液相色譜分析最新課件

1、液相色譜分析最新1第三章第三章 高效液相色譜分析高效液相色譜分析Chapter Three High Performance Liquid Chromatography （HPLC）液相色譜分析最新2 3 31 1 高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 一、一、高效液相色譜法高效液相色譜法概述概述 高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLCHPLC）在在經(jīng)典液相色譜經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測上，采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的自動化的特點，特點，因此得到迅猛的發(fā)

2、展。因此得到迅猛的發(fā)展。目前已成目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析重要手段。為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析重要手段。液相色譜分析最新3 1 1高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較 高速：高速：在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍快數(shù)百倍。由由于經(jīng)典色譜是于經(jīng)典色譜是重力加料重力加料，流出速度極慢；而高效液相，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了色譜配備了高壓輸液高壓輸液設(shè)備，流速最高可達設(shè)備，流速最高可達 10103 3cmmincmmin-1-1. . 例如例如分離氨基酸，用經(jīng)典色譜法，柱分離氨基酸，用經(jīng)典色譜法，柱長約長約170

3、cm170cm，柱徑，柱徑0.9cm0.9cm，流動相速度為，流動相速度為30cm30cm3 3hh-1-1，需用需用2020多小時才能分離出多小時才能分離出2020種氨基酸；而用高效液相種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需色譜法，只需lhlh之內(nèi)即可完成；之內(nèi)即可完成；高效：高效：其柱效可達其柱效可達3 3萬塔板萬塔板/ /米以上（氣相色譜約米以上（氣相色譜約2000 2000 塔板塔板/ /米），分離效率大大提高了。米），分離效率大大提高了。液相色譜分析最新42 2高效液相色譜法與氣相色譜法的比較高效液相色譜法與氣相色譜法的比較 （l l）氣相色譜法氣相色譜法分析對象只限于氣體和沸點較低分析

4、對象只限于氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的2020。對于占有機。對于占有機物總數(shù)近物總數(shù)近8080的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、離子型化的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、離子型化合物及摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用合物及摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色高效液相色譜法譜法進行分離和分析；進行分離和分析； 液相色譜分析最新5 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它與組分不產(chǎn)生氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它與組分不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分動相對

5、組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭，流動相對分離起很大作用，因此，作用的劇烈競爭，流動相對分離起很大作用，因此，可選用不同極性的液體，選擇余地大，相當(dāng)于增加了可選用不同極性的液體，選擇余地大，相當(dāng)于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離一個控制和改進分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便；條件提供了極大方便； （3）氣相色譜一般都在）氣相色譜一般都在較高溫度較高溫度下進行的，而高效液下進行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谙嗌V法則經(jīng)常可在室溫條件室溫條件下工作；下工作； 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操

6、作嚴(yán)格，這是它的主要這是它的主要缺點缺點。 液相色譜分析最新6 3 32 2 影響液相色譜分離的因素影響液相色譜分離的因素 氣相色譜所討論的氣相色譜所討論的基本概念及基本理論基本概念及基本理論，如：保留，如：保留值，分配系數(shù)，分配比，分離度，塔板理論，速率理值，分配系數(shù)，分配比，分離度，塔板理論，速率理論等論等與液相色譜一致與液相色譜一致，但液相色譜流動相為液體，其，但液相色譜流動相為液體，其擴散系數(shù)，粘度，密度等與氣體均有很大的擴散系數(shù)，粘度，密度等與氣體均有很大的差別差別，都，都將對色譜分析過程產(chǎn)生影響。將對色譜分析過程產(chǎn)生影響。 液相色譜分析最新7 該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，

