動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用ppt課件

1、1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用2表表1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等動(dòng)物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑-細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素、巨噬細(xì)胞毒力因子等酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P、450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長(zhǎng)激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等3表2 微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的

2、比較微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進(jìn)氣氧濃度改變進(jìn)入氣體的氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過(guò)濾培養(yǎng)時(shí)間幾小時(shí)幾天幾天3、4周對(duì)水純度的要求較低很高與微生物細(xì)胞培養(yǎng)類似，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼壁依賴與微生物細(xì)胞培養(yǎng)類似，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼壁依賴性細(xì)胞，這類細(xì)胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類是貼壁性細(xì)胞，這類細(xì)胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類是貼壁依賴性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)。依賴性細(xì)胞，它

3、們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長(zhǎng)。 45、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程如圖大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程如圖11-15所示。工藝過(guò)程中，先將組織切成所示。工藝過(guò)程中，先將組織切成碎片，然后用溶解蛋白質(zhì)的酶處理而得到單個(gè)細(xì)胞，再用離心法收集細(xì)胞。將細(xì)碎片，然后用溶解蛋白質(zhì)的酶處理而得到單個(gè)細(xì)胞，再用離心法收集細(xì)胞。將細(xì)胞植入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細(xì)胞從瓶壁胞植入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖到覆蓋瓶壁表面，用酶把細(xì)胞從瓶壁上消化下來(lái)，再接種到若干培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得的細(xì)胞上消化下來(lái)，再接種到

4、若干培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得的細(xì)胞“種子種子”冷藏于液氮中，從液氮中取出一部分細(xì)胞冷藏于液氮中，從液氮中取出一部分細(xì)胞“種子種子”進(jìn)行解凍、復(fù)活培養(yǎng)，進(jìn)行擴(kuò)進(jìn)行解凍、復(fù)活培養(yǎng)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以獲得足夠的細(xì)胞量，將細(xì)胞接種于大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，大培養(yǎng)以獲得足夠的細(xì)胞量，將細(xì)胞接種于大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，按照產(chǎn)物的不同形式進(jìn)行產(chǎn)物分離純化。對(duì)于積累在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物，可通過(guò)收集按照產(chǎn)物的不同形式進(jìn)行產(chǎn)物分離純化。對(duì)于積累在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)物，可通過(guò)收集細(xì)胞后進(jìn)行破胞，再經(jīng)過(guò)分離純化獲得產(chǎn)物；對(duì)于由細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中產(chǎn)物，細(xì)胞后進(jìn)行破胞，再經(jīng)過(guò)分離純化獲得產(chǎn)物；對(duì)于由細(xì)胞分泌到

5、培養(yǎng)液中產(chǎn)物，可以通過(guò)濃縮、純化培養(yǎng)液來(lái)獲得產(chǎn)品；而對(duì)于那些必須加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)或可以通過(guò)濃縮、純化培養(yǎng)液來(lái)獲得產(chǎn)品；而對(duì)于那些必須加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng)或病毒感染培養(yǎng)才能得到的產(chǎn)物的細(xì)胞，可加入上述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)或病毒感染后，收病毒感染培養(yǎng)才能得到的產(chǎn)物的細(xì)胞，可加入上述誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)或病毒感染后，收集細(xì)胞，再經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物。集細(xì)胞，再經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物。5圖圖11-15 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程圖細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器提取提取細(xì)胞細(xì)胞誘生劑誘生劑細(xì)胞細(xì)胞產(chǎn)品（腫瘤抗原）產(chǎn)品（腫瘤抗原）純化純化產(chǎn)品（干擾素）產(chǎn)品（干擾素）純化純化提取提取產(chǎn)品（單克隆抗體）產(chǎn)品（

6、單克隆抗體）濃縮純化濃縮純化798654321106內(nèi)容（一）內(nèi)容（一）單克隆抗體單克隆抗體哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來(lái)物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白，就是抗體；相對(duì)于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來(lái)物質(zhì)即稱為抗原?？贵w最早是由德國(guó)微生物學(xué)家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動(dòng)物的血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結(jié)合特異性，可以識(shí)別各種不同的抗原，還可以激活細(xì)胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原，因此抗體在基礎(chǔ)研究和

7、臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應(yīng)用。隨著雜交瘤技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。7抗體抗體由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識(shí)別抗原的某一特定位點(diǎn)?？贵w分子由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全相同的輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動(dòng)物的血清之中?？乖乖刚T導(dǎo)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個(gè)重要組分，因?yàn)榭贵w分子可以識(shí)別各種不同的外來(lái)抗原，同時(shí)可激活宿主的防衛(wèi)系統(tǒng)。對(duì)于一個(gè)免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個(gè)淋巴細(xì)胞都會(huì)合成并分泌一種單個(gè)的抗體，這些抗體可以高度特異地識(shí)別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定

