超級細菌給我們的警示,中兒2010-12

1、專論超級細菌給我們的警示陸權(quán)“超級細菌”（Superbug）一個形象地比喻細菌泛耐藥的代名詞，原本是臨床醫(yī)學和微生物學界關(guān)注和研究的項目，近3個月間在全球傳媒上被報道得沸沸揚揚，由此產(chǎn)生的各種觀點和聲音，足以使我國兒科工作者去正視和了解，本文就此談點自己的看法。1、 事情的由來2010年8月11日柳葉刀感染病學（Lancet Infect Dis）雜志在線發(fā)表了Kumarasamy等一篇題名為“在印度、巴基斯坦和英國，一種新的抗生素耐藥機制的出現(xiàn)：其分子學、生物學和流行病學的研究”的文章1。文中提到了一種帶有新德里金屬-內(nèi)酰胺酶1（New Delhi metallo-lactamase 1，N

2、DM-1）基因的、耐碳青霉素烯類抗生素的革蘭陰性腸桿菌科細菌，其潛在性地可能成為全球公共健康問題。該文研究對象的180株菌株分別來自南印度Chennai市（44株），北印度Haryana市（26株）和英國（37株），其中印度兩城市菌株為2009年度分離所得，英國菌株為20082009年度，取自英國抗生素耐藥監(jiān)測和參考實驗室，原始來源于英國25個實驗室，包涵了英格蘭、蘇格蘭和北愛爾蘭地區(qū)。此外，該研究還包括48株來自印度Mumbai等3所城市的菌株和25株采自巴基斯坦Charsadda等8所城市的菌株。涉及攜帶NDM-1基因的主要細菌有肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、變形桿菌、不動桿菌屬、弗

3、勞地枸櫞酸菌、摩氏摩根菌和普魯威登菌等。攜帶NDM-1基因的細菌在體外藥敏試驗中，對所有內(nèi)酰胺類及其酶抑制劑復合制劑、單環(huán)類抗生素、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等均高度耐藥，尤其對亞胺培南、美洛培南的敏感率僅03%。唯一敏感的抗菌藥物是粘菌素（colistin）和替加環(huán)素（tigecycline），前者敏感率約89%100%，后者56%67%。雖然攜帶NDM-1基因的細菌引起全球關(guān)注是在2010年，但在2009年Yong等2對攜帶該基因的1株肺炎克雷伯菌（Kp-05-506）已作了詳盡的分子生物學作者單位：200040 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科（Email：luquan-sh）研究。

4、該菌株來自1位59歲男性印度裔瑞典患者尿液培養(yǎng)中，該患者生活在瑞典，但經(jīng)常往返印度，患有型糖尿病。2007年12月因臀部巨大膿腫而在印度新德里住院，而后又發(fā)生褥瘡潰瘍。2008年1月8日其回到瑞典，1月9日從尿培養(yǎng)中分離得到Kp-05-506菌株，該菌株對碳青霉烯類等抗菌藥物耐藥，當時患者并無尿路感染癥狀，尿菌落計數(shù)1000CFU /ml。同時，該患者臀部傷口深處還分離到產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBL）的大腸桿菌以及對碳青霉烯類抗生素敏感的不動桿菌，并從其外耳道分離到ESBL陽性的大腸桿菌。2008年3月6日該病人出院，2008年4月1日再取尿培養(yǎng)，分離出ESBL陽性的肺炎克雷伯菌，而原先對碳青霉

5、烯類抗菌藥物耐藥的Kp-05-506菌株再也沒有從該患者任何標本中分離出。Kumarasamy等的論文在討論中提到了中國，認為雖然在中國抗生素耐藥已被高度關(guān)注3，但bla NDM-1的迅速出現(xiàn)同樣應(yīng)引起中國注意。2010年8月13日，中國中央電視臺新聞聯(lián)播中稱“超級細菌正在向全球蔓延”，各種傳媒也敏銳地捕捉信息予以報道。同時，衛(wèi)生部、中華醫(yī)學會、中國醫(yī)師協(xié)會、中國疾病控制預(yù)防中心（CDC）、部分國內(nèi)專家等均紛紛表述觀點和建議對策，“超級細菌”的凸顯使醫(yī)務(wù)人員警覺，也使社會公眾困惑，難道我們真的面臨無所適從的窘地？2008年10月26日中國CDC宣稱，我國已檢出3株NDM-1陽性的細菌，其中2株