7、該式與氣液色譜速率方程的形式基本一致，主要主要區(qū)別區(qū)別在在液液色譜液液色譜中組分的中組分的縱向擴散項可縱向擴散項可忽略忽略不計不計，影響柱效的，影響柱效的主要因素主要因素是是傳質(zhì)阻力項傳質(zhì)阻力項。 uDdCDdCDdCuDCdHsfsmpsmmpmmdp)(2222液相色譜分析最新82 2、液相色譜傳質(zhì)阻力：、液相色譜傳質(zhì)阻力：SfSDdC2（1）固定相傳質(zhì)阻力項）固定相傳質(zhì)阻力項 與氣液色譜中的液相傳質(zhì)基本一致，改善方與氣液色譜中的液相傳質(zhì)基本一致，改善方法：采用薄的液膜、小顆粒的填料、使用擴散系法：采用薄的液膜、小顆粒的填料、使用擴散系數(shù)大的固定液和低流速。數(shù)大的固定液和低流速。液相色譜分

8、析最新9（2）流動相傳質(zhì)阻力項）流動相傳質(zhì)阻力項mpmDdC2A 流動的流動的流動相傳質(zhì)阻力項流動相傳質(zhì)阻力項 分離柱內(nèi)流動相流速并不均勻，靠近固定相流分離柱內(nèi)流動相流速并不均勻，靠近固定相流動慢。常數(shù)動慢。常數(shù)Cm和柱直徑、形狀和填料結(jié)構(gòu)有關(guān)。和柱直徑、形狀和填料結(jié)構(gòu)有關(guān)。液相色譜分析最新10B滯留的滯留的流動相傳質(zhì)阻力項流動相傳質(zhì)阻力項mpsmDdC2 流動相會部分滯留在固定相的孔穴中，組分流動相會部分滯留在固定相的孔穴中，組分要在固定相中保留，先要擴散到滯留區(qū)。固定要在固定相中保留，先要擴散到滯留區(qū)。固定相粒度小，微孔孔徑越大而淺，有利于傳質(zhì)，相粒度小，微孔孔徑越大而淺，有利于傳質(zhì)，柱效

9、較高。柱效較高。液相色譜分析最新11 要提高液相色譜的分離效率，裝柱的均勻要提高液相色譜的分離效率，裝柱的均勻性和減小固定相（目前常用性和減小固定相（目前常用5 m）的粒徑是）的粒徑是關(guān)鍵。另外，降低流動相的黏度也可加快傳質(zhì)，關(guān)鍵。另外，降低流動相的黏度也可加快傳質(zhì)，提高柱效，流速對板高的影響和氣相色譜一樣提高柱效，流速對板高的影響和氣相色譜一樣存在最佳流速。存在最佳流速。 HPLC的最小板高比的最小板高比GC的板高小一個數(shù)量的板高小一個數(shù)量級，說明其有大得多的柱效。級，說明其有大得多的柱效。液相色譜分析最新12 HPLC中還存在中還存在柱前柱前和和柱后柱后展寬，柱前展寬展寬，柱前展寬和進樣有

10、關(guān)，要想辦法減小柱前樣品的擴散。和進樣有關(guān)，要想辦法減小柱前樣品的擴散。 柱后展寬和色譜柱和檢測器連接管和檢測器柱后展寬和色譜柱和檢測器連接管和檢測器的死體積密切相關(guān)，要盡可能減小。的死體積密切相關(guān)，要盡可能減小。液相色譜分析最新13一、液液分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜一、液液分配色譜法及化學(xué)鍵合相色譜1 1分離原理分離原理 分離原理基本與分離原理基本與液液萃取液液萃取相同相同，都是根據(jù)物質(zhì)在都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。分配系數(shù)。33 高效液相色譜的主要類型液相色譜分析最新14和和氣液色譜氣液色譜的比較的比較相同

11、點：固定液相同點：固定液是是涂漬涂漬在擔(dān)體表面；在擔(dān)體表面；不同點：不同點：流動相種類對分配系數(shù)有較大的影響。流動相種類對分配系數(shù)有較大的影響。液相色譜分析最新15 2 2、正相分配色譜和反相分配色譜、正相分配色譜和反相分配色譜 為了避免固定液的流失。要求流動相盡可能不與固定為了避免固定液的流失。要求流動相盡可能不與固定相互溶，而且兩相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所用流相互溶，而且兩相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所用流動相和固定相的極性程度，將其分為動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜正相分配色譜和和反反相分配色譜相分配色譜； 正相分配色譜：正相分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性。流動

