臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的質(zhì)量保證PPT課件

1、定定 義義 質(zhì)量保證質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA) 為一產(chǎn)品或?yàn)橐划a(chǎn)品或服務(wù)滿(mǎn)足特定質(zhì)量要求提供充分服務(wù)滿(mǎn)足特定質(zhì)量要求提供充分可信性可信性所必要的所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。 室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC) 由由實(shí)驗(yàn)室工作人員實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和監(jiān)測(cè)和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以中批內(nèi)

2、、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)確定測(cè)定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作。 第1頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)室間質(zhì)量評(píng)價(jià) （External Quality Assessment, External Quality Assessment, EQAEQA） 為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果與靶值的差為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定結(jié)果與靶值的差異，由異，由外單位機(jī)構(gòu)外單位機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果

3、具有可比性。這。這是對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作是對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評(píng)價(jià)和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評(píng)價(jià)，而不是用來(lái)決定在實(shí)時(shí)，而不是用來(lái)決定在實(shí)時(shí)的測(cè)定結(jié)果的可接受性。當(dāng)?shù)臏y(cè)定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQAEQA用來(lái)為執(zhí)業(yè)許可或用來(lái)為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述為實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證的目的而評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述為實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（Proficiency testing, PTProficiency testing, PT）。在以前的文獻(xiàn)中，在以前的文獻(xiàn)中，EQAEQA常描述室間質(zhì)量控制常描述室間質(zhì)量控制。第2頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義批批 (Run) 在相同條件下所獲得的一在相同條件

4、下所獲得的一組測(cè)定。組測(cè)定。 均值（均值（Mean） 標(biāo)準(zhǔn)差（標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation, SD或或s )變異系數(shù)（變異系數(shù)（Coefficient of variation, CV） 第3頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 (Accuracy) (Accuracy) 待測(cè)物的測(cè)定值與其真值的一致性程度。待測(cè)物的測(cè)定值與其真值的一致性程度。準(zhǔn)確度不能準(zhǔn)確度不能直接以數(shù)值表示，通常以不準(zhǔn)確度來(lái)間接衡量。對(duì)一分析物重復(fù)多次測(cè)定，所得均值直接以數(shù)值表示，通常以不準(zhǔn)確度來(lái)間接衡量。對(duì)一分析物重復(fù)多次測(cè)定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差即為測(cè)定的不準(zhǔn)確度。與其真值或參考

5、靶值之間的差異亦即偏差即為測(cè)定的不準(zhǔn)確度。 偏差偏差 ( (Bias) Bias) 待測(cè)物的測(cè)定值與一可接受參考值之間的差異。待測(cè)物的測(cè)定值與一可接受參考值之間的差異。第4頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義 精密度精密度(Precision) 在一定條件下所獲得的獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果之間的一致性程度。與準(zhǔn)確度一樣，精密度同在一定條件下所獲得的獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果之間的一致性程度。與準(zhǔn)確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來(lái)間接表示。測(cè)定不精密度的主要來(lái)源是隨機(jī)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)差（樣也是以不精密度來(lái)間接表示。測(cè)定不精密度的主要來(lái)源是隨機(jī)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和）和/或變異系數(shù)或變異系數(shù)（CV）具體表示。）具體表示。SD或或CV

6、越大，表示重復(fù)測(cè)定的離散度越大，精密度越差，反之則越好。越大，表示重復(fù)測(cè)定的離散度越大，精密度越差，反之則越好。 第5頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義正態(tài)分布正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時(shí)間重復(fù)多次測(cè)定，當(dāng)測(cè)定數(shù)據(jù)足夠多時(shí)，如以橫軸表示測(cè)定值，縱軸表示在大量測(cè)定中相應(yīng)測(cè)定值的個(gè)數(shù)，則可得到一個(gè)兩頭低，中間高，中為所有測(cè)定值的均值，左右對(duì)稱(chēng)的“鐘形”曲線(xiàn)，亦即正態(tài)分布，又稱(chēng)高斯分布。 第6頁(yè)/共84頁(yè)定定 義義 正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來(lái)說(shuō)明。第7頁(yè)/共84頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室室常規(guī)測(cè)定步驟常規(guī)

