方向移動(dòng)。模擬注射后液面變化 反復(fù)按壓“ INJ”按鍵模擬顯微注射過程30 次后,按壓“ CLR按鍵10次,在倒置顯微鏡20X物鏡下觀察，用A法裝載的基因 液液面緩慢上升,M2培養(yǎng)液倒吸進(jìn)入注射針；用B法裝載的基因液界面仍然緩慢 下降。液面變化數(shù)值統(tǒng)計(jì)學(xué)處理A組注射針內(nèi)基因液液面在10 min的位置變化為、，xs為土； B組為-、-、-,xs為-土（差值為正表示針內(nèi)液面向 針尖方向移動(dòng)，差值為負(fù)表示液面向針背方向移動(dòng)）。兩組數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P）。3 討論 ；原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠是一個(gè)嚴(yán)格而煩瑣的過程，其中將基因液裝入注射針是顯微注射之前必不可少的關(guān)鍵一步。目前完成該步

9、驟的方法有3種：針背虹吸法、針背填充法以及針尖倒吸法。前2種方法均需要特殊的毛細(xì)管， 且操作過程中極容易污染基因液，每次操作基因液的用量大，成本較高。而針尖倒 吸法是利用可編程微量注射儀的“ FILL ”功能將基因液直接從注射針針口倒吸 進(jìn)入注射針。該法將基因液從針口倒吸進(jìn)入注射針，既不需要使用昂貴的微載管， 且每次只須1卩L的基因液,可以很大程度地節(jié)約基因液的用量；另外，每次吸 取少量基因液做成基因液滴的方法可以很大程度地保持基因液的純度，在操作過程中也不會(huì)對(duì)基因液造成污染。因此，使用倒吸法裝載基因液是最經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的 一種方法。A法的缺陷筆者使用A法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn),按壓“ F

10、ILL按鍵，當(dāng)液面上升到注射針尖細(xì)部一定位置后，再按壓“ FILL”按鍵多次，注射針 內(nèi)液面沒有明顯變化，表明A法不能通過人為控制吸入足夠量的基因液。裝好基 因液的注射針下降進(jìn)入培養(yǎng)液后，在顯微鏡下可以觀察到針內(nèi)液面緩慢下降，說(shuō) 明顯微注射儀提供的平衡壓力能夠抵消培養(yǎng)液的虹吸效應(yīng)，產(chǎn)生使基因液緩慢外流的正壓。而在模擬顯微注射過程中，連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“ INJ”和“CLR鍵后,在注射儀提供的平衡壓力不變的情況下，針內(nèi)液面開始緩慢上升， 說(shuō)明原來(lái)的平衡壓力已經(jīng)不能抵消虹吸效應(yīng)，使得培養(yǎng)液倒吸進(jìn)入注射針，從而 稀釋針內(nèi)的基因液，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的成功率。注射針的內(nèi)徑越小，其虹吸效 應(yīng)就越強(qiáng)

11、，當(dāng)基因液液面處于針的尖細(xì)部時(shí)，隨著注射過程進(jìn)行，液面不斷向針尖 方向移動(dòng),抵消虹吸效應(yīng)所需的平衡壓力就越高，這就需要在注射過程中時(shí)時(shí)調(diào) 節(jié)“ BALN的壓力，這既增加了顯微注射的困難度，而且實(shí)際上也不大可能實(shí)現(xiàn)。 并且，使用該法僅能倒吸入少量基因液，在注射過程中，需要經(jīng)常按壓“ CLR鍵 ( 10次)來(lái)保證注射針口的通暢，在這個(gè)過程中會(huì)損失大量的基因液，導(dǎo)致吸 入的基因液不足以完成一盤受精卵(2030個(gè))的注射量，增加了裝載基因液的 頻率,亦會(huì)大大影響轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的成功率。B法的改良本實(shí)驗(yàn)采用先從注射針背部裝入適量石蠟油的方法(即B法)解決以上問題。在基因液裝載的過程中發(fā)現(xiàn)，按壓“ FILL”

12、按鍵數(shù)次，石蠟油 與基因液的交界面仍然可以上升，表明B法可以通過增加“ FILL”的次數(shù)來(lái)裝入 足夠量的基因液，以保證順利完成一盤受精卵的注射，從而節(jié)約注射時(shí)間。而在模 擬顯微注射過程中,連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“ INJ”和“ CLR鍵后,在注射 儀提供的平衡壓力不變的情況下，針內(nèi)液面仍然緩慢下降，這說(shuō)明只要石蠟油的 上液面仍然處于注射針的直管部，即使基因液面在細(xì)管部移動(dòng)，仍然不會(huì)影響抵 消虹吸效應(yīng)所需的平衡壓力,因此連續(xù)按壓數(shù)次顯微注射儀的“ INJ”和“ CLR 鍵后,原來(lái)設(shè)定的平衡壓力仍然能夠產(chǎn)生使基因液緩慢外流的正壓，消除了壓力不穩(wěn)定給轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的影響因素。此外，由于石蠟油穩(wěn)

13、定、無(wú)毒、非親水的特性，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于高度提純的基因液來(lái)說(shuō)，石 蠟油更加經(jīng)濟(jì)且易于獲得。由于石蠟油的非親水性，在基因液后端裝上石蠟油可 以防止溶液蒸發(fā)導(dǎo)致基因濃度升高，保持基因注射過程中基因液的正常濃度。且 由于該操作的簡(jiǎn)便、無(wú)菌,在顯微注射過程中可以重復(fù)裝載基因液，毋需更換新的 注射針,減少注射針使用量。用于裝載石蠟油的微載管可以反復(fù)使用，也減少其用 量。【參考文獻(xiàn)】Koo B C,Kwon M S,Choi B R, et al .rns 111M飛gonetran sfer and expressio n of EGFP in chicke n J. Mel Re

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