12、相的極性小于固定相的極性。它它適用于極性化合物的分離。其流出順序是按極性順序流適用于極性化合物的分離。其流出順序是按極性順序流出；出； 反相分配色譜：反相分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性。流動相的極性大于固定相的極性。它它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。好相反。 液相色譜分析最新163 3、化學(xué)鍵合相色譜、化學(xué)鍵合相色譜 為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過有機基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面化學(xué)反應(yīng)

13、鍵合到載體表面的一種方法，代替了固定的一種方法，代替了固定液的機械涂布，它的液的機械涂布，它的分離機理：分離機理：一般認為一般認為分配和吸分配和吸附附兩種作用兼有；兩種作用兼有； 可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破，對液相色譜的迅速發(fā)展起著重大作用破，對液相色譜的迅速發(fā)展起著重大作用 。它是目它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。而單純地液液分配色前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。而單純地液液分配色譜已很少采用。譜已很少采用。液相色譜分析最新17二、液二、液- -固吸附色譜（固吸附色譜（liquid-solid liquid-solid adsorptiona

14、dsorption chromatographychromatography）固定相固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是用的是510m的硅膠吸附劑。的硅膠吸附劑。流動相流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。：各種不同極性的一元或多元溶劑。基本原理基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。缺點缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。：非線形等溫

15、吸附常引起峰的拖尾。液相色譜分析最新18三、離子對色譜（三、離子對色譜（ion pair ion pair chromatographychromatography）原理：原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水結(jié)合形成疏水 性離子對化合物，使其能夠在兩相之性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；間進行分配；陰離子分離陰離子分離常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十氧化十 六烷基三甲銨作為對離子；六烷基三甲

16、銨作為對離子；陽離子分離陽離子分離常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；離子；液相色譜分析最新19反相離子對色譜反相離子對色譜：非極性的疏水固定相非極性的疏水固定相(C-18柱柱)，含有對，含有對離子離子Y+的甲醇的甲醇-水或乙腈水或乙腈-水作為流動相，試樣離子水作為流動相，試樣離子X-進進入流動相后，生成疏水性離子對入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配后；在兩相間分配。液相色譜分析最新20XYXYXYXY + Y =YYKYYKYKYKY(1)1XXRRMMMRMXXXXXDXDtttkttLttku水相水相有機有機水相水相有機水相水相

17、水相水相（） Kxy取決于對離子和有機相的性質(zhì)；對離子取決于對離子和有機相的性質(zhì)；對離子Y-的濃的濃度可控制組分的保留值，可在較大范圍內(nèi)改變分離的選度可控制組分的保留值，可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性。擇性。液相色譜分析最新21 注意：注意： 離子對色譜特別是離子對色譜特別是反相離子對色譜反相離子對色譜解決了強解決了強極性有機酸、有機堿的難以分離的問題，特別適合一些極性有機酸、有機堿的難以分離的問題，特別適合一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿等的分離，另外借助離生化試樣如核酸、核苷、生物堿等的分離，另外借助離子對的生成還可引入紫外吸收或熒光基團，可提高靈敏子對的生成還可引入紫外吸收或熒光基團，可

18、提高靈敏度。度。液相色譜分析最新22四、離子交換色譜（四、離子交換色譜（ion-exchange ion-exchange chromatographychromatography）固固 定定 相相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；樹脂；流流 動動 相相：鹽類的緩沖溶液。通過改變流動相的：鹽類的緩沖溶液。通過改變流動相的pH、緩沖劑（平衡離子）的類型、離子強度以及加入有緩沖劑（平衡離子）的類型、離子強度以及加入有機溶劑、配位劑等都會改變交換劑的選擇性，影響機溶劑、配位劑等都會改變交換劑的選擇性，影響樣品的分離。樣品的分離。 液相色譜分析最新23 流動