7、測(cè)定步驟 標(biāo)本收集：標(biāo)本收集：選擇測(cè)定項(xiàng)目、標(biāo)本收集和保存。 實(shí)驗(yàn)室測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室測(cè)定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)、測(cè)定的有效性和臨床診療價(jià)值。 報(bào)告和解釋?zhuān)簣?bào)告和解釋?zhuān)航Y(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。第8頁(yè)/共84頁(yè)質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)之間的質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)之間的關(guān)系關(guān)系第9頁(yè)/共84頁(yè)臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存臨床標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存及其質(zhì)量控制及其質(zhì)量控制 標(biāo)本收集標(biāo)本收集 標(biāo)本保存標(biāo)本保存標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本運(yùn)送 第10頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本收集標(biāo)本收集標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響 標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 標(biāo)本的類(lèi)型

8、和采集量標(biāo)本的類(lèi)型和采集量 采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià) 采樣及運(yùn)輸容器采樣及運(yùn)輸容器 標(biāo)本采集中的防污染標(biāo)本采集中的防污染 第11頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響的影響在疾病發(fā)展過(guò)程中，標(biāo)本采集過(guò)早或在疾病發(fā)展過(guò)程中，標(biāo)本采集過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。過(guò)晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。 第12頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備血液標(biāo)本采集血液標(biāo)本采集分泌物標(biāo)本分泌物標(biāo)本: :采集部位的清潔消采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜毒可去掉污染的微生物或其它雜物物, ,但應(yīng)適度但應(yīng)適度, ,過(guò)度清潔消毒有可過(guò)度清潔消毒有可能會(huì)去掉或破壞

9、靶微生物能會(huì)去掉或破壞靶微生物, ,故標(biāo)故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行的人員進(jìn)行。第13頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本的類(lèi)型和采集量標(biāo)本的類(lèi)型和采集量 標(biāo)本的類(lèi)型標(biāo)本的類(lèi)型: : 血清血清( (漿漿) )、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。、分泌物、痰、糞便、尿和腦脊液等。 標(biāo)本的采集量標(biāo)本的采集量: :應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來(lái)說(shuō)，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話(huà)，則其量亦足以用應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。一般來(lái)說(shuō)，如果標(biāo)本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話(huà)，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。 對(duì)于定量測(cè)定來(lái)說(shuō)，對(duì)標(biāo)本的收集要求更為精確。對(duì)于定量

10、測(cè)定來(lái)說(shuō)，對(duì)標(biāo)本的收集要求更為精確。第14頁(yè)/共84頁(yè)采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)血清血清( (漿漿) )標(biāo)本標(biāo)本: :溶血、脂血等；溶血、脂血等；分泌物、痰：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成，所需類(lèi)型分泌物、痰：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括細(xì)胞組成，所需類(lèi)型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。 評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察評(píng)價(jià)方法：包括肉眼觀察, ,顯微鏡下觀察和化學(xué)分顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。析等。 第15頁(yè)/共84頁(yè)采樣及運(yùn)輸容器采樣及運(yùn)輸容器 標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用；使用；采樣及運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性采樣及運(yùn)輸容器應(yīng)為密閉的一次性無(wú)菌裝置；無(wú)菌裝置；采樣所用的防腐劑、

11、抗凝劑及相關(guān)采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)試劑材料不應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程造成干擾。程造成干擾。 第16頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本采集中的防污染標(biāo)本采集中的防污染 采集中要特別注意污染，防止混入操作者的采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的能存在的RNase失活失活。第17頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本保存標(biāo)本保存 靶核酸靶核酸(尤其是尤其是RNA)易受核酸酶的作用而易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)迅速降解，因此標(biāo)本的保存對(duì)于核酸擴(kuò)增測(cè)

