非可控性結(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化及其分子機制研究

1、非可控性結(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化及其分子機制研究 分類號? 密級?博士學位論文非可控性結(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化及其分子機制研究作者姓名 唐岸柳學科專業(yè) 內(nèi)科學學院系、所 中南大學湘雅三醫(yī)院指導老師 沈守榮教授答辯委員會主席論文答辯日期立:中南大學二。一二年五月原創(chuàng)性聲明本人聲明,所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了論文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得中南大學或其他單位的學位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者簽名:日期:絲年月日

2、堡緝學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定,即:學校有權(quán)保留學位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學位論文,允許學位論文被查閱和借閱;學校可以公布學位論文的全部或部分內(nèi)容,可以采用復印、縮印或其它手段保存學位論文。同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫,并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。作者簽名:阜輯導師簽名譴速日期:坐年魚月日駐:。謦本課題受如下基金資助國家自然科學基金項目:湖南省研究生科研創(chuàng)新項目:“工程”創(chuàng)新人才培育基金:博士學位論文中立摘要摘要【研究背景】非可控性炎癥在腫瘤的啟動、促進與進展中發(fā)揮重要作用。結(jié)直腸癌是世界第

3、三大癌,嚴重威脅人類健康。非可控性的結(jié)腸炎癥,如潰瘍性結(jié)腸炎,可顯著增加罹患結(jié)直腸癌的風險,且結(jié)直腸癌的發(fā)生與炎癥的嚴重程度、范圍等因素呈正相關(guān)。結(jié)腸炎相關(guān)性癌與傳統(tǒng)意義上的結(jié)直腸癌相似,為一涉及多基因、多步驟、多階段的復雜過程。而與經(jīng)典結(jié)直腸癌的“腺瘤.腺癌”序列不同,潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展至結(jié)直腸癌經(jīng)歷了“炎癥.不典型增生.癌癥”的序列演進。目前對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)病機制的研究才剛剛起步,尚缺乏針對連續(xù)病變階段的動態(tài)組學研究,對其分子機制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認知電不全面。為從全基因組轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達水平兩個層面全面、深入地探討“炎.癌鏈”中的分子事件及其交互作用網(wǎng)絡(luò),本研究在構(gòu)建化學誘導的

4、非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型基礎(chǔ)上,采用全基因組表達譜基因芯片技術(shù)結(jié)合生物信息學分析、炎癥因子抗體芯片蛋白芯片技術(shù)、實時定量以及免疫組織化學法,對“炎癥一不典型增生一癌癥”序列演進過程的轉(zhuǎn)錄組及“炎.癌”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號通路與分子的動態(tài)變化規(guī)律進行分析歸納,旨在為非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和臨床診治提供理論依據(jù)。;可控性結(jié)腸炎及結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的構(gòu)建】通過單次小刺量地腹腔注射誘變劑氧化偶氮甲烷,周后予以循環(huán)飲用致炎劑葡聚糖硫酸鈉,我們成功構(gòu)建非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)博士學位論文 中文摘要性癌小鼠模型。該模型具有與人類潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性癌相似的特征

5、:臨床表現(xiàn)上均有腹瀉、大便隱血、粘液膿血便、體重不增或下降。病理學觀察,給予葡聚糖硫酸鈉后小鼠結(jié)直腸出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),大量炎性細胞浸潤,糜爛與淺潰瘍從大腸遠端向近端發(fā)展:隨著葡聚糖硫酸鈉的循環(huán)飲用,形成非可控性的慢性腸道炎癥,疾病進展呈現(xiàn)典型的“炎癥一不典型增生.腺癌”的序列演進過程;不典型增生以扁平型為主,不典型增生與癌呈多灶性,且發(fā)生于炎癥較重的部位。小鼠模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎及結(jié)腸炎相關(guān)性癌有相似的表達譜特征。以上發(fā)現(xiàn)證實該模型可較好地模擬人類潰瘍性結(jié)腸炎與炎癥相關(guān)性癌,有科學應(yīng)用價值,可為后續(xù)試驗提供保障?！痉强煽匦越Y(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化規(guī)律】轉(zhuǎn)錄水平的變化是基因組遺傳信息的