19、相流動相離子強度離子強度的變化對保留值的影響比的變化對保留值的影響比pH更顯著。更顯著。組分的保留值受流動相中鹽類的總濃度控制。增加外加組分的保留值受流動相中鹽類的總濃度控制。增加外加陰離子或陽離子總數(shù)，會增強它們對陰離子或陽離子總數(shù)，會增強它們對R+或或R-的競爭能的競爭能力，使組分離子的保留值減小。通過加入不同性質(zhì)的外力，使組分離子的保留值減小。通過加入不同性質(zhì)的外加鹽類，可以影響柱的選擇性，因為不同外加離子對交加鹽類，可以影響柱的選擇性，因為不同外加離子對交換劑的固定基團的親和力大小不同。換劑的固定基團的親和力大小不同。 流動相的流動相的pH值值會影響酸或堿的離解平衡，若組分以會影響酸或

20、堿的離解平衡，若組分以分子形式存在，則不被固定相保留。離子形式所占分子形式存在，則不被固定相保留。離子形式所占的分數(shù)越大，保留值也越大；反之，保留值越小。的分數(shù)越大，保留值也越大；反之，保留值越小。常用的緩沖劑有磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、乙酸常用的緩沖劑有磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、氨水等。鹽、氨水等。液相色譜分析最新24 陽離子交換：陽離子交換：RSO3Na+M+=RSO3M+Na+ 陰離子交換：陰離子交換：RNR4Cl+X-=RNR4X+Cl-應(yīng)應(yīng) 用用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。4444XXXRNR XClKRNR ClXRNR

21、XRNR ClDKXCl基本原理基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)的離子交換反應(yīng)；組：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)的離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。存在形式等有關(guān)。 親和力大，保留時間長；親和力大，保留時間長；液相色譜分析最新25五、離子色譜（五、離子色譜（ion chromatographyion chromatography）固定相：固定相：離子交換樹脂離子交換樹脂流動相：流動相：電解質(zhì)溶液電解質(zhì)溶液檢測器：檢測器：電導(dǎo)檢測、電化學(xué)檢測器、紫外檢測器電導(dǎo)檢測、電化學(xué)檢測器、紫外檢測器分析對象：分析對象：

22、水溶液中的陰、陽離子、糖類、氨基酸等水溶液中的陰、陽離子、糖類、氨基酸等離子色譜分為雙柱型離子色譜法和單柱型離子色譜。離子色譜分為雙柱型離子色譜法和單柱型離子色譜。雙柱即在分離柱后連接一個抑制柱，如雙柱即在分離柱后連接一個抑制柱，如 洗脫液是濃度很大的洗脫液是濃度很大的NaOH，離子交換下來待測，離子交換下來待測離子離子Br-進入洗脫液引起的電導(dǎo)變化很小，檢測靈進入洗脫液引起的電導(dǎo)變化很小，檢測靈敏度很低。敏度很低。+-+- +Na BrBr +NaROHROH 交換洗脫液相色譜分析最新26在分離柱后連接一個高容量的陽離子交換柱：在分離柱后連接一個高容量的陽離子交換柱： 這樣就消除了洗脫液本底

23、電導(dǎo)的影響，大大提這樣就消除了洗脫液本底電導(dǎo)的影響，大大提高了所測陰離子的檢測靈敏度。高了所測陰離子的檢測靈敏度。-2-RHNa OHRNaRHNaRNaH OBrH Br 單柱離子色譜即選用低電導(dǎo)的洗脫液，如苯甲單柱離子色譜即選用低電導(dǎo)的洗脫液，如苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液，分離洗脫各個陰離子，酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液，分離洗脫各個陰離子，直接進入檢測器進行檢測。直接進入檢測器進行檢測。液相色譜分析最新27六、空間排阻色譜（六、空間排阻色譜（steric exclusion steric exclusion chromatographychromatography）固定相固定相：凝膠凝

24、膠(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；因此，排阻色；因此，排阻色譜又稱為凝膠滲透色譜。譜又稱為凝膠滲透色譜。原理：原理：按分子大小分離。按分子大小分離。 小分子可以擴散到凝膠空隙，從空隙中通過，出小分子可以擴散到凝膠空隙，從空隙中通過，出峰最慢；峰最慢； 中等分子只能部分進入凝膠空隙，中速通過；中等分子只能部分進入凝膠空隙，中速通過； 大分子被排斥在外，出峰最快；大分子被排斥在外，出峰最快； 溶劑分子最小，在最后出峰，即組分全溶劑分子最小，在最后出峰，即組分全部在死時部在死時間前出峰；在柱中停留的時間短，柱內(nèi)展寬小，柱效間前出峰；在柱中停留的時間短，柱內(nèi)展寬小，柱效較高。較高。液相色