12、定的有效性極為重要。增測(cè)定的有效性極為重要。 使用使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約在室溫下穩(wěn)定約7天。天。 第18頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本保存標(biāo)本保存臨床體液標(biāo)本長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70下。 如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)緩沖液中4 下保存。 用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述緩沖液中-80或液氮下保存。 核酸的乙醇沉淀物則可于-20下保存。 第19頁(yè)/共84頁(yè)標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本運(yùn)送 樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。樣本中如

13、加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑, ,如用于如用于RNARNA測(cè)定加測(cè)定加入入GITCGITC的血清的血清( (漿漿) )樣本和用于樣本和用于DNADNA測(cè)定的測(cè)定的EDTAEDTA抗凝抗凝血等血等, ,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。第20頁(yè)/共84頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)量控制測(cè)定前的質(zhì)量控制測(cè)定前的質(zhì)量控制核酸樣本的制備及其質(zhì)量控核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制制 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制質(zhì)量

14、控制的評(píng)價(jià)質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)第21頁(yè)/共84頁(yè)測(cè)定前質(zhì)量控制測(cè)定前質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理理理想的試劑和操作方法理想的試劑和操作方法 人員培訓(xùn)人員培訓(xùn)第22頁(yè)/共84頁(yè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備 ；實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實(shí)驗(yàn)用品要達(dá)到相應(yīng)的要求。品要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)？加樣器的校準(zhǔn)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？熱循環(huán)儀？水浴箱和熱循環(huán)儀

15、？水浴箱和/ /或恒溫干浴儀？或恒溫干浴儀？酶標(biāo)儀和洗板機(jī)？酶標(biāo)儀和洗板機(jī)？第23頁(yè)/共84頁(yè)基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控儀器設(shè)備儀器設(shè)備質(zhì)控方法質(zhì)控方法 頻頻 度度失控標(biāo)準(zhǔn)失控標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增儀儀器校驗(yàn)實(shí)驗(yàn)當(dāng)儀器移動(dòng)時(shí)實(shí)驗(yàn)失敗熱電偶監(jiān)測(cè)溫度擴(kuò)增功能檢測(cè)每月一次每 4 個(gè)月一次 如靶溫度或溫度差異超出允許范圍待測(cè)孔未出現(xiàn)擴(kuò)增，檢測(cè)溫度程序打印每次測(cè)定時(shí)打印程序不對(duì)加樣器校準(zhǔn)每年 2 次不符合要求水浴箱溫度檢測(cè)每次實(shí)驗(yàn)不符合要求酶標(biāo)儀預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)每年 2 次不符合要求第24頁(yè)/共84頁(yè)帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢檢首先制備一個(gè)含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果

16、吸頭的最大體積為100l，則將加樣器吸取體積調(diào)至110120l，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾塞之上，否則說(shuō)明濾塞不嚴(yán)。 第25頁(yè)/共84頁(yè)帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢檢 用實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)帶濾塞吸頭的質(zhì)量：先純化制備數(shù)份強(qiáng)陽(yáng)性和數(shù)份陰性核酸標(biāo)本，然后將加樣器吸取量設(shè)至擴(kuò)增加樣所需的體積，使用待評(píng)價(jià)帶濾塞吸頭對(duì)一份強(qiáng)陽(yáng)性樣本來(lái)回吸取10次（模擬10份陽(yáng)性樣本的吸取），將最后一次的吸取液加至一含擴(kuò)增反應(yīng)液的管中，之后，換一個(gè)新吸頭，連續(xù)吸取10份陰性樣本分別至10個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)管中，此過(guò)程重復(fù)35次，最后對(duì)每一管按所用試劑方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。強(qiáng)陽(yáng)性樣本應(yīng)為

