基因診斷-病原學(xué)

1、基因診斷 病原學(xué)中的原理及應(yīng)用 by PBL 31、簡(jiǎn)介2、原理3、特點(diǎn)4、應(yīng)用5、發(fā)展6、局限局限 基因診斷基因診斷 利用分子生物學(xué)技術(shù)，利用分子生物學(xué)技術(shù)， -從從DNA/RNA水平水平檢測(cè)基因的存在檢測(cè)基因的存在 -分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài) -對(duì)疾病作出診斷對(duì)疾病作出診斷核酸分子雜交PCR擴(kuò)增DNA序列測(cè)定DNA芯片技術(shù)病原體（病原體（pathogens）能引起疾病的微生物和寄生蟲(chóng)的統(tǒng)稱(chēng)。微生物占絕大多數(shù)，包括病毒、衣原體、立克次體、支原體、細(xì)菌、螺旋體和真菌；寄生蟲(chóng)主要有原蟲(chóng)和嚅蟲(chóng)。什么是病原體基因診斷？病原體的基因診斷：針對(duì)病原體自身特異性核酸（DNA

2、或RNA）序列，通過(guò)分子雜交和基因擴(kuò)增等手段，鑒定和發(fā)現(xiàn)這些外源性基因組、基因或基因片段在人體組織中的存在，從而證實(shí)病原體的感染。2、原理-分子生物學(xué)技術(shù)： 分子雜交：檢測(cè)特定序列 PCR：擴(kuò)增外源性DNA DNA測(cè)序-病原體檢測(cè)方法 用已知核酸探針確定單鏈核酸堿基序列的技術(shù)。 Southern 印記雜交 Northern 印記雜交 斑點(diǎn)雜交 原位雜交分子雜交（分子雜交（molecular molecular hybridizationhybridization）probeprobe在有核糖體的病原體中：rRNA數(shù)量DNA故直接測(cè)定核糖體RNAPCR擴(kuò)增1.不同種的微生物的DNA分子有可變區(qū)（

3、綠色）和保守區(qū)（紅色）這是一段病原體DNA的示意圖2. 不同菌種間高度可變區(qū)是鑒別證據(jù)可變區(qū)兩端具有保守序列3.根據(jù)此保守序列，設(shè)計(jì)廣譜PCR引物擴(kuò)增的片段，對(duì)高變區(qū)擴(kuò)增primer1primer24. 引物擴(kuò)增的片段經(jīng)測(cè)序，并與基因庫(kù)中序列比較就可得出待測(cè)細(xì)菌的菌種一些病原體檢測(cè)方法一些病原體檢測(cè)方法(一)直接顯微鏡檢查 (二)病原體分離、培養(yǎng)和鑒定 局限：適用于無(wú)菌，靈敏度低，分辨率低，耗時(shí)局限：適用于易培養(yǎng)的微生物，耗時(shí)(三)病原體抗原檢測(cè)抗原抗體抗原抗體S局限：昂貴，存在正常菌時(shí)的交叉反應(yīng)需對(duì)照(四)病原體抗體檢測(cè)抗原抗體抗原抗體S局限：敏感性（陰性值）特異性（陽(yáng)性值）難定主要技術(shù)為P

4、CR -高度特異性 -高度敏感性 -快速檢測(cè)已知DNA序列的 病原微生物發(fā)展而來(lái)DNA芯片技術(shù)用于微生物的偵查檢測(cè)，對(duì)病原體分類(lèi)和分型。3、特點(diǎn)分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)，操作繁雜，制約因素多 eg: 結(jié)核分枝桿菌 (1)培養(yǎng)：12個(gè)月 有合適引物，PCR檢測(cè)、測(cè)序：= 同種細(xì)菌：= 【J clin Miicrobiol，2003.41（9】2-對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP） 建立了14種臨床常見(jiàn)病原菌菌株特有的酶切圖譜 中華實(shí)用診斷與治療雜志，2009,23(12)3-對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳分析，直 接觀察其多樣性 Goldenberg等人還在此基

5、礎(chǔ)上建立了DHPLC技術(shù) 【JDis，2008，9（4）：19018; Microbiology，1996，142（Pt1）：31】5、發(fā)展封閉式、自動(dòng)化、定量化又分為蛋白芯片、基因芯片及其他類(lèi)蛋白芯片、基因芯片及其他類(lèi)高通量高通量微型化微型化自動(dòng)化自動(dòng)化用于微生物的偵查檢測(cè)，分類(lèi)和分型用于微生物的偵查檢測(cè)，分類(lèi)和分型生物芯片生物芯片O O O O O O O O O O O O O O O Ochip carries lots of identical probessampleHybrideach probeO O O O O O O O O O O O O O O OO O O O O O

6、 O O O O O O O O O OHIV基因芯片檢測(cè)基因芯片檢測(cè)傳統(tǒng)方法：免疫法-血清HIV抗體初篩、Western印跡法確證-可能存在的非特異性假陽(yáng)性反應(yīng)，常需進(jìn)行2次、甚至3次血清學(xué)測(cè)定 原因：病毒多亞型，抗體結(jié)合有交叉免疫-對(duì)某些病原體而言, 基因診斷的特異性問(wèn)題尚未完全解決;-細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度測(cè)試問(wèn)題目前還不能完全用基因診斷法來(lái)解決;-某種病原體的毒性, 如病毒的細(xì)胞毒性測(cè)定也不能用基因診斷法完成;-病原體的形態(tài)學(xué)研究更是不能為基因診斷取代-不能得知病原體進(jìn)入體內(nèi)后機(jī)體的反應(yīng)6 6、局限局限小組成員及分工小組成員及分工（根據(jù)拼音首字母順序）（根據(jù)拼音首字母順序） 閱讀文獻(xiàn)、提出問(wèn)題、制定學(xué)習(xí)計(jì)劃： 彭文貝、張俊 查閱資料、解決問(wèn)題： 蘭佳佳、汪珉杰、張寒珂 制作展示幻燈： 樂(lè)可浩、朱佳異 演講展示學(xué)習(xí)成果： 唐露主要參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)： 【1】臨床病原微生物快速診斷技術(shù)進(jìn)展 呂游1綜述王輝2 姜可偉1，王杉”、審校 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2013年4月第34卷第7期 【2】16SrRNA基因及16S23SrRNA基因間區(qū)在微生物鑒定中的應(yīng)用 王艷萍綜述夏云審校 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2013年4月第34卷第8期 【3】基因診斷方法的研究與進(jìn)展 常 虹Journal of Clinical R