6、集中體現(xiàn),為了全而地揭示潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌病變各階段轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化規(guī)律,本研究選取“正常一炎癥一不典型增生一腺癌”各病理階段的小鼠腸道黏膜進行全基因組表達譜芯片分析。研究發(fā)現(xiàn),各病理階段的基因表達呈現(xiàn)一定的規(guī)律性,尤以早期炎癥期的分子變化最為顯著,分別有與個基因探針在炎癥組織中較正常組織發(fā)生了上調(diào)與調(diào),形成一陣“轉(zhuǎn)錄風暴”。多種聚類分析顯示炎癥期的樣本嚴格聚為一類,在主成分中占有絕對地位。對基因注釋本體的富集度網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),該時期變化最顯著的為炎癥相關(guān)基因集,包括直接參與炎癥反應(yīng)的細胞因予、趨化炎癥細胞的趨化因子、誘導白細胞粘附的粘附分子、參與組織修復的血管生成因子與基質(zhì)重建因子、誘

7、導壞死細胞凋及促進腸上皮細胞存活與增殖的因子等等,而這些基因集在不典型增生及癌癥期表達趨于緩和,表明機體在早期處于積極地防御狀態(tài),而至后期,機體逐漸對炎癥與腫瘤細胞產(chǎn)生耐受,轉(zhuǎn)錄水平改變中立摘要趨緩:也提示腫瘤微環(huán)境對免疫細胞的改造作用。這種早期的劇變可能已經(jīng)決定了細胞的命運與疾病的走向。在癌癥期,仍有部分炎癥因子的活躍,主要是促進細胞增殖、抑制凋亡、促進血管新生與基質(zhì)降解的基因表達上調(diào),充分體現(xiàn)出結(jié)直腸癌的惡性行為特征?！拘盘柾返碾A段性活化是連接“炎.癌”的紐帶】經(jīng)基因表達譜芯片的生物信息學分析及免疫組化驗證,本研究發(fā)現(xiàn)?、 及/.等信號轉(zhuǎn)導通路在進程中存在階段性活化。其中?.經(jīng)典途徑與兩

8、條信號通路在“炎癥.不典型增生.癌”的序列演進中呈現(xiàn)持續(xù)性活化,、磷酸化及其靶基因編碼蛋白、一的表達均呈逐級升高的趨勢;?旁路途徑僅在炎癥細胞中活化,且在炎癥期最為活躍,而不典型增生期至癌癥期表達信號的活化發(fā)生于炎癥期及不典型增生期:在逐漸下調(diào):腫瘤形成階段 失活,而/一通路開始處于明顯活化狀態(tài)。這些結(jié)果表明,?.經(jīng)典途徑與旁路途徑、及可能對炎癥的啟動和維持具有重要作用,參與炎癥細胞的趨化、促炎因子的釋放;而.經(jīng)典途徑、及誘導的持續(xù)性炎癥反應(yīng)又對腸上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化產(chǎn)生積極作用,微環(huán)境當中的細胞中上述信號的激活導致細胞因子的持續(xù)產(chǎn)生,繼續(xù)作用于轉(zhuǎn)化細胞,促進其存活與生長;隨著/.通路的激活被認

9、為是抑瘤基因,促瘤與抑瘤與 的失活的平衡終于被打破,在.經(jīng)典途徑與信號所營造的炎性背景下,腫瘤穩(wěn)定形成與進展?！痉强煽匦越Y(jié)腸炎癌變過程動態(tài)交互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點】中立摘要博士學位論文結(jié)合表達譜芯片數(shù)據(jù)分析及血清炎癥因子芯片的檢測結(jié)果,我們找到非可控性結(jié)腸炎癌變過程各病變階段的交互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點。炎癥期,.、.、.及位于上調(diào)的分子網(wǎng)絡(luò)中心,家族成員、緊密連接蛋白與肝細胞核因子位于下調(diào)的分子網(wǎng)絡(luò)中心:不典型增生期,上調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點為和.,下調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點為家族和家族成員:癌癥期,上調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點包括.、一、等,下調(diào)分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點則由家族與家族成員組成。這些關(guān)鍵分子與眾多的差