25、譜分析最新28 分子量介于全排分子量介于全排斥和全滲透之間的化斥和全滲透之間的化合物，按相對分子量合物，按相對分子量降低的次序被洗脫，降低的次序被洗脫，通常將通常將V1-V4稱為分級稱為分級范圍范圍液相色譜分析最新29分析對象：分析對象：可對相對分子質(zhì)量在可對相對分子質(zhì)量在100-8105范圍內(nèi)的化范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。不能用來分離大小相似、相對分子量接合物按質(zhì)量分離。不能用來分離大小相似、相對分子量接近的分子（相對分子量在近的分子（相對分子量在10%） 一些相對分子量變化連續(xù)的高聚物，雖不能用凝膠色一些相對分子量變化連續(xù)的高聚物，雖不能用凝膠色譜進行分離，但可測定其相對分子質(zhì)量分級的情況

26、。譜進行分離，但可測定其相對分子質(zhì)量分級的情況。液相色譜分析最新30一、液液色譜、鍵合相色譜法及離子對色譜法一、液液色譜、鍵合相色譜法及離子對色譜法固定相固定相1. 固定相分類固定相分類 （1）全多孔型擔(dān)體）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用不佳已不多見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；合制備柱填料；34 液相色譜法固定相液相色譜分析最新31（2）表面多孔型擔(dān)體）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體

27、）（薄殼型微珠擔(dān)體）3040m的玻璃微球，的玻璃微球，表面附著一層厚度為表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。表面的多孔硅膠。表面積小，柱容量低。積小，柱容量低。 將固定相涂在單體上最大的問題是固定液的將固定相涂在單體上最大的問題是固定液的流失。流失。20世紀(jì)世紀(jì)60年代后期發(fā)展了新型固定相年代后期發(fā)展了新型固定相化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相液相色譜分析最新323） 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、

28、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN液相色譜分析最新33液相色譜分析最新34化學(xué)鍵合固定相的特點化學(xué)鍵合固定相的特點1）傳質(zhì)快傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；2）壽命長壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； 4）選擇性好選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；，可鍵合不同官能團，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫；有利于梯度洗脫； 存在著存在著雙重分離機制雙重分離機制：(鍵合

29、基團的覆蓋率決定分離機理鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；低覆蓋率：吸附為主；液相色譜分析最新352、液、液-固吸附分離固定相固吸附分離固定相種類：種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；全多孔型和薄殼型；粒度：粒度：510 m。液相色譜分析最新363.離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

30、）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團） 樹脂類別：樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）液相色譜分析最新37液相色譜分析最新384. 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機

31、凝膠；二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等；多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小質(zhì)影響小, 可在較高流速下使用。可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。液相色譜分析最新39一、流動相類別一、流動相類別按流動相組成分按流動相組成分：單組分和多組分；單組分和多組分；按極性分按極性分：極性、弱極性、非極性；

32、極性、弱極性、非極性；按使用方式分按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。35 液相色譜法流動相相液相色譜分析最新40二、選擇流動相時應(yīng)注意的幾個二、選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題問題v1 純度要高純度要高 溶劑的純度極大地影響色譜系統(tǒng)的正常操溶劑的純度極大地影響色譜系統(tǒng)

33、的正常操作和色譜分離效果。溶劑中若存在雜質(zhì)會污染柱子，作和色譜分離效果。溶劑中若存在雜質(zhì)會污染柱子，存在固體顆粒會損害高壓泵或輸液通道，使壓力升高，存在固體顆粒會損害高壓泵或輸液通道，使壓力升高，基線漂移?；€漂移。v2 粘度要低粘度要低 高效液相色譜中為獲得一定流速必須使用高效液相色譜中為獲得一定流速必須使用高壓，若溶劑粘度較高，操作壓力也更大。高的壓力高壓，若溶劑粘度較高，操作壓力也更大。高的壓力會使色譜柱性能降低，而且泵也容易損壞。會使色譜柱性能降低，而且泵也容易損壞。v3 化學(xué)穩(wěn)定性好化學(xué)穩(wěn)定性好 流動相不能與固定相或組分發(fā)生任何流動相不能與固定相或組分發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)?；瘜W(xué)反應(yīng)。v4