17、強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性弱或出現(xiàn)陰性則說(shuō)明吸頭可能含有擴(kuò)增抑制物。所有陰性樣本應(yīng)為陰性，出現(xiàn)陽(yáng)性則表明吸頭不能有效地防止氣溶膠對(duì)加樣器的污染。 第26頁(yè)/共84頁(yè)核酸提取用離心管質(zhì)檢核酸提取用離心管質(zhì)檢離心管離心管PCRPCR抑制物質(zhì)檢抑制物質(zhì)檢其他其他第27頁(yè)/共84頁(yè)擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測(cè)方法檢測(cè)方法 一是使用一種熱電偶探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動(dòng)圖示記錄儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫度變異超出1時(shí)，其可測(cè)出來(lái)。 具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管放置于擴(kuò)增儀各孔中，熱電偶探針透過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個(gè)常規(guī)

18、的PCR擴(kuò)增，加熱模塊如為96孔，則至少要測(cè)定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中，可移動(dòng)熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測(cè)溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測(cè)至少要有一個(gè)擴(kuò)增周期。 第28頁(yè)/共84頁(yè)擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測(cè)方法檢測(cè)方法 第二種方法并非直接測(cè)定孔內(nèi)溫度，而是通過(guò)擴(kuò)增功能來(lái)間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽(yáng)性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個(gè)或幾個(gè)孔結(jié)果有問(wèn)題，則應(yīng)確定這一個(gè)或幾個(gè)孔是否會(huì)重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞。 第29頁(yè)/共84頁(yè)理想的

19、試劑和操作方法理想的試劑和操作方法 試劑盒的質(zhì)檢定量測(cè)定的精密度是測(cè)定組成步驟的變異和的平方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)等）的標(biāo)準(zhǔn)差； SDSDSDabc222.第30頁(yè)/共84頁(yè)理想的試劑和操作方法理想的試劑和操作方法改善測(cè)定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對(duì)試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、測(cè)定方法和儀器操作寫(xiě)出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”(SOP) 第31頁(yè)/共84頁(yè)人員培訓(xùn)人員培訓(xùn) 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的操作主要是標(biāo)本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡(jiǎn)單，但由于均為微量操作，要

20、獲得穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果，操作人員需要一定的專(zhuān)業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn).知其然知其然又知其所以然又知其所以然。 第32頁(yè)/共84頁(yè)核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測(cè)及其質(zhì)量控制及其質(zhì)量控制 一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理 核酸的分離純化 靶核酸提取的質(zhì)量 臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) 核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測(cè)的質(zhì)控 產(chǎn)物檢測(cè)的質(zhì)控 第33頁(yè)/共84頁(yè)一般核酸提取試劑促使靶核酸一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)或真菌細(xì)胞內(nèi)

21、，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。第34頁(yè)/共84頁(yè)核酸的分離純化核酸的分離純化 核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類(lèi)等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。 第35頁(yè)/共84頁(yè)臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì)臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) 臨床標(biāo)本中：臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸

22、酶等。核酸提取中：核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑 。 第36頁(yè)/共84頁(yè)對(duì)臨床標(biāo)本中可能存在的對(duì)臨床標(biāo)本中可能存在的抑制抑制/ /干擾物的質(zhì)控措施干擾物的質(zhì)控措施質(zhì)控措施：質(zhì)控措施： 采用內(nèi)質(zhì)控（采用內(nèi)質(zhì)控（internal internal control, ICcontrol, IC）（通常稱(chēng)為內(nèi)標(biāo)）的方法）（通常稱(chēng)為內(nèi)標(biāo)）的方法 內(nèi)標(biāo)有兩種內(nèi)標(biāo)有兩種, ,即競(jìng)爭(zhēng)性的和非競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)即競(jìng)爭(zhēng)性的和非競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)標(biāo)。標(biāo)。 第37頁(yè)/共84頁(yè)核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控核酸提取及擴(kuò)

