生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶的分離提取及比活力的

1、十實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定目的要求：1 學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)分離純化的一般原理和步驟掌握堿性磷酸酶制備的操作技術(shù)及比活 測定的方法彈性磷酸酶(Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1嗇稱為ALPase)廣泛諒在于微生物界和動物界。 ALPase能催化元乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng), 產(chǎn)生無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯 轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。在蛋白質(zhì)或酶的分離提取過程中由于酶蛋白容易變性而失活，為了獲得較好的分離提取效果，在工作 中特別注意以下幾點(diǎn)：(1) 譲用新鮮的材料，提取工作應(yīng)在獲得材料后立刻開始，否則應(yīng)在低溫

2、下保存。選擇來源豐富，酶含量 高的材料。(2) 用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。由于硫 酸鞍在水中溶解度很大(20°C,每升可溶760克)， 并且對許多酶沒有很大的影響，因此它是最常用的 鹽。(3) 在酶的制備過程中，每經(jīng)一步處理，都需測定酶的 活力和比活力。唯有比活力提高較大，提純步驟才 有效。酶活力的分析：通常是以對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)為底物，在pHlO.l的碳酸鹽緩沖液(含2 mmol/L Mg2+)的測活體系中檢測酶催化pNPP水解 下生黃色的對硝基苯酚(pNP)的量。產(chǎn)物pNP在405 nm處有最大的吸收峰，可以根據(jù)OD405 nm < 的增加計(jì)算酶活力的

3、大小。酶活力定義為：在37°C下，以2 mmol/L pNPP為底 物，在pHlO.l的碳酸鹽緩沖液含2 mmol/L Mg2+的 測活體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 pimol/L pNP的酶量定 為1個酶活力單位。酶的比活力定義為每mg蛋白所 具有的酶活力單位數(shù)。蛋白質(zhì)濃度的測定常采用福林酚試劑(FolinPhenol reagent)顯色法3操作方法3.1牡蠣堿性磷酸酶的分離提?。?）每組稱取20 g牡蠣（蒸憾水洗凈），加入50mL_L頁先冷卻的0.01 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.5, 0.1 mol/L NaCl）,（兩組一趙）于高速組織搗粹機(jī)勻漿1 min,于

4、訊錯4£故置1 h逸彳亍抽捷。（2）室溫離心，3000 r/m 20 min,收集離心上清液，（兩組分開）并量體積。（留2 mL上清液，待 測酶的比潔力。）（3）在上清液中加入研磨細(xì)粉的固體硫酸錢至0.35飽 和度（lOOmL加入20.9 g） o緩慢加入，不斷攪 拌溶解，置冰箱靜置lh。（4）室溫離心，3000 r/m 20 min,收集離心上清液， 并量體積。（留2 mL上清液，對0.01 mol/L Tris- HCl 緩沖液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡， 待測罐的比爵力。）(5) 0.35飽和硫酸錢上清液，加入固體研磨細(xì)粉的硫酸 鞍至0.70飽和度(lO

5、OmL加入23.8 g) o緩慢加入, 不斷攪拌溶解，置冰箱靜置2 h。(6) 聿溫離心，4000 r/m 20 min,收集沉淀物。(7) 軸到沉淀物，溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5-裝入透析袋，對0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5緩沖液透析平衡，至無SCV-被檢測 岀為止(可用一定濃度BaCl?溶液檢驗(yàn))。(8) 取出酶溶液，冷凍高速離心(0°C 25000 r/m 30 min) o(9)離心上清液即為粗酶制劑，檢測酶的比活力。裝入棕色瓶于4 °C冰箱保存。20 g牡蠣*上清液加入50

6、 mL預(yù)先冷卻的0.01 mol/L Tris-HCI緩沖液（pH 7.5, 含0.1 mol/L NaCI）,于高速組織搗粹機(jī)勻漿1 min,于冰箱 4°C放置1 h進(jìn)行抽提。室溫離心，4000 r/m 20 min,收集離心上清液，并量體積。緩慢加入研磨細(xì)粉的固體硫酸鞍至0.35飽和度（100 mL加入20.9 g）,不斷攪拌溶解，置冰箱靜置lh。室溫離心，4000 r/m 20 min,收集離心上清液，并量體積。0.35飽和硫酸鞍上清液加入固體研磨細(xì)粉的硫酸鞍至0.70飽和度（100 mL加入23.8 g） o 緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置2 h。室溫離心，4000 r/

7、m 20 min,收集沉淀物。沉淀溶于5mL含0.1 mol/L NaCI 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5 o 裝入透 析袋，對0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5緩沖液透析平衡，至無SCV-被 檢測出為止粗酶液3.2比活力測定321對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（不做）：取15支試管編號，0號一支，1 7號各二支，按下列表格操作。管號01234567pN#含量(ymol)00.050.100.150.200.250.300.350.5jLimol/mL pNP (mL)00.10.20.30.40.50.60.7H2O (mL)0.80.70.60.50.4

8、0.30.20.1Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL20 mmol/L MgCl? (mL)各管加入0.2 mL0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mLOD 405 nmDoooo以對硝基苯酚的絕對量（呵0|數(shù)）為橫坐標(biāo)，OD405nm值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求出pNP的克分子消光系數(shù)（£）值。£=8.80 x 103（ mol/L）'1 - cm-13.2.2酶活力的測定管號空白1235 mM pNPP(mL)各02mLNa2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL20 mmol/L MgCl9 (mL)各管加

9、入0.2 mLH.O (mL)J各 0.50mL混勻，37°C, 5分鐘酶液（mL）各O.lmL37°C,精確反應(yīng)10分鐘0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mL酶液（mL）O.lmL°D 405 nm1以0號管調(diào)零點(diǎn)，測定各管的OD405nm值，從對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出產(chǎn) 物的pimol數(shù)，算出酶活力。加酶1間(mil1 寸1)0.5mlm加NaOH時間10.511反應(yīng)時 間(min)1010管號122131.5m2m2.5m11.51212.51010103 14415513m3.5m4m4.5m5m1313.51414.5151010101010

10、323蛋白濃度的測定本實(shí)驗(yàn)采用紫外吸收法（OD280）測定蛋白濃度。卜上述分離提取的三步酶制劑按一定比例用TrisHCI緩沖液稀釋，稀釋倍數(shù)視溶液的蛋 白濃度高低而定。（一般稀釋510倍）。3.3結(jié)果處理計(jì)算：酶活力（U/mL）蛋白濃度式中：A為稀秣倍數(shù)， juimol數(shù)，t為反應(yīng)時間，C(mg/mL) =AV2H為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的pNPC為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白mg數(shù)，V為測定酶活力所用的酶量（mL數(shù)）V?為測定 酶活力所用的酶量（inL數(shù)）酶的比活力（U/mg）=酶活力（U/mL）蛋白濃度（mg/mL） 純化倍數(shù)=各步比活力/第一步比活力 得率二各步總活力*100/第一步總活力將測定的數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果用下表記錄。（本實(shí)驗(yàn)不做）步驟總體 積mL蛋白 mg/ mL總蛋 白mg酶活 力U/m總活 力U比活 力U/m純化倍“得率%勻漿過濾液4007.242上3g正丁醇處理上清液47033.80.35飽和(NH4)9SO4 h 清液44035.30.7飽和（nhJ2so4沉淀 溶解透析上清液40.3314.7DEAE-32 酶液9.63.821002.2Sephadex G75 酶液13.20.49451.5Sephadex G