制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應(yīng)用技巧

1、.制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應(yīng)用技巧轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園發(fā)布日期: 2007-01-28 16:16 文章來源: 丁香園 - 免疫學(xué)技術(shù)討論版 1901關(guān)鍵詞: 膠體金 硝酸纖維素膜 NC膜 選擇 技巧 前言 硝酸纖維素膜又稱為NC膜，在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。所以NC膜成為該試驗(yàn)中最重要的耗材，而由于其屬于非標(biāo)準(zhǔn)器件，基本上每個(gè)項(xiàng)目開始階段都會(huì)遇到如何選擇合適的NC膜的問題。同時(shí)也存在是否要對NC膜進(jìn)行，期處理及如何處理的討論。 一. NC膜的生產(chǎn)原理 這個(gè)雖然看上去屬于生產(chǎn)廠商的事情，但是GMP有個(gè)觀點(diǎn)是強(qiáng)調(diào)對過程的控制才會(huì)有好的結(jié)果。那么只有了

2、解NC膜的大致生產(chǎn)過程和基本原理才能更好的掌握這種材料的特性，最終制作出滿意的試紙.你了解嗎？ 我找了很久，終于找到一些比較直觀的圖片，大家可以到伊能公司的官方網(wǎng)站看到 首先，勻漿配比 購買回的原料硝酸纖維素粒子是一種非常普遍的有機(jī)化學(xué)物，溶解形成混漿，在該漿體內(nèi)，會(huì)加入一定比例的試劑來調(diào)整最后形成的膜的性質(zhì)，一般是一個(gè)試劑配方，主要包含表面活性劑/高分子聚合物/鹽離子/成型劑等溶解在一個(gè)緩沖體系內(nèi)。 不同的廠家加入的溶液配方不一樣，直接導(dǎo)致了在產(chǎn)品的差異。 其次，滾筒鋪膜 配好的勻漿通過滾筒，形成了一張薄膜，平攤在十分光滑的平面載體上。這個(gè)和造紙的過程是非常相似的。 最后，成型 在勻漿內(nèi)的成

3、型劑開始揮發(fā)，膜逐步干燥成型。同時(shí)在這個(gè)過程中由于溫度比較高，有些廠家在這個(gè)過程采取了在密閉腔體內(nèi)成型，同時(shí)補(bǔ)充配方溶液的形式，來避免一些有效成分的蒸發(fā)。切割出產(chǎn)品 通過以上步驟生產(chǎn)出來的膜是呈一個(gè)寬度極大的產(chǎn)品，寬度的大小直接和滾筒的大小相關(guān)，滾筒越大生產(chǎn)越方便，但設(shè)備的成本也越高.寬膜要經(jīng)過切割才能成為我們購買到的25mm或18mm（或20mm）寬，而長度上，成品卷膜和寬膜的長度是相同的.理論上可以讓廠家切成你需要的任意寬度，但這樣會(huì)造成原料的浪費(fèi)和人力成本的增加，后來廠商在和試紙生產(chǎn)廠家的協(xié)調(diào)過程中，綜合用料成本和生產(chǎn)便利性基本確定了上面說的寬度，以次為標(biāo)準(zhǔn).關(guān)于不同寬度的用途差異，稍后

4、詳述。 從生產(chǎn)的過程，我們可以得知，NC膜本身是已經(jīng)添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經(jīng)存在有一定的緩沖系統(tǒng)（雖然對紙條測試影響不會(huì)很大）。對后面談到的一些問題就比較容易理解。二.NC膜的供應(yīng)商及現(xiàn)狀 現(xiàn)在有銷售的NC膜品牌型號(hào)如下： MILLIPORE（美國），M135（有背襯/無背襯兩種） M180（有背襯/無背襯兩種） WHATMAN and S&S，Puraband impuraband SARTORIUS（德國），CN140 伊能（國產(chǎn)），8um 6um MDI（印度），8um 6um 說到這些供應(yīng)商，不得不談?wù)劙l(fā)展的歷史. S&S是膜行業(yè)的鼻祖，這點(diǎn)所有的膜公司都承認(rèn)。mill

