土壤中解磷細菌的分離與初步鑒定

1、土壤中解磷細菌的分離與初步鑒定 JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY本 科 畢 業(yè) 論 文（設 計）題目： 土壤中解磷細菌的分離與初步鑒定 學 院： 生物科學與工程學院 姓 名： 學 號： 專 業(yè)： 生物工程 年 級： 指導教師： 職 稱： 二0一一 年 五 月摘要目的：通過分離、篩選與純化，從土壤中篩選出具有解磷能力的菌株。方法：根據解磷圈大小判斷其解磷能力。從桔子、柚子、石榴3種不同植物根系土壤中分離出降解無機磷的解磷菌，通過平板法進行初篩，根據水解圈直徑和菌落直徑比值大小篩選到水解圈直徑和菌落直徑比值較大的菌株,連續(xù)純培養(yǎng)五代，選擇遺傳穩(wěn)定的解磷菌,進一步通過液

2、體搖瓶培養(yǎng)復篩，最后篩選出分解無機磷能力較強且能穩(wěn)定遺傳的菌株。結果：從桔子根際土壤中分離降解出了三株透明圈明顯的解磷菌，篩選出兩株水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值較大的解磷菌，1號菌株水解圈直徑(D)菌落直徑(d)為2.625，2號菌株水解圈直徑(D)菌落直徑(d)為2.44，經過五代培養(yǎng)，將穩(wěn)定性最好的菌株進行液體搖瓶培養(yǎng)7天，然后進行解磷能力測定，測得結果是菌株1號水溶性磷含量為31.13mgL，菌株2號水溶性磷含量為25.43mgL，具有較強解磷能力。結論：通過菌落形態(tài)觀察以及水溶性磷含量的測定結果可鑒定菌株為無機磷解磷細菌。關鍵詞：果樹根際土壤，解磷菌，無機磷，分離，鑒定Abst

3、ractObjective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus Xie

4、Lin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria,

5、 further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrol

6、yzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability

7、 strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured resu

8、lts of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria.Keywords:Fruit trees rhizosphere , XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal 目 錄緒論11 材料與方法11.1 供試材料11.1.1 菌株11.1.2 培養(yǎng)基11.1.3 主要儀器設備及藥品試劑21.2方法21.2.1 解磷細菌的生物富集21.2.2 菌株初篩21.2.3 解磷細

9、菌的鑒定形態(tài)學鑒定21. 2. 4 解磷細菌解磷能力的測定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 結果與討論32.1 菌株初篩結果32.2 解磷菌形態(tài)鑒定結果42.3 解磷能力鑒定結果63.小結和討論6參考文獻8致 謝9 9緒論磷是植物生長發(fā)育的重要物質基礎之一,是植物體內核酸及多種酶、輔酶、ATP等的重要組成成分,這些物質對于細胞來說是至關重要的。作物的生物量和產量與其吸收的磷量呈顯著正相關。植物缺磷將導致生長發(fā)育遲緩、生長量和產量下降。土壤中的磷總量并不低,但絕大部分處

10、于植物不能直接吸收的狀態(tài),致使多數情況下作物缺磷而生長發(fā)育和產量受到限制。長期以來，為了提高農產品的產量，人們大量使用化學肥料和農藥，磷肥在施用后往往很快就被固定形成無效態(tài)磷 ，變得不可利用，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量積累。盡管有大量關于提高植物磷利用率的專門研究，但土壤中磷循環(huán)的某些進程還不是很清楚。能夠使難溶磷溶解和礦化的微生物的作用被認為是至關重要的。國內外大量的研究表明土壤中存在許多微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態(tài)。因此，篩選出具有解磷能力的微生物，從而生產含有解磷功能較強的微生物有機肥料對解決植物磷素利用問題是一條很好的途徑，具有這種解磷能力的微