10、異分子發(fā)生交互作用,并與.、 及/一等信號通路緊密相聯(lián),形成特色的階段性的動態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),推動非可控性炎癥介導的惡性轉(zhuǎn)化。綜上所述,利用小鼠模型研究“非可控性結(jié)腸炎一不典型增生結(jié)直腸癌”序列演進過程中不同病理階段轉(zhuǎn)錄組變化規(guī)律,并在蛋白水平進行初步驗證,為我們迸一步探索相關(guān)分子機制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有價值的理論和實驗依據(jù)。本研究通過高通量的全基因組表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)了基因組的動態(tài)轉(zhuǎn)錄規(guī)律,在炎癥早期形成的轉(zhuǎn)錄風暴似乎決定了疾病的走向,通過生物信息學分析和免疫組化驗證,首次報及/.等關(guān)鍵信號通路的道了.、階段性活化規(guī)律;而對血清炎癥因子芯片的篩查則對上述結(jié)論提供了更有力的支撐。這說明在炎一癌演進的

11、多階段過程中,關(guān)鍵信號通路及其下游靶基因的階段性活化發(fā)揮主要推動作用。盡管小鼠與人類的同源性很高,對研究結(jié)論的推廣尚需進行大量臨床樣本的驗證。將人類疾病樣本數(shù)據(jù)與動物模型數(shù)據(jù)進行整合,有望為臨床上對潰瘍性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的早期診治提供新的思路;并提示醫(yī)務(wù)工作博士學位論空 中文摘要者應(yīng)高度重視對慢性炎癥的預防與治療,阻止炎癥的惡性轉(zhuǎn)化。關(guān)鍵詞非可控性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌,氧化偶氨甲烷/葡聚糖硫酸鈉,動態(tài)轉(zhuǎn)錄組,信號通路,交互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點博士學位論立英文摘要, 卜 ?, , ,? ,? ,?.?“?” “?” , ”? ” , ,?,? ”?”, ?, 英文摘耍博士學位論文? ,:,:

12、, , ; :, , ,; , ”? ,”,; /.【.,”?” ,博士學位論文 英文摘要”. , , “ , ., , , , . :?.,“? ?,?“?.” ,一?一英文摘要 , ,/一? .一曲, 邵一 ,?, 一: 【? ,?.,一,一,一, ,一 ,博士學位論空 英立摘要,一, , /? , ?,“ ? , , .?, , /一, , 英文摘要博士學位論文,.? 】: ./ ,. .博士學位論文 目錄目錄中文摘要英文摘要?主要縮略詞簡表第一章前言?技術(shù)路線第二章材料與方法材料方法第三章結(jié)果第一節(jié)非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的構(gòu)建小鼠的一般狀態(tài)、體重及疾病活動指數(shù)評分組織

13、病理學特征?第二節(jié)非可控性結(jié)腸炎癌變過程的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化規(guī)律差異基因篩選芯片數(shù)據(jù)的聚類分析基因注釋本體的富集度分析 第三節(jié)”炎一鼎鏈”動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵節(jié)點的剖析 各期差異表達分子交互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建信號通路分析.表達譜芯片結(jié)果的驗證?.非可控性結(jié)腸炎癌變過程中血清炎癥因子動態(tài)表達規(guī)律分析與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的對比研究 .第四章討論一 第五章結(jié)論參考文獻綜述?一 致謝攻讀學位期間主要成果 】博士學位論文 ?？s略側(cè)簡表主要縮略詞簡表縮略詞 英文全稱? ? ? 簍篡裟茹答霉鬻器詈黧。九障士學位論文 一要縮略詞簡表?一 ?/博士學位論文前言第一章前言炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),是

14、一個受到精細調(diào)控的程序化過程,完成異物清除及組織修復后炎癥將適時終結(jié)。一旦刺激因素持續(xù)存在或者任意調(diào)控環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常.將導致炎癥狀態(tài)的持續(xù),即“非可控性炎癥”。盡管非可控性炎癥可能并不是動脈粥樣硬化、代謝綜合征、炎癥性腸病、類風濕關(guān)節(jié)炎甚至腫瘤等慢性疾病的根本原因,卻很大程度上參與到這些。疾病的病因機制當中,嚴重影響人類健康自年德國病理學家】首次提出“腫瘤來源于慢性炎癥組織“,至年雜志上”%調(diào)“腫瘤相關(guān)性炎癥為腫瘤的第七大特征“,炎癥與癌癥的關(guān)系已成為腫稽研究領(lǐng)域的熱點。世界上約%的腫瘤與非可控性炎癥性疾病相關(guān)”】,幽門螺桿菌感染可致胃痛、慢性乙型肝炎病毒感染可致肝癌、長期吸入石棉導致的慢性炎癥