6、為屎腸球菌，由寧夏CDC送檢，菌株采自2010年3月該地某縣級醫(yī)院2例低出生體重的新生兒；另1例由中國軍事醫(yī)學科學院實驗室所分離的鮑曼不動桿菌，采自2010年6月福建某醫(yī)院1位83歲的老人。這一報道說明攜帶NDM-基因的細菌在我國也客觀存在，而中國CDC分離的革蘭陽性菌屎腸球菌攜帶該基因乃是全世界首次報告，且發(fā)生在新生兒，這在兒科界是一件值得關(guān)注的事。2、 NDM-1的分子結(jié)構(gòu)和特性Yong等2對攜帶NDM-1基因的耐碳青霉烯類抗生素的Kp-05-506菌株作金屬酶表型和分子學檢測，該菌株對所有內(nèi)酰胺類抗生素包括亞胺培南、美洛培南、厄他培南均耐藥，唯一對粘菌素敏感，表型確認為產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶（M

7、BL），但PCR擴增分析，該金屬酶與已知的作為對照的blaVIM、blaIMP、blaSPM-1、blaSIM-1和blaATM-1型均不同源，屬于一種全新的基因型，根據(jù)其可能的來源，稱之為新德里金屬內(nèi)酰胺酶-1（blaNDM-1）。Kp-05-506菌株的嚴重泛耐藥性通過基因分型和氨基酸測序得以明確有3處耐藥相關(guān)區(qū)域。證據(jù)提示該菌存在2種不同的內(nèi)酰胺類耐藥機制：第一種由Amp C酶介導，基于其在體外對EDTA耐藥，但對氯唑西林敏感，此耐藥基因位于2.1Kb片段中。其攜帶blaCMY-4基因，呈Amp C表型，其上游為一完整的ISEcP1基因拷貝，可能負責與blaCMY-4的轉(zhuǎn)座和移動，其下游

8、則為blc基因，通常與blaCMY伴存，最早由Kang等所報道4。第二種則為MBL酶介導，因其在體外對氯唑西林和克拉維酸耐藥，但對EDTA敏感，其位于4.3Kb片段中。此MBL基因就是全新基因blaNDM-1，呈一嵌合體（chimera）位于肺炎克雷伯菌染色體DNA（Kpc-DNA）與Is26和Tn3轉(zhuǎn)座基因的插入部分之間。Kpc-DNA由外流蛋白基因（efflux pump）、L-乳酸脫氫酶（ldh）標記的基因組成，這兩者與已報道的肺炎克雷伯菌株MGH78578的染色體DNA有99.5%同源性（基因庫編號CP000647）。該菌株的泛耐藥還與其分子結(jié)構(gòu)中含有其他耐藥基因有關(guān)，已經(jīng)明確：在其4

9、.8Kb片段中尚含有類整合子（class 1 integron），其包含一套獨特的基因，其中有些基因先前在亞洲已有報告，例如緊鄰Int1基因的是arr2基因盒，介導對利福平耐藥，其先前在中國大陸的銅綠假單胞菌和香港地區(qū)的鮑曼不動桿菌中被發(fā)現(xiàn)（基因庫編號分別是EU886979和AY038837）。另一個ere C基因是全新的紅霉素酯化酶基因，其92%核苷酸序列與原先的ere A相同，但其在N末端有額外的10個氨基酸，在整個序列中有31個氨基酸被替換。緊鄰ere C基因的是介導對慶大霉素耐藥的aad A1基因以及介導對氯霉素耐藥的cml A7基因盒，其存在于基因aad A1與qac/sul之間。N

10、DM-1的結(jié)構(gòu)特性：blaNDM-1基因推斷有269個氨基酸，分子量約為275KDa，通過凝膠電泳和質(zhì)譜儀分析提示其可作為一個單體而活化存在，HDM-1具有一個前導多肽，可能的裂解區(qū)是在19號位點2個丙氨酸之間，這與已知的VIM MBLs的裂解區(qū)十分相似。NDM-1也分享了VIM酶在第34和36位點上的附加環(huán)，還在第162至166位點上，具有獨一無二的附加序列。從該結(jié)構(gòu)可以看出NDM-1與其他金屬酶極少同源性，與之最相近的是VIM-1/VIM-2，兩者同源性也僅32.4%。奇妙的是NDM-1在移動的MBLs間尚有一組獨一無二的HXHXD圖譜：在2個組氨酸之間，插入1個丙氨酸。此外，NDM-1在

