流式細(xì)胞儀操作規(guī)程-SOP

1、-作者xxxx-日期xxxx流式細(xì)胞儀操作規(guī)程-SOP【精品文檔】 流式細(xì)胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定及絕對(duì)計(jì)數(shù)2：活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的檢測(cè)3：HLA-B27測(cè)定4：CD55CD59測(cè)定5：干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)6：白血病免疫分型測(cè)定7：淋巴細(xì)胞T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4測(cè)定8：細(xì)胞周期分析9：活化血小板檢測(cè)10：血小板抗體測(cè)定11：紅細(xì)胞抗體測(cè)定12：粒細(xì)胞抗體測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定(流式細(xì)胞儀) 醫(yī)院檢驗(yàn)科操作規(guī)程文件號(hào)：200 年 月 日起實(shí)施第1版(共3頁(yè)) 本規(guī)程每2年復(fù)審一次 復(fù)審日期： 年 月 日 復(fù)審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準(zhǔn)日期： 年

2、 月 日 文件分發(fā)部門和或個(gè)人 院檔案室保管者： 檢驗(yàn)科 主任： 檢驗(yàn)科 實(shí)驗(yàn)室： 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞表面抗原分布如下：T淋巴細(xì)胞：CD3+；B淋巴細(xì)胞：CD3-，CDl9+；輔助性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細(xì)胞：CD3+CD8+；NK細(xì)胞：CD3-CDl6+56+等。根據(jù)淋巴細(xì)

3、胞膜上CD分子表達(dá)的不同，流式細(xì)胞儀可以分辨出淋巴細(xì)胞及其各種不同的亞群，利用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算出淋巴細(xì)胞亞群的百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count組會(huì)自動(dòng)得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：

4、單克隆抗體 液體 28 (CD45/4/8/3 CD45/56/19/3 CD4/8/3 同型對(duì)照IgG1/IgG1/IgG1 CD3/19 M1293 CD3/16+56 CD19-PC5 643Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(

5、No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出

6、液體）5)上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）6)需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)的指標(biāo)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count(務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機(jī)) 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值(百分?jǐn)?shù)（絕對(duì)值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) 臨床意義1.T、B淋巴細(xì)胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢測(cè)指標(biāo)，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免

7、疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床診斷、病情判斷、治療等價(jià)值。臨床常用ThTs比值來(lái)判斷病人的免疫狀況。ThTs比值升高：表示免疫功能亢進(jìn)：見于自身免疫性疾病，如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無(wú)力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝和活動(dòng)性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細(xì)胞減少患者。2：NK細(xì)胞主要破壞各種腫瘤細(xì)胞和感染某些病毒、細(xì)菌的細(xì)胞，所以在抗腫瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、應(yīng)用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長(zhǎng)而減退

8、。NK細(xì)胞也參與第二型超敏反應(yīng)和移植物抗宿反應(yīng)，白介素-2治療后；外周血NK細(xì)胞增加。方案（Protocol）1.選參數(shù)點(diǎn)擊點(diǎn)擊4色3色點(diǎn)擊（命名，點(diǎn)擊save） 結(jié)果 此圖為CD45圈門如果做絕對(duì)計(jì)數(shù)，則填寫Flow-Count的濃度選中cell/ul即可活化淋巴細(xì)胞亞群、記憶T及純真T的測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到相應(yīng)各亞群的百分?jǐn)?shù)。活化淋巴細(xì)胞表面抗原為CD3+/CD25+和CD3+/H

9、LA-DR+。CD3+/CD45RO+是記憶型T細(xì)胞。CD3+/CD45RA+是純真型T細(xì)胞。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295

10、 CD25-PC5 646 CD3-FITC 281 CD45RA-PE 834 CD45RO-PE 307 CD4-PC5 636 ） 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPI

11、CS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機(jī)測(cè)樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<

12、2 參考值(百分?jǐn)?shù)) CD3+/HLA-DR+ 3.1±1.3% CD3+/CD25+ 15.9±3.7% CD3+/CD45RO+ 3.3±1.55% CD3+/CD45RA+/CD4+ 20.51±3.64% 臨床意義1.HLA-DR、CD25、CD69是T細(xì)胞活化各個(gè)時(shí)期表達(dá)的標(biāo)志性抗原，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)可以判斷出疾病的進(jìn)程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預(yù)后和治療。如活化狀態(tài)的監(jiān)測(cè)是對(duì)機(jī)體移植免疫狀況判斷的最主要依據(jù)，有助于臨床選擇治療方案，CD25+/CD3+ >5-10%提示排斥、持續(xù)增加提示應(yīng)作病理活檢；CD3+/HLA-DR+增加5-10%