15、與問皮瘤相關(guān)、炎癥性腸病大大增加結(jié)直腸癌的發(fā)稿風險【】,而非甾體類抗炎藥的應(yīng)用可降低炎癥相關(guān)性癌的發(fā)病率”。流行病學與臨床研究數(shù)據(jù)充分顯示,炎癥與腫瘤的關(guān)系密切,炎癥微環(huán)境在腫瘤的啟動、促進與進展的全過程巾發(fā)揮熏要作用。,是消化道常見的惡性腫籀,其發(fā)病率高結(jié)直腸癌居世界第三位,每年約有百萬人發(fā)生【,在發(fā)展巾國家其發(fā)病率也呈逐年%,高于全球平均遞增速度。經(jīng)典的腸道上升趨勢。我國發(fā)病率年增加非可控性炎癥性疾病?潰瘍性結(jié)腸炎 .可顯著增加的患病風險。在西方國家常見.尤在英美及北歐的發(fā)病率較高,近年來我國的發(fā)病率有增高的趨勢。最新資料顯示,大約%的患者可能最后發(fā)生,且是患者的主要死因之一。大樣結(jié)直腸癌

16、,較一般人群高倍【%一%,年以上為本分析統(tǒng)計了璃變的累積發(fā)病率:年以上為%一%,年以上為 /儼%”,且與炎癥的嚴重程度、范圍等因素呈正相關(guān)【,高度提示炎癥在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用。目前為止,盡管已對結(jié)直腸癌進行了大量研究,普遍認為其發(fā)病是一個涉及多基因、多步驟、多階段的復雜過程,但其具體的發(fā)病機制仍不清楚,尤其是對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病機制研究,還處于起步階段。發(fā)展至經(jīng)歷了“炎癥一不典型增生.痛癥”的序列演進?,與傳統(tǒng)意義上經(jīng)歷的“腺瘤。腺癌”序列不同,推斷其分了機制也不盡相同。確實,研究發(fā)現(xiàn)、等基因的突變時序在兩者間存在差異,這些差異可能源于腫墻微環(huán)境當前言博士學位論文

17、中的炎癥刺激。但是,在“炎癥一不典型增生.痛癥”的序列演進過程中發(fā)生了怎樣的分子事件這些分子事件之間又有怎樣的聯(lián)系哪些事件是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍是亟待解決的問題。因患者發(fā)生不典型增生及癌變的病程長、患者生存環(huán)境巾的影響因素不可控,而細胞實驗又不能很好地模擬炎癥/腫瘤微環(huán)境,建立有效的“非可控性結(jié)腸炎一結(jié)直腸癌”動物模型勢在必行。本研究成功構(gòu)建了氧化偶氨甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導的非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的小鼠模型.建立了動物模型標本庫:井在此模型基礎(chǔ)上,利用全基因組表達譜基因芯片技術(shù)結(jié)臺生物信息學分析、炎癥因子抗體芯片蛋白芯片技術(shù)、實時定量以及免疫組織化學法,分別在全基因組轉(zhuǎn)錄層面與蛋向

18、表達水平分別對“非可控性結(jié)腸炎.不典型增生.結(jié)直腸癌”的序列演進過程進行了動態(tài)研究,全面、深入地探討“炎一癌鏈一中的分子事件及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò).為非可控性結(jié)腸炎及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病機制和臨床診治提供理論依據(jù)。博士學位論文技術(shù)路線技術(shù)路線/處理建立小鼠盟 對照組小融:生理鹽水/蒸餾水模型 規(guī)察記錄兩組小鼠體重、精神狀態(tài)、糞便性狀、脫肛等癥狀體征變化情況.進行評分不周時間點、及周末隨機處死實驗組小鼠只.對照組小鼠只處死前眼球取血取結(jié)直腸標;串,%多聚甲醛周定后進行病理切片一染色觀察黏膜癇變情況取小同病理階段結(jié)直腸黏膜包括正常黏膜、炎癥、小典型增生、班變組織提取總 免疫組化驗正小同病 小鼠炎癥園:露墓