11、第222位點上的色氨酸為酪氨酸所替代。blaNDM-1基因理論上的等電點（PI）是6.9。NDM-1的功能特性：通過凝膠電泳分析并與IMP-1、VIM-2比較，動力值（Kinetic Values）顯示：NDM-1對大多數(shù)頭孢菌素有緊密聯(lián)接，Km值較低，尤其對頭孢呋辛、頭孢噻肟和頭孢噻吩，對青霉素類也有相對較緊密的聯(lián)接，這與其他金屬內(nèi)酰胺酶不同，例如IMP-1和VIM-2均具有較高的Km值。對于碳青霉烯類抗生素，NDM-1并未像IMP-1或VIM-2如此緊密聯(lián)接。NDM-1的青霉素類抗生素轉(zhuǎn)化率（Kcat）低于IMP-1和VIM-2，對頭孢菌素類抗生素Kcat值與IMP-1更相似，而對碳青霉烯

12、類抗生素的Kcat值則相近于VIM-2。由于NDM-1對大部分頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素的Km值較低，故Kcat/Km比值就相對較VIM-2高，唯一例外的是頭孢他啶，NDM-1對其的Kcat/Km為-0.03，而VIM-2達0.90。總之，NDM-1與IMP-1、VIM-2相比對現(xiàn)有各類抗菌藥物包括碳青霉烯類抗生素均有更強的水解能力。NDM-1的質(zhì)粒分析：攜帶blaNDM-1質(zhì)粒的肺炎克雷伯菌Kp-05-506可成功地將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌J53，轉(zhuǎn)移頻率約為10-4-10-5。blaNDM-1質(zhì)粒大小在Kp-05-506菌株為180Kb，而在大腸埃希菌，NDM-1質(zhì)粒較小，約為140Kb。

13、不同細菌攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒大小不一，這說明該基因在復制或插入時存在有再排列。質(zhì)粒攜帶blaNDM-1同時還攜帶blaCMY-4和類整合子復合體，造成多重耐藥，甚至出現(xiàn)對現(xiàn)存所有抗菌藥物均耐藥的可怕情景。通過質(zhì)粒，NDM-1基因可以在不同細菌間轉(zhuǎn)移，這就造成該基因可為臨床上多種細菌所攜帶，造成不可預(yù)見性、高度耐藥性和治療困難性的嚴峻問題。日本新瀉大學學者用電子顯微鏡成功拍攝了攜帶NDM-1基因的大腸埃希菌圖像，這是全球首張所謂“超級細菌”的照片。該菌長約2微米，與普通大腸桿菌相比，超級細菌的鞭毛數(shù)多，故更具活動度和靈活性。3、 警示與對策準確地講，醫(yī)學上并不存在所謂的“超級細菌”。上

14、述的關(guān)于blaNDM-1的結(jié)構(gòu)、功能特性和質(zhì)粒分析等，可以清楚地看出Yong等是發(fā)現(xiàn)了一種全新的金屬內(nèi)酰胺酶，這種酶主要存在革蘭陰性腸桿菌，尤其是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，此外還可以存在于陰溝腸桿菌、變形桿菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌、弗勞地枸櫞酸菌等，我國報道尚存在于屎腸球菌之中。blaNDM-1基因可為多種細菌所共有，可以通過質(zhì)粒在不同細菌間轉(zhuǎn)移，這就構(gòu)成防治的困難。目前，在印度、巴基斯坦、英國、美國、加拿大、日本、韓國、澳大利亞、比利時、瑞典、荷蘭、法國、德國、肯尼亞、中國大陸、中國香港、中國臺灣等均已有感染或攜帶病例的報告，這就提示攜帶NDM-1基因的泛耐藥細菌是一個全球性問題?，F(xiàn)在資料