8、簇。由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)不同的抗原決定簇，因此每個(gè)免疫淋巴細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對(duì)某一個(gè)抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原侵入抗體2抗體18于是，人們認(rèn)識(shí)到要把抗體應(yīng)用于臨床診斷或是治療，必須要制備單一類型的只對(duì)某一特定抗原決定簇的抗體分子，也就是單克隆抗體。多克隆抗體多克隆抗體在一個(gè)血清樣品中包含了對(duì)同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。單克隆抗體單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的針對(duì)某一特定抗原決定簇的單一類型的抗體。9補(bǔ)充 要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細(xì)胞系糖代謝特點(diǎn)，氨基酸代謝特點(diǎn)，選要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細(xì)胞系糖

9、代謝特點(diǎn)，氨基酸代謝特點(diǎn)，選擇適宜的細(xì)胞系。擇適宜的細(xì)胞系。10細(xì)胞系細(xì)胞系Fuc Gal唾液酸唾液酸1,6 1 , 3 Fuc1,3GalS O4-GalNAc 2 ,3 2,6糖糖基基化化等分等分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+0鼠雜交瘤鼠雜交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴細(xì)胞人淋巴細(xì)胞+000+0+人垂體人垂體+00+0+Namalwa+000+-人鼠雜交瘤人鼠雜交瘤+000+011動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征 昆蟲系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，最成功、重要表達(dá)活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞

10、系統(tǒng)，最成功、重要表達(dá)活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)。藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)。 一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征1. 動(dòng)物細(xì)胞的特征動(dòng)物細(xì)胞的特征 細(xì)胞膜、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，沒(méi)有細(xì)胞壁。亞細(xì)胞器，功能獨(dú)特。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，沒(méi)有細(xì)胞壁。亞細(xì)胞器，功能獨(dú)特。內(nèi)容（二）內(nèi)容（二）122哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系CHO細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞系，貼壁型生長(zhǎng)，是目前使用最為普遍和細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞系，貼壁型生長(zhǎng)，是目前使用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞。核型為亞二倍體，分泌表達(dá)外源蛋白，而內(nèi)源蛋成熟的表達(dá)糖基化

11、蛋白藥物的宿主細(xì)胞。核型為亞二倍體，分泌表達(dá)外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少。貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞，但可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。白分泌很少。貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞，但可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然。蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然。有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時(shí)需要添加脯氨酸。二氫葉酸還原酶缺陷株表有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時(shí)需要添加脯氨酸。二氫葉酸還原酶缺陷株表達(dá)的藥物有達(dá)的藥物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子、凝血因子、DN

12、A酶酶，已上市。，已上市。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平。13BHK21：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。用于增殖病毒、制備疫苗和：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。重組蛋白。BHK-21表達(dá)的重組凝血因子表達(dá)的重組凝血因子已被獲準(zhǔn)上市。已被獲準(zhǔn)上市。C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長(zhǎng)。：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長(zhǎng)。C127細(xì)胞系已表達(dá)多種細(xì)胞系已表達(dá)多種外源基因，其中外源基因，其中EPO的水平達(dá)的水平達(dá)10 mg

13、/L，生產(chǎn)，生產(chǎn)rhGH已被批準(zhǔn)上市。已被批準(zhǔn)上市。3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究。用于藥物毒理學(xué)研究。骨髓瘤細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞：J558LJ558L是小鼠是小鼠BALB/cBALB/c骨髓瘤細(xì)胞，分泌骨髓瘤細(xì)胞，分泌IgAIgA，用于轉(zhuǎn)染研究。，用于轉(zhuǎn)染研究。NSONSO和和SP2/OSP2/OAg14Ag14不分泌不分泌IgIg，與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體。，與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體。14雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓

14、瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交瘤細(xì)胞系，能在無(wú)血雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交瘤細(xì)胞系，能在無(wú)血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長(zhǎng)，容易轉(zhuǎn)染和生長(zhǎng)，能進(jìn)行糖基化等加工修飾，大量分泌和高清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長(zhǎng)，容易轉(zhuǎn)染和生長(zhǎng)，能進(jìn)行糖基化等加工修飾，大量分泌和高效表達(dá)。很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體的制備。效表達(dá)。很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體的制備。VeroVero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細(xì)胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細(xì)胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。已有突變細(xì)胞系能用無(wú)血清培養(yǎng)。最為常用進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。已有

15、突變細(xì)胞系能用無(wú)血清培養(yǎng)。最為常用Vero E6Vero E6增殖多種病毒，如脊增殖多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測(cè)。的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測(cè)。COSCOS：是從：是從SV40 DNASV40 DNA轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞CV1CV1中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時(shí)表中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時(shí)表達(dá)的研究。達(dá)的研究。GH3GH3用于生長(zhǎng)激素研究，用于生長(zhǎng)