13、但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機(jī)體內(nèi)各種T細(xì)胞之間以及與其他免疫細(xì)胞之間在數(shù)量上保持一定比例，如果它們之間比例失調(diào)就會(huì)引起免疫功能紊亂，將導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測(cè)淋巴細(xì)胞各種亞群有助于疾病的診斷、預(yù)后和治療。CD45RA、CD45RO均為T細(xì)胞的輔助分子，CD45RA+純真型T細(xì)胞當(dāng)免疫力下降時(shí)減少；CD45RO+記憶型T細(xì)胞對(duì)第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中減少。方案（Protocol）同淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Result）HLA-B27測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原

14、理： 雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE單克隆抗體加入到全血中，與白細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗體結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，測(cè)定HLA-B7陰性而HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度和所占的百分比。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0&#

15、215;109/L，應(yīng)分離單個(gè)核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 1ML 28 (HLA-B27/HLA-B7 同型對(duì)照IgG1IgG) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 Beck

16、manCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對(duì)照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)洗、離心、上機(jī)測(cè)樣（備注： 測(cè)B27一定要至

17、少洗一遍方可上機(jī)檢測(cè)）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告陰陽(yáng)性操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值 陽(yáng)性：HLA-B27陽(yáng)性而HLA-B7陰性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度在5.0以上，陽(yáng)性率>90%。 臨床意義HLA復(fù)合體位于第6號(hào)染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長(zhǎng)度約3000-4000KB，占人體整個(gè)基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I類基因中B位點(diǎn)上的一個(gè)等位基因，與多種疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎。HLA-B27基因?qū)儆谛蚆HC基因，所有有核細(xì)胞上均有表達(dá)，尤其是淋巴細(xì)胞表面含量豐富，人們發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度的相關(guān)性，超過(guò)90%的強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA-B

18、27抗原表達(dá)陽(yáng)性，而正常人群中僅5-10%的認(rèn)為陽(yáng)性。由于強(qiáng)直性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測(cè)在疾病的診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測(cè)是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個(gè)重要指標(biāo)。方案（Protocol）點(diǎn)擊點(diǎn)擊 鍵入文件名，點(diǎn)擊Save 結(jié)果1. positive (+) 2. negative(-) X-Mean=1.2 X-Mean=5.8CD55/CD59測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細(xì)胞和白細(xì)胞膜上CD55和CD59分子的表達(dá)量和缺乏表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量對(duì)PNH診斷和鑒別

19、有重要意義。血細(xì)胞(紅細(xì)胞和白細(xì)胞)通過(guò)膜上的抗原分子與熒光素標(biāo)記的CD55或CD59的多克隆抗體結(jié)合。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD55或CD59表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 1ML 28 (CD59-FITC CD55-PE ) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體

20、 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備:(一)白細(xì)胞CD55CD59檢測(cè)1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記。分別向二管中加入樣品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35S

21、EC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）3離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。避光20-30分鐘。4洗滌離心 5上機(jī)測(cè)樣(二)紅細(xì)胞CD55CD59檢測(cè) 1準(zhǔn)備2支流式細(xì)胞儀專用管，分別標(biāo)記 2分別加入CD55CD59 10ul和相應(yīng)的同型對(duì)照10ul。 3向二管中加入1：200稀釋的樣品100ul（可根據(jù)紅細(xì)胞的數(shù)量調(diào)整），避光20-30分鐘。 4洗滌離心。5混勻、上機(jī)測(cè)樣。 報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值 CD

22、55>97% CD59>97% PNH的臨界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的診斷值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒細(xì)胞CD59>84% 臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時(shí)CD55和CD59明顯減低和缺如。方案（Protocol）(同HLA-B27) 結(jié)果1.RBC: normal 2.RBC: abnormal 干細(xì)胞檢測(cè)和絕對(duì)計(jì)數(shù)方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原結(jié)合，

23、經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)，加入Flow-Count即可得出絕對(duì)計(jì)數(shù)。標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD34 No. I

24、M1871 CD45-PC553/IM2652Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣

25、本制備： 1)按照要求，分別向已編好號(hào)的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對(duì)照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）5)需要做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)，在相應(yīng)管中加入與血樣等量的Flow-Count(務(wù)必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機(jī))6)上機(jī)