34、 溶劑沸點要高于溶劑沸點要高于55 低沸點溶劑揮發(fā)度大，容易使低沸點溶劑揮發(fā)度大，容易使流動相濃度或組成發(fā)生變化，也容易產(chǎn)生氣泡。流動相濃度或組成發(fā)生變化，也容易產(chǎn)生氣泡。液相色譜分析最新41v5 溶劑要能完全浸潤固定相溶劑要能完全浸潤固定相 溶劑對所測定的組分要有溶劑對所測定的組分要有合適的極性，最好選擇樣品的溶劑作流動相，否則發(fā)合適的極性，最好選擇樣品的溶劑作流動相，否則發(fā)生溶劑與流動相不相混溶的情況，使分離變壞。生溶劑與流動相不相混溶的情況，使分離變壞。v6 溶劑要與檢測器匹配溶劑要與檢測器匹配 溶劑要適合于檢測器，例如采溶劑要適合于檢測器，例如采用示差折光率檢測器，必須選擇折光率與樣品

35、有較大用示差折光率檢測器，必須選擇折光率與樣品有較大差別的溶劑作流動相；若采用紫外吸收檢測器，所選差別的溶劑作流動相；若采用紫外吸收檢測器，所選擇的溶劑在檢測器的工作波長下不能有紫外吸收。擇的溶劑在檢測器的工作波長下不能有紫外吸收。液相色譜分析最新42三、三、 流動相選擇流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用采用正相液正相液-液分配色譜分離液分配色譜分離時：首先選擇中等極時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，也可先低極性溶劑，再逐漸增加其中的極性溶劑，也可先低極性

36、溶劑，再逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。使保留時間縮短。 反相色譜反相色譜中通常以水為流動相主體，加入不同的中通常以水為流動相主體，加入不同的有機溶劑作調(diào)節(jié)劑。有機溶劑作調(diào)節(jié)劑。 常用的有機溶劑：甲醇、乙腈、二氧六環(huán)和四氫常用的有機溶劑：甲醇、乙腈、二氧六環(huán)和四氫呋喃等呋喃等液相色譜分析最新43常用溶劑的常用溶劑的極性極性順序順序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙丙酮酮 二氧六環(huán)二氧六環(huán) 四氫呋喃四氫呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酸乙酯乙酯 乙醚乙醚 異丙醚異丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫

37、化碳環(huán)己烷環(huán)己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小) 排阻色譜所采用的溶劑要和凝膠本身比較相似，排阻色譜所采用的溶劑要和凝膠本身比較相似，對于高分子有機化合物，常采用四氫呋喃、甲苯、對于高分子有機化合物，常采用四氫呋喃、甲苯、間甲苯酚和間甲苯酚和N，N-二甲基甲酰胺等；對于生物物質(zhì)二甲基甲酰胺等；對于生物物質(zhì)主要采用水、緩沖鹽溶液、乙醇和丙酮等。主要采用水、緩沖鹽溶液、乙醇和丙酮等。液相色譜分析最新4436 高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的一般可分為高效液相色譜儀的一般可分為4 4個主要部個主要部分分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)測系統(tǒng), ,另有輔助裝

38、置：如梯度淋洗，自動進另有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。樣及數(shù)據(jù)處理等。液相色譜分析最新45液相色譜分析最新46一高壓輸液系統(tǒng)一高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。一般備有高壓輸液系統(tǒng)。一般由儲液罐、高壓輸液泵、由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中其中高壓輸液泵高壓輸液泵是核心部件是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封密封性好，輸出流