16、激素研究，293293細(xì)胞系用于基因治療的研究。細(xì)胞系用于基因治療的研究。 153昆蟲細(xì)胞株系昆蟲細(xì)胞株系Sf21：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。：從秋粘蟲卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因。Sf9：從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞（：從秋粘蟲的卵巢細(xì)胞（SF21）中分離得到，是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞。對(duì)桿狀?。┲蟹蛛x得到，是最常用的昆蟲表達(dá)細(xì)胞。對(duì)桿狀病毒高度敏感，生長(zhǎng)快，能高效表達(dá)外源基因?？箼C(jī)械剪切，能在無(wú)血清培養(yǎng)基的攪拌反毒高度敏感，生長(zhǎng)快，能高效表達(dá)外源基因。抗機(jī)械剪切，能在無(wú)血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長(zhǎng)。應(yīng)器中生長(zhǎng)。TN-5B1-4：從粉紋

17、夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到，無(wú)血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達(dá)重組：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到，無(wú)血清培養(yǎng)，快速倍增。分泌表達(dá)重組蛋白的能力比蛋白的能力比Sf9細(xì)胞系高細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。16三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)通用名稱?；?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多，轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)通用名稱?；?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多，主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。方法方法表達(dá)類型表達(dá)類型毒性毒性細(xì)胞類型細(xì)胞類型特點(diǎn)特點(diǎn)基因槍基因槍瞬 時(shí) ， 穩(wěn)瞬 時(shí) ， 穩(wěn)定定無(wú)無(wú)多種細(xì)

18、胞組織，多種細(xì)胞組織，器官器官有效，儀器操作有效，儀器操作顯微注射顯微注射瞬 時(shí) ， 穩(wěn)瞬 時(shí) ， 穩(wěn)定定無(wú)無(wú)多種細(xì)胞多種細(xì)胞有效，技術(shù)難度有效，技術(shù)難度大大電穿孔電穿孔瞬 時(shí) ， 穩(wěn)瞬 時(shí) ， 穩(wěn)定定無(wú)無(wú)多種細(xì)胞多種細(xì)胞有效，儀器操作有效，儀器操作沖擊波沖擊波瞬 時(shí) ， 穩(wěn)瞬 時(shí) ， 穩(wěn)定定無(wú)無(wú)多種細(xì)胞，局部多種細(xì)胞，局部組織組織簡(jiǎn)單有效，儀器簡(jiǎn)單有效，儀器操作操作17方法方法表達(dá)類型表達(dá)類型毒性毒性細(xì)胞類型細(xì)胞類型特點(diǎn)特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)，穩(wěn)瞬時(shí)，穩(wěn)定定無(wú)無(wú)對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞胞有效有效原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合瞬時(shí)，穩(wěn)瞬時(shí)，穩(wěn)定定無(wú)無(wú)懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞技術(shù)復(fù)雜技術(shù)復(fù)雜生物轉(zhuǎn)染特

19、點(diǎn)生物轉(zhuǎn)染特點(diǎn)18化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖（）葡聚糖（dextran）和陽(yáng)離子樹脂與核酸）和陽(yáng)離子樹脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。磷酸鈣與磷酸鈣與DNA形成不溶性沉淀，帶正電荷的形成不溶性沉淀，帶正電荷的DEAE葡聚糖與帶負(fù)電荷的葡聚糖與帶負(fù)電荷的DNA磷酸基團(tuán)磷酸基團(tuán)結(jié)合，陽(yáng)離子樹脂包裹結(jié)合，陽(yáng)離子樹脂包裹DNA形成脂質(zhì)體。形成脂質(zhì)體。滲透性休克和滲透性休克和DMSO等化學(xué)試劑能促進(jìn)等化學(xué)試劑

20、能促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特別是進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑。影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、DNA的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時(shí)間、的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時(shí)間、促進(jìn)劑的使用等。促進(jìn)劑的使用等。19方法方法表達(dá)類型表達(dá)類型毒性毒性細(xì)胞類型細(xì)胞類型特點(diǎn)特點(diǎn)磷酸鈣磷酸鈣瞬 時(shí) 、 穩(wěn)瞬 時(shí) 、 穩(wěn)定定無(wú)無(wú)貼壁細(xì)胞，懸浮貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞細(xì)胞簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單DEAE-葡聚糖葡聚糖瞬時(shí)瞬時(shí)有有CV1，COS簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單陽(yáng)離子樹脂陽(yáng)離子樹脂瞬 時(shí) 、 穩(wěn)瞬 時(shí) 、 穩(wěn)定定有或無(wú)有或無(wú)貼壁、原代

21、懸浮貼壁、原代懸浮細(xì)胞細(xì)胞簡(jiǎn)單，有效簡(jiǎn)單，有效化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)20四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染后16天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測(cè)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測(cè)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)。為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2448小時(shí)，讓細(xì)胞倍增小時(shí)，讓細(xì)胞倍增12代，使轉(zhuǎn)染代，使轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)。再按表達(dá)。再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每24天更換培養(yǎng)基，天更換培養(yǎng)基，持續(xù)持續(xù)23周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，清除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨(dú)立的克隆。周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，清除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨(dú)立的克隆。在轉(zhuǎn)染中大約有萬(wàn)分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整