15、揭示腸桿菌科細菌檢出NDM-基因的比例為1.2%13%。如果進一步加強監(jiān)測，尤其是主動監(jiān)測，或許還會有更多國家發(fā)現(xiàn)該基因、還會有更多臨床分離的細菌攜帶該基因?！俺壖毦备_切地應(yīng)稱為泛耐藥細菌。事實上，我國在全國耐藥監(jiān)測CHINET報告中，從2007年始已關(guān)注泛耐藥這一問題5-，所謂泛耐藥是指該細菌對頭孢菌素類、碳青霉烯類、內(nèi)酰胺酶抑制劑復合劑型、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物均耐藥，2007年資料中泛耐藥菌株在弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌中所占的平均比例分別是5.9%、3.2%、2.8%和0.3%，2008年分別是4.1%、2.1%、10.9%和0.6%，200

16、9年則為2.7%、1.7%、17.0%和1.8%。顯然，中國泛耐藥的鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌在明顯增多，尤其是前者，這些細菌對碳青霉烯類抗生素均耐藥，而耐藥機制呈多重而復雜8,9。CHINET資料中，兒童患者泛耐藥細菌的比例較低，2007年銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的泛耐藥分別是0.7%和2.2%，而在2008年為0.0%，但資料僅涵蓋上海2所?？苾和t(yī)院，尚不能反映我國兒童泛耐藥菌的全貌?！俺壖毦钡某霈F(xiàn)又一次為我們敲響細菌泛耐藥的警鐘，切不可松懈和怠慢。從現(xiàn)有資料看，NDM-1細菌主要在醫(yī)院內(nèi)，可能通過密切接觸而傳染，通過手和污染醫(yī)療器械或其他物品傳播，而非空氣傳播，通常不會在社區(qū)、普

17、通健康人群中傳播。NDM-1細菌傳播存在有某些高危因素，例如危重病人、ICU病人、長期使用抗菌藥物者、氣管插管機械通氣者、中心靜脈留置導管者等。理論上，免疫功能低下者、早產(chǎn)兒、低出生體重兒也可能是易感人群。已知的NDM-1細菌主要引起尿路感染、血流感染、傷口感染、肺部感染和導管相關(guān)感染等，但其他部位不等于不會被感染，因為一旦這種細菌進入血流，全身各臟器均有可能被累及。攜帶NDM-1基因的細菌并非代表其毒力強，也并非代表其所致感染的嚴重度高，這類感染的臨床表現(xiàn)與敏感菌并無差別，差別在于對現(xiàn)有抗菌藥物的極高和極廣泛的耐藥性。因此，臨床上發(fā)現(xiàn)對一般抗菌藥物治療無效，尤其對亞胺培南、美洛培南等碳青霉烯

18、類抗生素耐藥時，要考慮該細菌是產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶（MBL）的，而NDM-1是一種全新的MBL。一旦懷疑攜帶NDM-1基因，就可以從實驗室中加以確認，這包括表型篩查，表型確認和基因確證。表型篩查推薦使用亞胺培南、美洛培南紙片法（K-B法）或這2種藥物的最低抑菌濃度（MIC）測定法：亞胺培南（10g/片），抑菌圈直徑22mm。MIC法，美洛培南MIC2mg/L，亞胺培南對大腸克雷伯菌屬、沙門菌屬和腸桿菌屬MIC2mg/L，可初步認定產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶。表型確認應(yīng)該使用雙紙片協(xié)同試驗，雙紙片是指亞胺培南紙片（10g/片）和EDTA紙片（1500g/片）；也可以用亞胺培南紙片和亞胺培南/EDTA復合紙片去確認

19、。復合紙片比單藥紙片抑菌圈直徑擴大5mm，或MIC降低8倍，即可判定產(chǎn)金屬酶。表型篩查和表型確認實質(zhì)上是在確認產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶，而基因確證則必須采用NDM-1基因特異引物作PCR擴增和測序。我國尚無攜帶NDM-1基因細菌對臨床治療產(chǎn)生直接影響的報告。但我們必須從各個方面作好充分準備，主動細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的建立和有序擴大，國家層面參考實驗室的建立和確認等都是當務(wù)之急。耐藥監(jiān)測的抗菌藥物應(yīng)該統(tǒng)一，應(yīng)包括碳青霉烯類等5大類抗菌藥物，而針對攜帶NDM-1基因的細菌，尚需添加替加環(huán)素、多粘菌素和磷霉素等。2010年10月9日衛(wèi)生部會同總后衛(wèi)生部和國家中醫(yī)藥管理局共同制訂并在網(wǎng)上發(fā)布的“產(chǎn)NDM-1泛耐藥腸桿