23、增有效性的質(zhì)控 已知弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：已知弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，其最后的檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的有效性的綜合反映。 已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本相同）：至少帶1份，擴(kuò)增測(cè)定的結(jié)果可以判斷核酸提取過(guò)程中是否發(fā)生污染。 第38頁(yè)/共84頁(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制 理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序 統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn) 統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法第39頁(yè)/共84頁(yè)理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件件 基質(zhì)與待測(cè)樣本一致； 所含待測(cè)物濃度接近試驗(yàn)的決定性水平； 穩(wěn)定； 靶值或

24、預(yù)期結(jié)果已定； 無(wú)已知的生物傳染危險(xiǎn)性； 單批可大量獲得； 價(jià)廉第40頁(yè)/共84頁(yè)測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量測(cè)定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序及排列順序 每次檢測(cè)究竟使用幾個(gè)質(zhì)控樣本并排在臨床標(biāo)本中的哪個(gè)位置最為適宜？從理論上說(shuō)，為最大可能地檢出實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)和系統(tǒng)誤差，應(yīng)每隔幾份臨床標(biāo)本插入1份質(zhì)控樣本，但考慮國(guó)內(nèi)目前的實(shí)際情況及成本效益，一般來(lái)說(shuō)，如果臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的標(biāo)本量不是特別大，定性測(cè)定有一份接近c(diǎn)ut-off的弱陽(yáng)性和一份陰性質(zhì)控樣本應(yīng)可以滿(mǎn)足要求。而定量測(cè)定則要根據(jù)試驗(yàn)的測(cè)定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。至于在測(cè)定中的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。

25、第41頁(yè)/共84頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控的獨(dú)特性獨(dú)特性即監(jiān)測(cè)污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設(shè)置。 應(yīng)該包括1份陰性原血清樣本、1份在標(biāo)本核酸提取過(guò)程中帶入的一個(gè)空管和僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管。 第42頁(yè)/共84頁(yè)陰性原血清質(zhì)控樣本的功陰性原血清質(zhì)控樣本的功能能 監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染； 由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染；擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。 第43頁(yè)/共84頁(yè)在標(biāo)本核酸提取過(guò)程中帶入的一個(gè)空管在標(biāo)本核酸提取過(guò)程中帶入的一個(gè)空管的功能的功能基本功能與陰性原血清質(zhì)控樣本相同，但不同的是，其基質(zhì)為水，不含陰性原血清質(zhì)控樣本中可能有的擴(kuò)增抑制物，因而對(duì)污染的反映更為靈敏不能取代

26、原血清陰性樣本。第44頁(yè)/共84頁(yè)僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管的功能的功能 監(jiān)測(cè)擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強(qiáng)的污染鑒別性。 如想鑒別實(shí)驗(yàn)室是否發(fā)生污染，可將一個(gè)或多個(gè)空管打開(kāi)靜置于標(biāo)本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時(shí)以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽(yáng)性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。 第45頁(yè)/共84頁(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的特點(diǎn) 檢驗(yàn)誤差有兩類(lèi)，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機(jī)誤差。 系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測(cè)定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設(shè)備、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物出現(xiàn)問(wèn)題而造成的，這種誤差可以通過(guò)前述的措施方法加以控制，是可以

27、排除的。 隨機(jī)誤差則表現(xiàn)為測(cè)定SD的增大，主要是由實(shí)驗(yàn)操作人員的操作等隨機(jī)因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。第46頁(yè)/共84頁(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。開(kāi)展統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制前，應(yīng)將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗(yàn)工作質(zhì)量的先決條件。 第47頁(yè)/共84頁(yè)統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法 基線(xiàn)測(cè)定 質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法 “即刻法”質(zhì)