26、測(cè)樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)（和絕對(duì)值）操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值(百分?jǐn)?shù)（絕對(duì)值）) CD34+/CD45+ 0.58±0.29% 臨床意義目前把CD34作為造血干細(xì)胞的主要標(biāo)志，CD34陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)作為造血干細(xì)胞水平定量的檢測(cè)方法。方案（Protocol）同淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（Result） 白血病免疫分型測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。熒光素標(biāo)記的各種單克隆抗體加入到全血中，與細(xì)胞膜上或膜內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合，經(jīng)過(guò)溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，從而得到百分?jǐn)?shù)。標(biāo)本采集與處理

27、 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 骨髓采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝 要求 1樣本量1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍或溶血的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個(gè)核細(xì)胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：?jiǎn)慰寺】贵w 液體 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC553/IM2652Flow-Count熒光微球 ) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.754

28、6946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-樣本制備： 細(xì)胞膜表面抗原1首先準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3然后，按管上的標(biāo)記，加入相

29、應(yīng)抗體各10ul(注意：必須是FITC和PE標(biāo)記的抗體搭配)4各管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)30100u1(根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定)，振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5溶血：a. OptiLyse C(按說(shuō)明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機(jī)-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關(guān)門-自動(dòng)進(jìn)行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。（*溶血前確認(rèn)A/B/C管路充滿并能打出液體）細(xì)胞漿和核抗原1準(zhǔn)備所需的管，并在管上標(biāo)記上欲加入的抗體，其中一管是同型對(duì)照。2首先每管中加入標(biāo)本(骨髓或外周血)100ul(根據(jù)細(xì)胞的多少?zèng)Q定)，5ul

30、CD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3每管中加入固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4各管中加入PBS4ml。5300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分鐘。 7加抗體，陰性對(duì)照管中加入10ul，其余各管加入相應(yīng)抗體各10ul，室溫避光15分鐘。8各管中加入4mlPBS，振蕩混勻。9300g離心5分鐘后，棄去上清液。10各管中加入PBS500ul，振蕩混勻。11上機(jī)測(cè)樣報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值 CD34+<5% MPO+<5% 粒系

31、<20% 淋系<30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案（Protocol）T細(xì)胞亞群細(xì)胞內(nèi)因子IFN-/IL-4檢測(cè)方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培養(yǎng)(輔助性T細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子IFN-、IL-4的產(chǎn)生分為Thl、Th2兩個(gè)亞群。淋巴細(xì)胞活化以后才分泌細(xì)胞因子，且迅速分泌到細(xì)胞外。因此，利用刺激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細(xì)胞，然后用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monensin阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，使細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)滯留到一定的量)，然后進(jìn)行細(xì)胞膜表面

32、抗原和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)CD4+細(xì)胞內(nèi)的IFN-和IL-4進(jìn)行測(cè)定。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)處理，冷凍的標(biāo)本不能用。 3樣本白細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應(yīng)分離單個(gè)核 細(xì)胞。 4溶血樣本不能用。試劑 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系(自配) 成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國(guó)SIGMA公司

33、。 單克隆抗體 ( BeckmanCoulter公司) CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-FITC(No.IM2716)。 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 細(xì)胞培養(yǎng)與染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMIl640洗滌一次，將細(xì)胞加入培養(yǎng)體系中，5C02 37孵育18小時(shí)，取出后以PBS洗

34、一次。用專用細(xì)胞內(nèi)因子試劑進(jìn)行細(xì)胞固定、透膜。將細(xì)胞分成兩管，其一為測(cè)定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型對(duì)照，室溫避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測(cè)。流式細(xì)胞儀測(cè)定 打開流式細(xì)胞儀及氬激光光源(488nm)預(yù)熱20min，同時(shí)儀器自動(dòng)初始化；用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測(cè)標(biāo)本，每份標(biāo)本檢測(cè)50000以上細(xì)胞，在前向散射光(FS)和測(cè)向散射光(SSC)散點(diǎn)圖中圈定淋巴細(xì)胞群，然后分析CD4陽(yáng)性細(xì)胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表達(dá)。 淋巴細(xì)胞在FSSSC散點(diǎn)圖中位置，即A門內(nèi)細(xì)胞； A門內(nèi)CD4陽(yáng)性細(xì)胞，即B門內(nèi)細(xì)胞； B門內(nèi)TH細(xì)胞亞群分布：

35、 1區(qū)數(shù)值-Th 1細(xì)胞 (%) 4區(qū)數(shù)值-Th 2細(xì)胞 (%) 2區(qū)數(shù)值-Th 0細(xì)胞 (%)報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 正常參考值 Thl(IFN-)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44% ThO ：0.51±0.26% 臨床意義淋巴細(xì)胞均分泌多種細(xì)胞因子：Thl細(xì)胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-為Thl最特異分泌的細(xì)胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細(xì)胞因子，所以可根據(jù)分泌的細(xì)胞因子來(lái)區(qū)分Thl與Th2。Thl為I