11、生物叫做解磷菌或溶磷菌，這是一種很好的微生物肥料 。根據微生物分解磷酸鹽能力的強弱，可將解磷細菌劃分為無機磷細菌和有機磷細菌。目前，一般測定微生物是否具有解磷能力有平板法、液體培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)3種方法。前面2種是目前實驗室研究中最經常采用的方法。本實驗通過采集農大后街的桔子樹、柚子樹和石榴樹三種果樹的根際土壤，從中分離無機磷細菌, 篩選出有較強解磷能力的菌株, 以期為今后解磷菌的開發(fā)應用提供技術基礎。1材料與方法1.1 供試材料1.1.1 菌株作物、盆栽、樹木根際土壤，翠湖、污水旁土壤等都含有大量解磷菌，我分別從桔樹、柚子樹、石榴樹的根際采取土樣，土壤采樣深度為5-15厘米，將采回的土樣自然風干

12、，用研缽研細后貯存于透明封口袋內并編號，立即使用或4冰箱中保存，待用。1.1.2 培養(yǎng)基I 斜面保存和菌種鑒定培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏，0.5%；蛋白胨，1%；葡萄糖，0.5%；氯化鈉，0.5%，瓊脂2%。pH7.07.2，121滅菌20min。II 用于分離、鑒定無機磷細菌的固體培養(yǎng)基：無機磷培養(yǎng)基: 解磷細菌Ca3(PO4)2分離培養(yǎng)基：Glucose 10g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaC1 0.3 g，KC1 0.3 g，MgS047H20，0.3 g，F(xiàn)eSO4 7H20 0.03 g，MnSO4 H20 0.03 g，Ca3(PO4)2 5.0 g，瓊脂20g，定

13、容至1000 ml，pH7.2。1.1.3 主要儀器設備及藥品試劑儀器設備：4冰箱、電子天平、滅菌鍋、超凈工作臺、28的全溫振蕩搖床、28 生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、15ml試管、1000l或250l移液槍以及槍頭、250ml三角瓶、100ml量筒、1000ml燒杯、玻璃棒、培養(yǎng)皿、接種針、游標卡尺、紫外分光光度計、容量瓶（50ml、100ml、200ml）藥品：濃硫酸、濃高氯酸、鉬酸銨、酒石酸銻鉀、磷酸二氫鉀、抗壞血酸。試劑：2gL,2,4-二硝基酚指示劑；4molL氫氧化鈉溶液；0.5molL硫酸溶液；鉬銻貯存液；鉬銻抗顯色劑；5ugml磷(5ppmP)標準溶液。1.2方法1.2.1 解磷細菌的

14、生物富集分別稱取保存的土樣各1g加入到裝有9ml無菌水的試管中編號，混勻，靜置5min左右后用移液槍吸取1ml土壤上清液至250ml三角瓶裝液99ml的無機磷液體培養(yǎng)基中，貼標簽標記，置于28的全溫振蕩搖床振蕩培養(yǎng)3d。1.2.2 菌體初篩分別吸取l ml上述搖瓶培養(yǎng)液于盛有9 ml無菌水的試管中，吹打混勻，吸取1ml 菌懸液進行10倍梯度稀釋，將濃度為10-4，l0-5，1O-6，10-7 的稀釋液各吸取0.1ml 分別接到無機磷固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻后倒置于28 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，無機磷固體培養(yǎng)基中的難溶性磷酸鹽在微生物溶磷機理的作用下溶解，會在菌體周圍形成一定的透明圈,依據透

15、明圈大小進行平板篩選和鑒定。選擇有較大清晰水解圈的菌株繼續(xù)接種到無機磷固體培養(yǎng)基上進行劃線分離純化，以獲得較穩(wěn)定的純培養(yǎng)。用游標卡尺測量出水解圈和菌落的直徑，將水解圈直徑和菌落直徑比值大且水解圈解圈清晰度高的菌株接種到無機磷固體培養(yǎng)基上，在28 生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后，連續(xù)培養(yǎng)5代，選擇遺傳穩(wěn)定的解磷菌，4斜面保藏備用。1.2.3 解磷細菌的鑒定形態(tài)學鑒定：將篩選出來的具有最大解磷能力的菌株在瓊脂平板上培養(yǎng)，觀察細菌菌落生長特征，注意其生長速率（快、中等、慢）、表而特征(光滑、粗糙、皺紋、同心環(huán)、輻射狀等)、形狀、大小、顏色、透明度、邊緣特征(光滑、鋸齒狀、波浪狀、纖維狀)、降起形狀( 凹、凸

