第六章熒光分光光度法

1、 l基本要求： 了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。了解熒光分光光度計(jì)的組成以及特點(diǎn)。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強(qiáng)度的因素。第一節(jié)第一節(jié) 概論概論 回顧： 四大類電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法 原子光譜法 分子光譜法 x射線光譜法 核磁波譜法 紫外-可見(jiàn)光分光光度法 熒光分光光度法紅外吸收光譜法 拉曼光譜法 1.定量分析 能產(chǎn)生熒光 或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡(jiǎn)單定性 回答“是不是”。二、特點(diǎn)：二、特點(diǎn)： 靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。 一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)吸收光輻射 價(jià)電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到

2、基態(tài) 釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時(shí)，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光磷光無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài) 最常見(jiàn)的光致發(fā)光：熒光和磷光。 兩者發(fā)光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。 熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。 由于熒光的產(chǎn)生由價(jià)電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長(zhǎng)范圍位于：紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)。 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 固定熒光波長(zhǎng)，以激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度(f)所作的光譜曲線。300350400(nm) f【例】硫酸奎寧（0.1mol/l硫酸溶液）的激發(fā)光譜。 發(fā)射光譜發(fā)射光

3、譜 固定激發(fā)光波長(zhǎng)，以熒光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度f(wàn)所作的光譜曲線。300350400(nm) f【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。 分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見(jiàn)光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結(jié)構(gòu) 【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。ch2 ：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。 i0：入射光強(qiáng)度：摩爾吸光系數(shù) b： 光程 c：濃度f(wàn)=2.303i0bc公式成立前提條件：bc=a0.05 即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c0.05/b），c與f方成線性。（如果濃度過(guò)高，分子碰撞機(jī)會(huì)增大，而產(chǎn)生無(wú)輻射去激活，造成線性偏離。） 一、基本結(jié)構(gòu)示意圖一、基本結(jié)構(gòu)示意圖 特點(diǎn)：

4、1 光源方向與檢測(cè)方向成直角； 2 二個(gè)單色器。顯示器檢測(cè)器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源 1光源光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見(jiàn)光，光強(qiáng)度比紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)光源大得多。2激發(fā)光單色器激發(fā)光單色器作用：提供單波長(zhǎng)的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào) 。3樣品池樣品池須用石英材料制成。4熒光單色器熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過(guò)。出射狹縫寬度可調(diào)。5檢測(cè)器檢測(cè)器光電轉(zhuǎn)換元件，測(cè)定熒光的強(qiáng)度。檢測(cè)方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒(méi)有透過(guò)光的干擾。由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。 一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直

5、線法。作cf直線。fc配制一系列待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液 c1 c2 c3 c4 c5測(cè)出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度 f1 f2 f3 f4 f5建立工作直線（ f c） 作圖法 回歸法測(cè)量待測(cè)樣品，得f樣 從工作直線上找到待測(cè)成分的濃度c樣 由回歸方程計(jì)算出c樣 1激發(fā)光照射激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)致f。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2溫度溫度溫度，熒光效率下降，f。（因?yàn)椋瑴囟?，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）4溶劑溶劑 有些溶劑會(huì)使熒光效率下降，也可能帶來(lái)干擾熒光。 苯胺ph712時(shí)，發(fā)蘭色熒光。ph2或ph13時(shí)，無(wú)熒光。【例】所以，有時(shí)需要ph緩沖液控制ph值在適當(dāng)范圍內(nèi)。3ph值值 ph值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強(qiáng)度。l靈敏度高?？筛哌_(dá)ppb級(jí)（10-9），甚至ppt級(jí)（10-12）。l選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用 思考題一、概念l（熒光）激發(fā)光譜l（熒光）發(fā)射光譜二、問(wèn)答題l試述分子熒光產(chǎn)生的過(guò)程。l試述分子熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系式，并說(shuō)明公式成立的前提條件及原因。l分別說(shuō)明熒光分光光度計(jì)兩個(gè)單色器的作用，以及將光路設(shè)計(jì)成直角方向的原因。l為什么可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光路是直線方向，而熒光分光光度計(jì)的光路是直角