36、FN-+，Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的Thl和Th2細(xì)胞，這時(shí)我們所能檢測(cè)的胞內(nèi)的IFN-和IL-4也微乎其微。當(dāng)Th細(xì)胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中Th0即會(huì)向Thl或Th2大量分化，此時(shí)我們檢測(cè)到的IFN-和IL-4也較多。本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)實(shí)際上是檢測(cè)Th細(xì)胞對(duì)刺激素刺激的反應(yīng)能力。方案（Protocol） 細(xì)胞周期分析方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等) 與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細(xì)胞在激光

37、照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量標(biāo)本采集與處理 檢測(cè)對(duì)象 實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細(xì)胞 要求 1實(shí)體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細(xì)胞如果不能立即做應(yīng)用冷乙醇固定，20可保存23個(gè)月，70可保存半年以上。 2樣本計(jì)數(shù)應(yīng)在1.0×106/ml 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：DNA-Prep試劑系統(tǒng) 液體 28） （包括DNA-Prep LPR和 DNA-Prep 染料） 2：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 3：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 4：熒光微

38、球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 灌洗液或培養(yǎng)細(xì)胞1 PBS洗，稀釋為1.0×106/ml，取100ul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室溫避光15分鐘。2 過(guò)300目濾網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)體（腫瘤）組織1 單細(xì)胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。將平皿中的混懸

39、液用300目銅網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞懸液，以500800轉(zhuǎn)離心沉淀2分鐘。2 染色：同上3 上機(jī)檢測(cè)石蠟塊1 脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，35片，放入二甲苯中室溫放置24小時(shí)，更換二甲苯室溫再置24小時(shí)。取出加無(wú)水乙醇10分鐘，依次加95乙醇、70乙醇、50乙醇及雙蒸水各10分鐘。2 單細(xì)胞懸液制備及染色：同上3 上機(jī)檢測(cè)報(bào)告結(jié)果 報(bào)告各期的百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值 臨床意義DNA倍體分析用于腫瘤早期診斷、良惡性腫瘤判斷、腫瘤預(yù)后、治療方案的選擇，正常組織和良性腫瘤DNA均為二倍體，惡性腫瘤時(shí)則出現(xiàn)異倍體。方案（Protocol） 選擇Cytomet

40、er Control點(diǎn)擊Parameters后 結(jié)果（Result）血小板膜表面抗體測(cè)定方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 間接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到經(jīng)離心富集的血小板中，與血小板膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌（和固定）等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備 檢查對(duì)象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量2ml。 2樣本應(yīng)在采集后6小時(shí)內(nèi)完成，冷凍的標(biāo)本或已固定的標(biāo)本不能用。 3樣本血小板計(jì)數(shù)應(yīng)在150-450×109/L之間。若>45

41、0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<150×109/L，應(yīng)多采集進(jìn)行富集達(dá)到流式檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)。 4溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫(kù)爾特成分 1：一抗 凍干 -20小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285) 二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)凍干 1mg -20 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液

42、體 10ML 2-8 質(zhì)控品 BEKAMANCOULTER產(chǎn)品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準(zhǔn)一次：遇特殊情況隨時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,棄上清，重復(fù)一次。3) 分別向試管中加入準(zhǔn)備好的10u1含血小板的PBS（血小板的量約為106）（血小板若在正常范圍，稀釋到原量直接取10u1。）。4) 分別向已編好號(hào)的試管中依次加入一抗和二抗（設(shè)對(duì)照）5)混勻，避光，室溫孵育

43、20-30分鐘6)洗或不洗，上機(jī)測(cè)樣全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,棄上清，后同上3）6）報(bào)告結(jié)果 報(bào)告百分?jǐn)?shù)操作性能 精密度 批內(nèi)五次重復(fù)CV<2 參考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 臨床意義為免疫性血小板減少性紫癜(ITP)診斷、治療、預(yù)后估計(jì)的重要指標(biāo)，在ITP、膠原性疾病時(shí)升高。方案（Protocol） 紅細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定（紅細(xì)胞抗體）方法 流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫(kù)爾特)原理： 直接免疫熒光法。FITC標(biāo)記的各型多克隆抗體，加到全血中，與紅細(xì)胞膜上的相應(yīng)的IgG-Fc片段結(jié)合，經(jīng)過(guò)洗滌(和固定)等步驟后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。 標(biāo)本采集與處理 受檢者的準(zhǔn)備