5、ipore，SARTORIUS和whatman都是后輩，我的理解是S&S在市場競爭的過程中經(jīng)營方式落后，最后被whatman收購。就產(chǎn)品質(zhì)量來說S&S的AE99和AE98是非常優(yōu)良的。而MDI是近年才出現(xiàn)的一個(gè)膜公司，可能也是與印度膠體金試紙生產(chǎn)行業(yè)的快速發(fā)展密切相關(guān)，其所有的產(chǎn)品都是在印度生產(chǎn)，經(jīng)營者為父子兩人，父親負(fù)責(zé)技術(shù)，兒子進(jìn)行經(jīng)營。03年我曾測試過其樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在跑板方面有不均勻波浪現(xiàn)象，且加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果很不理想。今年初我又收到了一些樣品，情況仍然沒有太大改善，后來就不再考慮使用了。國產(chǎn)膜伊能是在去年開始進(jìn)入市場的，主要特點(diǎn)是能降低成本，樣品我也試測了幾批，性能已經(jīng)與進(jìn)口膜很接

6、近，經(jīng)過一些有針對性的優(yōu)化后可以用在HCG產(chǎn)品的生產(chǎn)。但不是所有的工廠都能購輕易的完成這個(gè)優(yōu)化工作。膜的國產(chǎn)化是一個(gè)趨勢，但進(jìn)口廠家要實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化還面臨很大的問題，其中廠房設(shè)備的搬遷就是一個(gè)非常大的問題。幾家供應(yīng)商的國內(nèi)聯(lián)絡(luò)人和技術(shù)支持分別是 MILLIPORE（美國），Mrs Yang，harry WHATMAN and S&S，Clark，kevin SARTORIUS（德國），Mr Xu，Iric 伊能（國產(chǎn)），connie，Mr Yang MDI（印度），Ashawant Gupta 銷售模式都是直銷式，少量購買的情況下要通過代理商走一下帳。價(jià)格上MILLIPORE與WHATMAN相當(dāng)，

7、SARTORIUS便宜一些，國產(chǎn)膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS價(jià)格相同，基本不用考慮。在科研市場，MILLIPORE使用最多?？蒲惺袌鲇捎趦H用來試驗(yàn)，所以膜需求量小，不被供應(yīng)商重視。生產(chǎn)客戶中，MILLIPORE，WHATMAN，SARTORIUS占有量相當(dāng)，伊能現(xiàn)在也開始有一些工廠客戶了，MDI量最小投訴也最多。 三.膜的選擇 以上談了該行業(yè)的一些發(fā)展現(xiàn)狀，那么我們大致了解后，回到最關(guān)心的問題，如何選擇膜？經(jīng)常會(huì)遇到的問題是，我是做*項(xiàng)目的，我該選擇那類膜？ 這里涉及到一個(gè)膜的分類標(biāo)準(zhǔn)問題，一個(gè)供應(yīng)商可能提供這個(gè)膜是8um，但另一個(gè)供應(yīng)商告訴你膜是135s的。這之間的區(qū)別與聯(lián)系是什

8、么？um指的是膜孔徑，而從上面膜的生產(chǎn)過程，我們可以看出，膜的孔徑實(shí)際上是沒有辦法界定的。由于干燥成型等過程的非絕對均一，膜的孔徑也是非均一的.膜孔徑的說法實(shí)際上是沿用了一直以來的一個(gè)形象稱呼.而以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時(shí)間是*s.該單位已經(jīng)越來越被各大廠商所接受，成為了一個(gè)通用的比較標(biāo)準(zhǔn).以下我們將采用s單位來進(jìn)行交流。換算情況大致為：8um=135s；6um=180s 不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)有什么影響呢？ 首先，我們分析一下液體在膜上的運(yùn)動(dòng)過程。一張長度為4cm的膜， 每隔1cm做一個(gè)標(biāo)記， 當(dāng)液體運(yùn)動(dòng)過標(biāo)記處時(shí)記錄時(shí)間點(diǎn). 那么你將會(huì)發(fā)現(xiàn)液體在膜上的運(yùn)動(dòng)是呈減速前行的。而兩張