16、、平)等，并作記錄。同時用接種環(huán)挑取單菌落上的細菌進行革蘭氏染色，鏡檢，記錄結果。1.2.4解磷菌解磷能力的測定：將斜面保存的菌種接入裝有液體無機磷培養(yǎng)基的三角瓶，搖床振蕩培養(yǎng)7d，7d后，在4下以10000 rmin的轉速離心5min，取上清液20ml用鉬銻抗比色法測磷含量，將培養(yǎng)物定期取樣，離心，測定水溶性磷含量，以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標，以溶磷濃度為縱坐標繪制曲線。同時用劃平板的方法培養(yǎng)細菌，3d后觀察并記錄細菌生長量。2 結果與討論2.1 菌株初篩結果來源于桔樹根際土壤中的菌種篩選結果表明，從中可以篩選出大量解磷能力強的菌種。本次實驗在桔子樹的根際土壤中共篩選出來了3株具有較明顯水解圈

17、的菌株，有2株水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值(Dd)大于2.4，分別編號1、2號，其中有一株水解圈直徑(D)與菌落直徑(d)最大比值達到2.6 以上，解磷效果最為明顯。表1 三種土壤篩選結果Table 1 three soil screening results土樣 結果桔樹 平板上菌株生長正常，經7天培養(yǎng)后有三個菌落周圍有明顯水解圈柚子樹 平板上有菌落生長，淺黃色，呈圓形，黏膩，無水解圈石榴樹 平板上有菌落生長，淺黃色，呈圓形，無水解圈表2 菌落直徑與水解圈直徑Table 2 colonies diameter and hydrolysis circle diameter菌株編號 水解

18、圈直徑 菌落直徑 水解圈直徑(D)菌落直徑(d) 1號 105mm 4mm 2.625 2號 11mm 4.5mm 2.44 圖1 無機磷解磷菌初篩平板 Figure 1 inorganic phosphorus early XieLin bacteria screen plate2.2 菌株形態(tài)學鑒定結果221 形態(tài)學鑒定通過菌落形態(tài)特征的觀察，可判斷篩選到的2株溶磷菌都為細菌。對篩得的1號菌株解磷菌在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 培養(yǎng)72h，對菌落特征進行觀察，并取單個菌落進行革蘭氏染色，對細菌菌體形態(tài)特征進行觀察。結果見表3、表4、圖2、圖3。表3 菌落形態(tài)特征Table 3

19、colony morphology characteristics菌株形狀外觀邊緣顏色透明度與光澤1號近似圓形扁平表面濕潤易挑起不規(guī)則乳白色不透明有光澤表4 細菌形態(tài)特征Table 4 bacteria morphological characteristics菌株菌體形態(tài)革蘭氏染色1號菌體微小，短桿狀，單個或呈短鏈狀排列 陰性圖2 菌落的形態(tài)特征Figure 2 colonies morphological feature of圖3 細菌的革蘭氏染色Figure 3 grams staining of bacteria2.3 菌株解磷能力鑒定結果在初篩的基礎上對篩選到的2株水解圈直徑與菌落直

20、徑比值(Dd)較大的菌株進行液體搖瓶復篩，結果如下。表5 磷標準曲線的繪制Table 5 p standard curveppmP標準磷溶液00.10.20.30.40.50.6吸收值00.1510.2640.3870.5050.6210.744表6 解磷細菌的搖瓶復篩結果Table 6 XieLin bacterial wave bottle after screening results菌株 水溶性磷含量 菌濃 1號 31.13mgL 5x1010個ml 2號 25.43mgL 4.2x1010個ml通過復篩結果發(fā)現(xiàn)，水解圈直徑和菌落直徑比值大的，復篩測得的可溶性磷含量也高。3 小結和討論