19、蒹桑纂盛篆 理階段的信號通路活 子扎體芯片化情況: 構(gòu)建血清炎疝分子時問動志表達譜信號通蹄中關(guān)鍵凼子的表逃南生物信息學分析:楊紅回顧士完篩選各時段差異基因成聚炎分析?磷酸化宦集分析的表達分子交互作用絡(luò)構(gòu)建的表達分析與絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行比對驗證芯片數(shù)據(jù)探討“非,控性炎瓶不執(zhí)型增生一癌疵”序列演進過程巾關(guān)鍵分子投拜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化規(guī)律第:章博士學位論文第二章 材料與方法書料.實驗動物周齡雄性小鼠只,購于上海斯萊克實驗動物科技服務(wù)部。飼養(yǎng)條件:無特定病原體 級,溫度。,濕度%:白晝/黑夜輪換,喂食普通小鼠飼料。飼養(yǎng)地點:巾南大學實驗動物部。實驗前體重。本研究經(jīng)中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,課題中

20、所使用的動物嚴格按照批準的研究方案開展研究工作。.主要試劑與溶液.小鼠模型構(gòu)建氧化偶氨甲烷,葡聚糖硫酸鈉 ,相對分子量 ?,聯(lián)苯胺,上海遠航試劑廠.基因襄達譜巷片,廚.。該小鼠全基因組寡核個已知小苷酸芯片由廚公司提供,個探針組中包含至少鼠基因, 個轉(zhuǎn)錄本。芯片采用寡聚核苷酸原位光蝕刻專利技術(shù),應(yīng)用獨特的撩針設(shè)汁,使得芯片具有信息量大、特異性和靈敏度高的特點?？偝樘?, ,” ,。,質(zhì)量堿測: 甲醛上樣染液,演化乙錠, .的合成及其探針標記博士學位論文 第二章?, , ? ./洗脫與染色蹄盼, ,/,/?,?/、?,/,/ 一? .,一丹,.,/ , , ,/,/,/?/ ,一 % /.驗證芯片

21、結(jié)果,寶生物工程有限公司,實時定量試劑盒,上海吉瑪,.用于檢測的引物,應(yīng)用在線軟件設(shè)計,博尚生物技術(shù)有限公司合成:從】 從 ?丌丌 邢幾從【 丌丌淼荔篇孑淼 【墨帆帆娜【墨【至【至【至 州晷暑君刪耐量疵椰刪 ;篡篡篡 丌博士學位論文第二章:一“:“ :.染色硬免疫組化多聚甲醛、二甲苯,天津科密歐化學試劑有限公司無水乙醇、%乙醇、%乙醇,天津恒興化學試劑制造有限公司蘇術(shù)紊、伊紅染液,】昀,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公,福州邁新生物技術(shù)開笈有限公司葉性快干樹膠,北京巾衫金橋生物技術(shù)有限公司:,抗體: .:,武漢博士德生物工程有限公司:.,:,北京博奧森生物技術(shù)有限公司.炎癥園子抗體芯片.,?。該蛋白

22、芯片可同時檢測種小鼠炎癥因子的表達水平。其核心原理是一個三明治式的免疫反應(yīng)。個待檢測的炎癥因子抗體被固定在膜上,小鼠血清中的炎癥因子將與該膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合.然后被生物素化的抗體混臺液所識別。生物信號可以通過化學發(fā)光法被探測到。.主要儀器?珠磨式組織研磨器,臺式低溫高速離心機,儀,一,紫外分光光度計,.,凝膠成像儀,九.目.檢測系統(tǒng),.冷化學發(fā)光成像系統(tǒng),正置熒光顯微鏡,轉(zhuǎn)移脫色搖床,江蘇省金壇市正基儀器有限公司高速離心機.,北京時代兆利離心機有限公司第二章博士學位論文控溫磁力攪拌器,?,江蘇金壇市金城國勝實驗儀器.及冰箱,中國容聲公司超低溫冰箱,電子天平.儀器上海有限公司微量移液器,公司漩渦