9、不同秒數(shù)的膜（例如135s， 180s）在同一時(shí)間標(biāo)記點(diǎn)處的運(yùn)動(dòng)速度不同.這個(gè)試驗(yàn)用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。那么從這個(gè)試驗(yàn)可以看出，在通過同一T線噴點(diǎn)位置時(shí)，金溶液通過的速度是快速膜慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時(shí)還有一個(gè)問題是，反應(yīng)時(shí)間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個(gè)讀數(shù)時(shí)間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。其實(shí)我們并沒有那么多選擇。經(jīng)過使用實(shí)踐，各供應(yīng)商一般都只提供兩個(gè)型號(hào)，就是135s和180s。

10、 雖然看到有些廠家的產(chǎn)品目錄上型號(hào)種類繁多，但這兩個(gè)型號(hào)的定貨量就占了95%以上，其他型號(hào)供貨上也就遠(yuǎn)不如這兩個(gè)型號(hào)來得順利。135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. 你所要做的是，先選擇其中的一個(gè)型號(hào)， 然后比較不同供應(yīng)商同一個(gè)型號(hào)的差異，由于前面說的添加配方與你的試驗(yàn)條件配合的不同，這個(gè)差異可能大也可能小。具體要根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來確定最后的選擇。我個(gè)人不建議地毯式的測試不同規(guī)格/不同廠家的膜，這樣成本高，成功的幾率也小。四.膜的質(zhì)控方式 本節(jié)適合用膜量較大的公司用戶參考。對于一卷膜可以用上幾個(gè)月的用戶來說，廠家的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)完全能滿足你的要求，而不需要自己再做相關(guān)的質(zhì)控。膜的質(zhì)控

11、雖屬于原輔料QC職能，但由于其專業(yè)性強(qiáng)，一般都由小樣調(diào)試人員來執(zhí)行。膜入原料庫后需要進(jìn)行如下檢驗(yàn)工作： 1. 查收COA 在購買時(shí)， 供應(yīng)商會(huì)隨產(chǎn)品為每個(gè)lot的膜提供一張紙質(zhì)的出廠質(zhì)量證書， 該證書被稱為COA。如果你已經(jīng)購買某一批次的膜， 而沒有索取相應(yīng)的證書， 如果有需要可提供批號(hào)向廠家要求補(bǔ)發(fā)。其實(shí)在很多行業(yè)都有廠商為自己的產(chǎn)品附上COA的習(xí)慣。COA一般只提供給大客戶， 對小客戶是沒有意義的。其內(nèi)容主要是廠家在產(chǎn)品出廠時(shí)做過一些測試的羅列。作用可以理解為質(zhì)量憑證和測試數(shù)據(jù)參考。2. 檢查物理性能 膜的物理性能主要是2個(gè)參數(shù)， 膜厚度和寬度。長度不需要檢測。使用中可以關(guān)注長度上是否有斷

12、面重接現(xiàn)象， 斷面多費(fèi)料則多， 少數(shù)發(fā)生。厚度，由螺旋測微尺，選擇幾個(gè)測量點(diǎn)檢測后算平均。膜生產(chǎn)的必測參數(shù)。主要表現(xiàn)為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點(diǎn)出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速。寬度，普通直尺測量。物理性能一般都不會(huì)有什么大問題。畢竟檢測標(biāo)準(zhǔn)客觀，易把握。沒有條件執(zhí)行的廠家可省略。 3. 跑水性能 樣本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易觀測，需制作一個(gè)簡易支架。操作：注入足夠溶液到下部槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長大于4cm）并放到傾斜支架，整個(gè)支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計(jì)時(shí)。記錄每個(gè)標(biāo)記處的通過時(shí)刻，并與對照組比較。跑板時(shí)，理論上溶液呈水平線形