39、量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。等要求。 液相色譜分析最新47往復(fù)式高壓恒流泵往復(fù)式高壓恒流泵液相色譜分析最新48注射泵注射泵液相色譜分析最新49二進樣系統(tǒng) 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴(yán)。色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴(yán)。 進樣裝置進樣裝置： 注射器進樣注射

40、器進樣 高壓定量進樣閥高壓定量進樣閥液相色譜分析最新50三、分離系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)色譜柱色譜柱 色譜柱包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻色譜柱包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅，內(nèi)襯光滑的聚合材料。玻璃管璃、不銹鋼、鋁、銅，內(nèi)襯光滑的聚合材料。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。耐壓有限，故金屬管用得較多。 一般色譜柱長一般色譜柱長5 530cm30cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為4 45mm5mm，凝膠色譜，凝膠色譜柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑3 312mm12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達，制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm 25mm 以上。以上。 一般在分離前備有一個一般在分離前備有一個前置柱前置柱，前置柱

41、內(nèi)填充物，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。 液相色譜分析最新51液相色譜分析最新52四檢測系統(tǒng)四檢測系統(tǒng) 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。 一類是一類是溶質(zhì)型檢測器溶質(zhì)型檢測器，它僅對被分離組分，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有有紫外、熒光、電化

42、學(xué)檢測器等紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。 另一類是另一類是總體檢測器總體檢測器，它對試樣和洗脫液，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有的有示差折光，電導(dǎo)檢測示差折光，電導(dǎo)檢測器等。器等。液相色譜分析最新53 五、附屬系統(tǒng)五、附屬系統(tǒng) 它包括它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中裝置。其中梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置是高壓是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置；液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置； 梯度淋洗（梯度洗脫）：是在分離過程中逐漸改梯度淋洗（梯度洗脫）

43、：是在分離過程中逐漸改變流動相的組成，增加洗脫能力的一種方法。變流動相的組成，增加洗脫能力的一種方法。主要是主要是通過梯度裝置將兩種（或更多）極性不同的溶劑在分通過梯度裝置將兩種（或更多）極性不同的溶劑在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相中溶劑的的配比離過程中按一定程序連續(xù)改變流動相中溶劑的的配比和極性。和極性。液相色譜分析最新54 優(yōu)點：優(yōu)點：通過改變極性來改變分離組分的分離通過改變極性來改變分離組分的分離因素，以提高分離效果，增加分辨能力，改因素，以提高分離效果，增加分辨能力，改善峰形，同時可縮短分離時間善峰形，同時可縮短分離時間。PUMPPUMPPUMP液相色譜分析最新5537高效液相色

44、譜分離類型選擇 液相色譜分析最新5639液相制備色譜 制備色譜制備色譜：將分析色譜的進樣量增大，同時得出大：將分析色譜的進樣量增大，同時得出大量的所需物質(zhì)（餾分）的過程。制備色譜的目的，量的所需物質(zhì)（餾分）的過程。制備色譜的目的，是從混合物中得到純物質(zhì)。制備色譜系統(tǒng)則是利用是從混合物中得到純物質(zhì)。制備色譜系統(tǒng)則是利用制備色譜的思想高效能得到純化物質(zhì)的多個分析測制備色譜的思想高效能得到純化物質(zhì)的多個分析測試設(shè)備聯(lián)用的總稱。試設(shè)備聯(lián)用的總稱。 液相色譜分析最新57傳統(tǒng)的制備色譜一般由一臺可以連續(xù)輸送液體的恒傳統(tǒng)的制備色譜一般由一臺可以連續(xù)輸送液體的恒流流泵泵、紫外檢測儀紫外檢測儀與與色譜柱色譜柱構(gòu)

45、成，其中最重要的部構(gòu)成，其中最重要的部件是價格不一，款式多樣的色譜柱，這也是影響最件是價格不一，款式多樣的色譜柱，這也是影響最終制備效果的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。終制備效果的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。 各種規(guī)格的各種規(guī)格的玻璃柱子玻璃柱子在實驗室里很容易得到，而在實驗室里很容易得到，而且價格低廉，但玻璃柱子致命的弱點是它能承受的且價格低廉，但玻璃柱子致命的弱點是它能承受的壓力很小，且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)壓力很小，且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動相流速很慢的時候，高位液面或加高壓空氣致流動相流速很慢的時候，高位液面或加高壓空氣（或者氮氣）的采用是一個簡單的解決辦法。在底（或者氮氣）的采用是一個簡單的解