23、混合器,江蘇大功率磁力加熱攪拌器.?,江蘇恒溫水浴箱,.軟件及數(shù)據(jù)庫.基因芯片實驗操作及數(shù)據(jù)分析軟件毋.: /一/。:/?.高通量基因寰達譜分析工具:主成分分析 ,在線軟件/:/. 自組織映射圖,生成軟件:版本生物分子功能注釋系統(tǒng) , :/. /“叫及其插件可視化工具:/./:/蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)預測軟件:/ /.基因信息查詢網(wǎng)蛄與數(shù)據(jù)庫:/. /:./,與人類:.數(shù)據(jù)對接研究數(shù)據(jù)來自與 /:/.博士學位治文 第二章/ .:/. /, ;本研究的芯片原始數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳,可通過數(shù)據(jù)獲取號獲得:/. / 。.實時熒光定量實驗操作廈數(shù)據(jù)分析軟件。配套 熒光定量儀方法.小鼠非可控性結(jié)腦炎相關(guān)性結(jié)直腸癌模

24、型的構(gòu)建廈觀察、標本采集.小模型構(gòu)建小鼠環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,于周齡時按體重隨機分為兩組:實驗組/組只,對照組生理鹽水.蒸餾水組只。實驗組小鼠第一天予以腹腔注射/一次,一周后予%連續(xù)飲用% 天.隨后無飲用蒸餾水,上述/蒸餾水循環(huán)次后兩次為天蒸餾水天.此后繼續(xù)予以飲用蒸餾水,構(gòu)建非可控降結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型。對照組小鼠于周齡時予腹腔注射同體積的生理鹽水,并連續(xù)飲用蒸餾水。阿組均予正常飲食。.動物的處理及標本采集.小鼠處死時間點的選擇以腹腔注射之日為第天,分別于第周末、周末、周末、周末、周末、周末、周末及周末共個間時點詳見圖隨機處死實驗組小鼠?只,對照組小鼠只。.標本采童小鼠血清的采集:

25、水合氯醛腹腔麻醉,持麻醉成功后,取小鼠眼球血八 中,室溫下水平放置, ,取上清分離心裝入 中冰箱存放。腸道組織及其他內(nèi)臟器官的采集:脫頸處死小鼠,沿腹巾線縱行剖開腹腔,游離結(jié)腸和遠端回腸.取肛門至盲腸末端的全結(jié)直腸。觀察各組小鼠結(jié)腸的大體形態(tài).測量結(jié)直腸長度小腸與盲腸匯合端至月門。沿結(jié)腸帶縱行剖開結(jié)直腸,用預冷無菌生理鹽水將結(jié)直腸沖洗干凈.觀察腸道內(nèi)壁情況,計數(shù)病變數(shù)日.于其末端距日 處剪取 長腸段段,分別放八盛有適量相當于組織倍體積的凍存管中,液氯保存。其余部分做瑞士卷,%多聚甲醛浸泡過夜,石蠟包埋、切片該部分由楊紅第二章博士學位論文園碩士完成,用于染色行病理檢查以及免疫組織化學染色。其他組

26、織器官包括肝、脾、肺及腫大淋巴結(jié)也同樣用%多聚甲醛浸泡過夜,石蠟包埋、切片,進行病理學觀察。.結(jié)腸炎活動程度評估每觀察小鼠的體重、大便性狀和便血情況.用聯(lián)苯胺法檢測大便隱血,即在待檢糞便上滴滴%聯(lián)苯胺冰醋酸溶液聯(lián)苯胺,加冰醋酸至,置棕色瓶巾,滴%過氧化氧溶液.若糞便變藍則為陽性。參照等的標準”,計算每只小鼠的疾癇活動指數(shù),見表?。體重下降分數(shù)大便性狀分數(shù)便血分數(shù)/。正常大便為干而小的顆粒狀,松軟便為糊狀但不粘肛門.稀便為液狀且粘附于肛門。袁? 評分標準塑墮墜蘭 壁坐堡 望竺竺型 竺一一注:指大便隱血.組織病理學觀察處死小鼠并縱行剖開腹腔及胸腔,重點觀察結(jié)直腸:測量結(jié)直腸長度,其后沿腸系膜縱行剪