13、式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反?，F(xiàn)象。4. 點(diǎn)樣測試 C/T線出線時(shí)間，其他試驗(yàn)條件相同情況下，記錄和比較C/T線出現(xiàn)時(shí)間是否與對照有差異。靈敏度，比較不同樣本濃度情況下，T線的變化是否和對照組同。一般每批次膜取前端一段用來測試即可。由于制造過程的不均一性， 不同批號(hào)的靈敏度會(huì)有一定差異，當(dāng)大批量使用時(shí)，這種差異影響是非常大的，那么就要按照靈敏度表現(xiàn)將不同批號(hào)的膜進(jìn)行分類。在膜的STOCK中要能夠輕易的分辨出來。當(dāng)進(jìn)入后期生產(chǎn)調(diào)用時(shí)，就能根據(jù)這些分類，按照訂單要求取用不同批號(hào)的膜，或者用強(qiáng)靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配。 關(guān)于膜的批內(nèi)差。批內(nèi)差是肯定存在的，只是差距大小的問題，依據(jù)

14、一般的測試條件是很困難獲得詳細(xì)的數(shù)值，因?yàn)槟悴豢赡軐γ恳痪砟さ拿恳欢味甲鲈敿?xì)的測試。減小膜批內(nèi)差的最有效方法是不購入邊緣膜帶。前面說過膜的生產(chǎn)方式，生產(chǎn)出的半成品是寬幅很大的一個(gè)膜面，要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度。那么就有中間部分，和邊緣部分之分.越靠近中間部分，膜的均勻性越好，邊緣部分則相對要差，就造成了批內(nèi)差。一般可以通過COA獲得具體位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置。如果是試用某個(gè)型號(hào)的膜小樣，還需要在以上檢測后加入膜加速老化試驗(yàn)，包括膜單獨(dú)的老化試驗(yàn)和點(diǎn)好膜后產(chǎn)品的老化試驗(yàn)， 具體試驗(yàn)方法請參看我以前寫的研發(fā)

15、思路一文。 五.膜的深入探討和應(yīng)用技巧 從本節(jié)開始，我們開始對膜進(jìn)行深入討論和談一些應(yīng)用技巧。1. 蛋白與膜的結(jié)合原理 蛋白與膜的結(jié)合原理， 已知的結(jié)合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等，確切的結(jié)合原理并不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：1）首先兩者靠靜電作用力結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用來維持長時(shí)間結(jié)合。 2）首先兩者靠疏水作用結(jié)合，然后靠靜電作用來維持長時(shí)間結(jié)合。兩條假說，都表明其結(jié)合過程分為兩步，首先結(jié)合和后面長時(shí)間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。2. 膜對結(jié)合的影響 1）膜孔徑 有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜，但是請注意這只僅僅限于同一廠

16、家的產(chǎn)品，如果是不同廠家的產(chǎn)品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關(guān)系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實(shí)際可用表面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率（實(shí)際可用表面積與所用膜平面積的比率）。 另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那么金標(biāo)復(fù)合物通過T線的時(shí)間也就越長，反應(yīng)也就越充分。綜合以上兩點(diǎn)，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時(shí)也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)，也就是假陽性越高.所以要按照試驗(yàn)結(jié)果挑選適合實(shí)際項(xiàng)目的膜，找到合適的平衡點(diǎn)。 2）不同廠家的膜差異 這個(gè)差異主要來源于兩點(diǎn)：1生產(chǎn)膜時(shí)，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數(shù)量不同。同理，在膜