28、控方法 第48頁(yè)/共84頁(yè)基線(xiàn)測(cè)定基線(xiàn)測(cè)定 最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； 當(dāng)RCV與OCV接近，或小于2 OCV時(shí)，則RCV是可以接受的。以上為批間變異。 批內(nèi)變異的測(cè)定； 室內(nèi)質(zhì)控物的測(cè)定準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)。 第49頁(yè)/共84頁(yè)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)IQCIQC統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)計(jì)算問(wèn)題計(jì)算問(wèn)題可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的拷貝數(shù)/ml或IU/ml來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，也可用其對(duì)數(shù)值進(jìn)行。由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對(duì)數(shù)值來(lái)進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計(jì)分析可能要更為方便

29、一些。 第50頁(yè)/共84頁(yè)質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義義 質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 質(zhì)控規(guī)則的功能 常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義 第51頁(yè)/共84頁(yè)質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 通常質(zhì)控規(guī)則以符號(hào)AL來(lái)表示，其中A為質(zhì)控測(cè)定中超出質(zhì)量控制限的測(cè)定值的個(gè)數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來(lái)表示。 當(dāng)質(zhì)控測(cè)定值超出控制限L時(shí)，即可將該批測(cè)定判為失控。 常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測(cè)定值中，如果有一個(gè)測(cè)定值超出均值3s范圍，即可將該批測(cè)定判為失控。 第52頁(yè)/共84頁(yè)質(zhì)控規(guī)則的功能質(zhì)控規(guī)則的功能 簡(jiǎn)單地說(shuō)就是用

30、于判斷測(cè)定批的失控還是在控 。第53頁(yè)/共84頁(yè)常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義 符符 號(hào)號(hào) 定定 義義 12S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出2s控制限。 13S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出3s控制限。 22S 兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或2s控制限。 R4S 同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的 差值超出4s控制限。 41S 四個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或1s控制限。 7T 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變 化。 10X 十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。第54頁(yè)/共84頁(yè)Levey-Jennings質(zhì)控圖方法質(zhì)控圖方法 也稱(chēng)Shewhart質(zhì)

31、控圖，是由美國(guó)的Shewhart 于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。第55頁(yè)/共84頁(yè)Levey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控圖第56頁(yè)/共84頁(yè)第57頁(yè)/共84頁(yè)Levey-JenningsLevey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義 穩(wěn)定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過(guò)2SD（95.5%可信限）限度；在1000個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過(guò)3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。

32、 如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 第58頁(yè)/共84頁(yè)質(zhì)控圖的記錄質(zhì)控圖的記錄質(zhì)控結(jié)果日期試劑質(zhì)控物批號(hào)和含量測(cè)定者姓名等。 第59頁(yè)/共84頁(yè)Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的特點(diǎn)質(zhì)控圖方法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單明了 缺點(diǎn)： 以2s為失控限，假失控的概率太高，通常不能接受。 以3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強(qiáng)。 第60頁(yè)/共84頁(yè)Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法多規(guī)則質(zhì)控方法 Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法即是將前述的多個(gè)質(zhì)控規(guī)則同時(shí)應(yīng)用進(jìn)行質(zhì)控判斷的方法。 最初常用的有六個(gè)質(zhì)控規(guī)則，即12S、13S、22S、R4S、

33、41S和10X，其中12S規(guī)則作為告警規(guī)則。 13S和R4S規(guī)則反映的是隨機(jī)誤差。22S、41S和10X反映的是系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)誤差超出一定的程度，也可從13S和R4S規(guī)則反映出來(lái)。 第61頁(yè)/共84頁(yè)Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法的特點(diǎn)多規(guī)則質(zhì)控方法的特點(diǎn)在Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，具有Levey-Jennings 質(zhì)控圖方法的優(yōu)點(diǎn)，可通過(guò)相似的質(zhì)控圖來(lái)進(jìn)行分析。 假失控和假告警概率低。 誤差檢出能力增強(qiáng) 。第62頁(yè)/共84頁(yè)累積和累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法質(zhì)控方法累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法于1977年由Westgard等提出,對(duì)系統(tǒng)誤差有較好的測(cè)出能力。