20、菌科細菌感染治療指南（試行版）”給了我們防治的總原則和方向，根據(jù)病情輕重推薦替加環(huán)素、多粘菌素、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和磷霉素等6類藥物，或許這尚需時間和實踐去考驗。在兒童，這些藥物的使用還需注意相應(yīng)的不良反應(yīng)和毒副作用，例如多粘菌素的腎毒性、神經(jīng)毒性，替加環(huán)素的肝臟損害，氨基糖苷類的耳、腎毒性以及氟喹諾酮的軟骨損傷等?！俺壖毦钡某霈F(xiàn)再次告誡我們必須大力提倡合理使用抗菌藥物。2004年衛(wèi)生部等三部委頒發(fā)了抗菌藥物臨床應(yīng)用指導原則10，2008年以來衛(wèi)生部啟動了全國基層醫(yī)療機構(gòu)抗菌藥物臨床合理應(yīng)用培訓的星火計劃和萌芽計劃。已有專家建議抗菌藥物的合理使用應(yīng)該立法，各類相關(guān)指南有不可

21、替代的學術(shù)指導意義，但并無約束力。我們還應(yīng)看到，中國每年生產(chǎn)抗菌藥物原料約21萬噸，其中有9.7萬噸用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，主要用作動物飼料添加劑以預(yù)防動物傳染病和促其生長，這部分占抗菌藥物年總產(chǎn)量的46.1%，我國還存在人與動物的同藥現(xiàn)象。這就衍生出動物對現(xiàn)用抗菌藥物的耐藥以及這種耐藥在人與動物中傳遞的嚴峻問題。歐盟早在2006年1月已全面禁止使用抗菌藥物作為飼料生長添加劑，美國FDA也注意到這一問題，并指出“在可食用動物中應(yīng)用人類的重要抗菌藥物有悖于保護公眾健康和利益”?；蛟S，在我國要解決這類問題更需要國家層面的立法。“超級細菌”的出現(xiàn)是在人類廣泛甚至過度使用抗菌藥物背景下必然出現(xiàn)的一種現(xiàn)象，抗菌

22、藥物的使用會選擇出某些高度耐藥的細菌，攜帶NDM-1基因的革蘭陰性腸桿菌也只是其中之一。20世紀5060年代，全球每年約700萬人死于感染性疾病，而到了世紀之交的1999年，卻上升至2000萬，這主要就是耐藥菌感染所致。開發(fā)新的抗菌藥物僅僅是應(yīng)對策略之一，更重要的是必須減輕抗菌藥物的選擇性壓力，必須合理使用現(xiàn)有的抗菌藥物，杜絕濫用，延長現(xiàn)有抗菌藥物生命、減緩細菌耐藥速度。認識“超級細菌”是防止其在院內(nèi)傳播的第一步，加強醫(yī)院內(nèi)感染的防控，加強醫(yī)院的消毒隔離工作，加強無菌操作規(guī)程、強調(diào)醫(yī)護人員的手衛(wèi)生，加強醫(yī)院環(huán)境的衛(wèi)生管理，加強對醫(yī)療附屬用具的清潔消毒和加強對醫(yī)務(wù)人員和公眾的健康教育等，這一切都

23、是需要再認識并予以認真實施。對“超級細菌”，我們不必恐慌，但必須正視。人類的歷史總是在曲折中前進的，防治泛耐藥細菌的感染也一定是這樣一種規(guī)律，努力探索和攻克耐藥菌感染應(yīng)該是跨國界的全人類的共同責任。參考文獻1Kumarasamy KK, Toleman MK, Walsh TR, el at. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism inIndia, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect Dis,

24、 2010,10（9）: 597602.2Yong D, Toleman MA, Giske CG, et al. Characterization of a new metallo-lactamase gene, blaNDM-1, and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother, 2009,53（12）:50465054.3Heddini A, Cars O, Qiang S, et al. Antibiotic resistance in Chinaa major future challenge. Lanc