27、開結(jié)直腸,觀察大體形態(tài),初步評估炎癥、潰瘍程度,計數(shù)黏膜隆起等病變數(shù)目。%多聚甲醛固定標本行脫水、石蠟包埋、切片,蘇木精一伊紅染色.普通光鏡下觀察結(jié)腸組織的病變情況,包括黏膜的完整性、黏膜內(nèi)炎癥細胞的浸潤、隱窩結(jié)構(gòu)的改變程度及炎癥范圍、不典型增生程度和腫瘤形成情況,并按照等剮的形態(tài)學評分標準表.分別對近端及遠端大腸進行炎癥組織學評分。不典型增生及癌變評判分別按照”和唑亭制定的標準進行。同時,觀察肝、脾、肺等重要臟器的大體形態(tài).稱重.觀察腹腔淋巴結(jié)是否腫大,取肝、脾、肺組織及腫大淋巴結(jié)行病理學觀察。以上病理學描述均由兩位病理學專業(yè)人員采用畝法施行。博士學位論文第二青表炎拄組織學評分標準標準竺生墮

28、?/四 齟.表達譜芯片實驗.組織樣本取/組小鼠腹腔注射后周末急性炎癥黏膜、周末不典型增生、周末腺癌、周末腺癌及周末腺癌結(jié)直腸黏膜和正常對照組第天為生理鹽水腹腔注射小鼠直腸黏膜各例用于基因表達譜分析,總共 例芯片。其余組織用作后續(xù)的驗證分析。組織詳細信息見表.。第章博士學位論文表用于牟基因組表選特芯片檢測的組織樣本.組織樣本抽提送蹄芯片的組織抽提及痕量基因組消化:/冰凍粉碎組織, 加入適量組織,.組織研磨器充分勻漿。勻漿后的樣品于室溫靜置一,適量氯仿 氯仿/,充分混勻,冰上放置。“,離心,將卜清轉(zhuǎn)移舉新的離心管。加入等體積異醇,充分混勻,冰上放置, ,棄上清。.離心沉淀中加入 %.醇.輕管壁使沉

29、淀懸浮,冰上放置。.,離心,棄上清。博士學位堿文 第二章沉淀于守氣中自然干燥后.加入?,使其充分溶解。在微量離心管中配制下列消化反應(yīng)液,水浴 。組織 .性踮 ?, /? 于上述反應(yīng)液中加入 ,使得總體積為】.。然后加入等體積平衡酚.充分混勻.冰上放囂, ,離心,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管。加入等體積氯仿,充分混勻,冰上放置,離心,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管。余步驟同。用于驗證的組織:使用公司的抽提,具體步驟如下:溶液配制:每中加入巰基乙醇:將 %乙醇加入“中的組織勻漿:冰凍粉碎組織,?組織研磨器進行勻漿。立即向勻漿組織中加入./,混勻.室溫靜置此后的操作均在室溫下完成。裂解產(chǎn)物,噸離心。于裂解產(chǎn)物中加

30、入等體積的%醇,漩渦震蕩充分混勻,使沉淀物充分分散。一次吸取不吵過的樣品至離心柱管芯中,離心。棄去過濾液,重復上述步驟直至所有樣品被過濾。管芯中加入,離心,將濾液及離心管一起丟棄,管芯放入新的收集管中。管芯巾加入 ,離心.棄去濾波.該步驟重復一次。管芯.離心.棄去濾液及收集管。將管芯置八回收管中,加入?,室溫下放第一章置。三.離心,回收管中得到純化的,標記,置慌保存。.組織樣品質(zhì)檢%甲醛變性瓊脂變性瓊脂糖凝膠電泳觀察組織樣品有無降解:配制混勻,加至點樣孔,電壓調(diào)糖凝膠,取組織樣品與至 ,電泳約 后,于紫外透射檢測儀上觀察組織樣品的、條帶是否清晰,點樣孔有無殘留,以此判斷有無降解及污染。分光光度計測定組織樣品的濃度和純度:取 組織樣品,應(yīng)用分光光度計測定與的吸光值。通過的吸光值計算組織樣品的濃度,計算公式為: 咖:通過計算與的比值評價組織樣品的純度。經(jīng)檢測.純度:/ :總量三;完整性:經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測,樣品電泳條帶清晰,:條帶亮度大于或接近:純度、總量及質(zhì)量均符合表達譜芯片實驗要求見圖一】.表。竄亭毒享亨拿爭享享享于摯害窖事?lián)茨脠D組織瓊脂糖凝膠電泳圈個小鼠結(jié)腸組織樣本.巷瓊脂糖凝膠電泳,條帶清晰,無降解,且無痕量污染.芯片實驗.靶標制備