21、本試驗通過對桔樹、柚子樹、石榴樹三種果樹的根際土壤所含解磷細菌進行初篩，五代連續(xù)純培養(yǎng)，液體搖瓶復篩測定解磷能力，以及解磷細菌的形態(tài)學初步鑒定，得到結果如下：1、初篩結果表明：在桔樹的根際土壤中分離純化出可以溶解磷酸鈣的無機磷細菌，但是沒有在柚子樹和石榴樹的根際土壤中分離出解磷菌，可能是我采集的這兩種植物根際土壤所含解磷菌量微小甚至根本沒有，而且操作過程中染了雜菌。經過實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的PH最好控制在7.0，如果偏堿或者偏酸則培養(yǎng)出來的菌株呈黃色鼻涕狀，無透明圈，說明不是解磷菌。溫度也是影響微生物生長和代謝的一個重要原因，當溫度在微生物的最適范圍內變化時，它的生長和代謝正常且平穩(wěn)，超過這個范圍

22、，則生長代謝急劇下降甚至停止代謝，從而透明圈過小，甚至沒有菌株出現(xiàn)，所以搖床溫度和生化培養(yǎng)箱溫度最好控制在28C至30C。2、五代連續(xù)純培養(yǎng)結果表明：在培養(yǎng)基配制正常的情況下連續(xù)培養(yǎng)，部分菌株到了第三代就沒有水解圈出現(xiàn)，而到了第五代仍出現(xiàn)水解圈的菌株，其透明圈的大小相對變小，解磷能力減弱，據Kucey報道，在菌株純化過程中，有近50%的解磷細菌會失去解磷能力。我對這種現(xiàn)象產生的機制并不明了，可能與培養(yǎng)基PH有關。3、液體搖瓶復篩結果表明：分離純化所得的磷細菌體中有大量水溶性無機磷存在，說明菌株能夠對無機磷酸鹽進行過量吸收并大量貯藏在細胞內。相比較同伴們的實驗結果，我測得的1號和2號菌株的水溶性

23、磷含量不高，可能是由于固體和液體培養(yǎng)基條件的不同、操作的差異以及菌株本身解磷能力的差異等造成的。根據透明圈的大小只能定性地檢測菌株解磷能力，而用液體定量測磷的方法能更準確地確定菌株解磷能力的大小，因此在解磷菌的篩選中，液體的搖瓶復篩是很重要的一個步驟。實驗數據表明水解圈直徑和菌落直徑比值大的，復篩測得的可溶性磷含量也高：1號菌株的水溶性磷含量為31.13mgL，2號菌株的水溶性磷含量為25.43 mgL，這和大部分前人結果一致。但是有的前人的實驗中，水解圈直徑與菌落直徑比值大的復篩測得的可溶性磷含量反而低，Dd小的反而可溶性磷含量高，這可能和微生物解磷時分泌的無機解磷酶與無機磷的接觸面積有關。

24、4、解磷菌的研究對發(fā)展持續(xù)高效農業(yè)具有深遠的戰(zhàn)略意義。土壤中解磷菌的數量受土壤物理結構、有機質含量、土壤類型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影響, 因而不同土壤中解磷菌的數量存在較大差異, 而大部分解磷菌均出現(xiàn)在植物的根際土壤中。從土壤中篩選出高效解磷微生物，研制成解磷菌劑拌種或直接施入土壤，將土壤中難溶性磷活化出來供作物有效吸收，可以大幅度增加產量。本次試驗只是從果樹根際土壤中分離出解磷細菌并做了初步鑒定，但要想進一步應用到實際生產中，還必須進行田間試驗。參考文獻1AbdAlia MHPhosphatases and the utilization oforganic phosphor-U

25、S by Rhizobium legum inosarum biovarviceaejLetters in AppliedMicrobiology，1994，18：294 2962TAO GuangCa，TIAN ShuJun，CAI MiaoYing，et a1Phosphate So lubilizing and Mineralizing Abilities of Bacteria Isolated fromSoilsJPedosphere 2008，18(4)：5153Xie LH ，LuJL，ZhangYP，et a1Influence oflongtermferti1ization OI1 phosphorus fertility of calcareous soil IIInorganic and 0rganicphosphorusJChinese Journal of Applied Ecology，2004，15(5)：7907944葛城微生物肥料的生產