34、 第63頁(yè)/共84頁(yè)常用的累積和常用的累積和 (CUSUM) 質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則 質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則 起動(dòng)累積和計(jì)算的閾值（起動(dòng)累積和計(jì)算的閾值（k） 質(zhì)控限（質(zhì)控限（h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.5s 5.1sCSss0 . 17 . 2CSss0 . 10 . 3CSss5 . 01 . 5第64頁(yè)/共84頁(yè)累積和累積和 (CUSUM) 質(zhì)控圖質(zhì)控圖第65頁(yè)/共84頁(yè)“即刻即刻”質(zhì)控方法質(zhì)控方法 “即刻法” 的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,即Grubs異常值取舍法 只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。 第66頁(yè)/共84頁(yè)室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的評(píng)價(jià)室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)的評(píng)價(jià) IQC為一集

35、體活動(dòng)，除實(shí)際測(cè)定者外，還應(yīng)有另外一人對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。 不能將IQC作為一個(gè)監(jiān)察方法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測(cè)定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)以建設(shè)性的而非批評(píng)的方式去探查失控的原因。 除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控外，還應(yīng)定期評(píng)價(jià)累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測(cè)在測(cè)定操作中的長(zhǎng)期變化趨勢(shì)。 評(píng)價(jià)應(yīng)定期進(jìn)行。第67頁(yè)/共84頁(yè)弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本常見(jiàn)的失控原因弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本常見(jiàn)的失控原因 核酸提取中的隨機(jī)誤差。核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。 儀器的問(wèn)題。儀器的問(wèn)題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 試劑的問(wèn)題。試劑的問(wèn)題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失

36、活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。 第68頁(yè)/共84頁(yè)陰性質(zhì)控樣本的失控原因陰性質(zhì)控樣本的失控原因 主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染污染”和和/ /或臨床標(biāo)或臨床標(biāo)本的核酸提取過(guò)程中發(fā)生的標(biāo)本間的交本的核酸提取過(guò)程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉叉 “污染污染”. . 第69頁(yè)/共84頁(yè)IQCIQC的局限性的局限性 在免疫測(cè)定中在免疫測(cè)定中IQCIQC可能測(cè)不出的誤差可能測(cè)不出的誤差 測(cè)定前測(cè)定前 測(cè)定中測(cè)定中 測(cè)定后測(cè)定后 樣本鑒定不對(duì)樣本鑒定不對(duì) 樣本吸取不對(duì)樣本吸取不對(duì) 結(jié)果記錄錯(cuò)誤結(jié)果記錄錯(cuò)誤 樣本貯存中變質(zhì)樣本貯存中變質(zhì) 試劑加入不對(duì)試劑加入不對(duì) 此類(lèi)誤差的發(fā)生率在不同的實(shí)驗(yàn)

37、室有所不同，一般要求小此類(lèi)誤差的發(fā)生率在不同的實(shí)驗(yàn)室有所不同，一般要求小于于 0.1%0.1%，且應(yīng)均衡地分布于測(cè)定前、測(cè)定中和測(cè)定后的不同階，且應(yīng)均衡地分布于測(cè)定前、測(cè)定中和測(cè)定后的不同階段。段。 第70頁(yè)/共84頁(yè)影響臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果的影響臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果的最關(guān)鍵因素最關(guān)鍵因素產(chǎn)物“污染”（Carry-over)測(cè)定人員的操作：標(biāo)本混淆；貼錯(cuò)標(biāo)簽、核酸提取等試劑第71頁(yè)/共84頁(yè)避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的措避免基因擴(kuò)增檢驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的措施施 嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室分區(qū)； 使用帶“濾心”的吸頭； 設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）； 使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑； 臨床“假陽(yáng)性”問(wèn)題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物