46、決辦法。在底下加真空，也能在一定程度上解決這個問題。下加真空，也能在一定程度上解決這個問題。 液相色譜分析最新58不銹鋼不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能，柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能，但其價格相對很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且但其價格相對很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費也允許，市面上直徑為經(jīng)費也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是的小型制備柱就是首選。首選。 有機玻璃有機玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對不銹鋼柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對不銹鋼柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運行狀柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運行狀態(tài)，對有色的物質(zhì)其特點就更為突出。態(tài)，對有色的物質(zhì)

47、其特點就更為突出。硅膠、鍵合固定相（如硅膠、鍵合固定相（如C18）、離子交換樹脂）、離子交換樹脂 、聚酰胺、聚酰胺、 氧化鋁、氧化鋁、 凝膠等都可以作為色譜柱的填凝膠等都可以作為色譜柱的填料。料。 有不少文獻報道，對填料可以進行處理可提高有不少文獻報道，對填料可以進行處理可提高分離效果。分離效果。 液相色譜分析最新59在制備色譜中在制備色譜中柱容量柱容量是影響所用技術(shù)和裝置的是影響所用技術(shù)和裝置的重要因素。重要因素。柱容量（柱負荷），在分析色譜中指不影響柱效能柱容量（柱負荷），在分析色譜中指不影響柱效能的情況下的最大進樣量。在制備色譜中指不影響收的情況下的最大進樣量。在制備色譜中指不影響收集物

48、純度的前提下的最大進樣量。集物純度的前提下的最大進樣量。進樣量越大，色譜柱處于過載狀態(tài)，柱效將大幅度進樣量越大，色譜柱處于過載狀態(tài)，柱效將大幅度降低，峰形變差，制備色譜中允許過載，但以柱效降低，峰形變差，制備色譜中允許過載，但以柱效降到降到50%為宜。為宜。液相色譜分析最新60一般操作方法：一般操作方法：在分析液相色譜上使組分得到在分析液相色譜上使組分得到最大分離；加大進樣量直到色譜峰發(fā)生重疊；在這最大分離；加大進樣量直到色譜峰發(fā)生重疊；在這柱容量極限內(nèi)，色譜柱的操作情況和分析型分離很柱容量極限內(nèi)，色譜柱的操作情況和分析型分離很接近，同時柱直徑要按比例擴大以允許最大的試樣接近，同時柱直徑要按比

49、例擴大以允許最大的試樣量。量。液相色譜分析最新61高速逆流色譜高速逆流色譜 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是）是 20 世紀(jì)世紀(jì) 80 年代年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液液分配色譜分離技術(shù)，液分配色譜分離技術(shù)， 它不用任何固態(tài)的支撐物或載體。它不用任何固態(tài)的支撐物或載體。 它利用兩相溶劑它利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作流體動力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連

50、續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。 由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合于天然生物活性成分的分離。別適合于天然生物活性成分的分離。液相色譜分析最新62 由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間

51、能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。離手段。 它相對于傳統(tǒng)的固它相對于傳統(tǒng)的固液柱色譜技術(shù)，具有適用液柱色譜技術(shù)，具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費用低等優(yōu)點。目前低等優(yōu)點。目前 HSCCC 技術(shù)正在發(fā)展成為一種備技術(shù)正在發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領(lǐng)域，醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領(lǐng)域， 特別在天特別在天然產(chǎn)物行業(yè)中已被認為是一種有效的新型分離技然產(chǎn)物行業(yè)中已被認為是一種有效的新型分離技 術(shù)；術(shù)；適合于中小分子類物質(zhì)的分離純化。適合于中小分子類物質(zhì)的分離純化。 液相色譜分析最新63 310毛細管電泳簡介 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。移速率不同，可實現(xiàn)分離。 19371937年，年，Tiselius(Tiselius(瑞典瑞