17、處理中這兩類物質(zhì)一般會(huì)對性能產(chǎn)生較大影響。 2 處理過程不同。3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方 1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。首先，單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體，主要時(shí)由于多克隆抗體有很多不同的表面位點(diǎn)，而各位點(diǎn)與膜的最佳結(jié)合條件都有細(xì)微的差別，毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結(jié)合到固相材料上。 2）緩沖液 大家最關(guān)心的可能就是希望獲得一個(gè)性能優(yōu)良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。 其實(shí)我也無法提供給你一個(gè)萬用配方清單。因?yàn)椴煌姆磻?yīng)體系需要不同的配方來支持， 而不同機(jī)構(gòu)的反應(yīng)體系又有差異。想獲”魚”先學(xué)”漁”.。為

18、了不誤導(dǎo)大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。緩沖液的構(gòu)成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質(zhì)（針對某一特定問題）+PH調(diào)整. 我在參考過以前的各種資料后，個(gè)人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據(jù)自己的需要添加作用物質(zhì)，原來的很多需要添加的作用物質(zhì)，由于膜制造技術(shù)的改進(jìn)已經(jīng)不再需要。推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應(yīng)性。作用物質(zhì)的情況大致羅列如下：少量NACL，減少信號(hào)強(qiáng)度，消假陽。有機(jī)醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結(jié)合包被。個(gè)人不推薦，因制膜工藝改進(jìn)。表面活性劑（TW20，TX100

19、），增加親水力，可避免線條中空現(xiàn)象，也可增色。糖，保護(hù)劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。調(diào)PH到某個(gè)位置，可以消假陽。 4. 點(diǎn)樣環(huán)境 環(huán)境濕度對點(diǎn)膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點(diǎn)膜容易出現(xiàn)散點(diǎn)，導(dǎo)致測試會(huì)出現(xiàn)疏水斑。濕度過高，膜上毛細(xì)作用加強(qiáng)，點(diǎn)膜容易引起CT線變寬甚至擴(kuò)散。為了保證點(diǎn)樣時(shí)膜濕度的均一性，一般在點(diǎn)樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時(shí)間。 5. 點(diǎn)樣儀器與膜面情況的關(guān)系 目前有兩種點(diǎn)樣方式，劃膜式和非接觸點(diǎn)膜式.非接觸點(diǎn)膜式優(yōu)于劃膜式，進(jìn)口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。 因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆，劃管會(huì)在其

20、表面留下印痕.進(jìn)口的劃膜機(jī)由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好，所以留下的劃痕較輕，而國產(chǎn)儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴(yán)重。 劃痕容易對層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力，導(dǎo)致假陽性。 同時(shí)容易出現(xiàn)跑板時(shí)在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細(xì)線（鬼線），而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。 6. 膜的寬度與點(diǎn)樣位置 膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點(diǎn)樣位置將帶來不同的靈敏度。點(diǎn)樣位置上移，金標(biāo)復(fù)合物通過T線位置時(shí)速度變慢，反應(yīng)時(shí)間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個(gè)方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。 7. 溶液在膜上的擴(kuò)散 溶液在膜上的點(diǎn)樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴(kuò)散是趨向兩端的，噴點(diǎn)上去的是均勻的抗體溶液，但當(dāng)干燥時(shí)線條邊緣的干燥速度高于中間，中間的抗體會(huì)不斷向兩邊擴(kuò)散，所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗(yàn)。如果你發(fā)現(xiàn)線條出現(xiàn)兩端紅，中間淡的現(xiàn)象，就要考慮這個(gè)問題了。可以加如上面說的作用物質(zhì)來解決。 8. 點(diǎn)膜前后的封閉作用 從供應(yīng)商處購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的，直接點(diǎn)膜就可使用.然而我們還是經(jīng)常會(huì)遇到關(guān)于封閉的討論。其實(shí)封閉不象大家認(rèn)為的那樣，一封閉什么問題都