D二聚體檢測(cè)的方法及其臨床應(yīng)用

1、d-二聚體檢測(cè)的方法及其臨床應(yīng)用上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)系胡翊群 王鴻利    d-二聚體（d-dimer,d-d）是交朕纖維蛋白（fb）特異的降解產(chǎn)物，它的生成或增高反映了凝血和纖溶系統(tǒng)的激活。在全血或血漿中，采用針對(duì)d-d的抗體可以很容易地檢測(cè)d-d含量。近10年來(lái)，已建立了多種有價(jià)值的d-d的檢測(cè)方法。早在80年代末90年代初期，人們發(fā)現(xiàn)d-d對(duì)臨床上疑診為靜脈血栓形成（venous thrombo-embolism，vte）的患者高度敏感，但不特異。在這些患者中，當(dāng)血漿d-d濃度低于：某一臨界值（通常為500g/l）時(shí)，其陰性預(yù)測(cè)值大于90%，

2、由此可以作為排除vte的篩選試驗(yàn)。近年來(lái)，隨著方法學(xué)的不斷進(jìn)步，建立多種適用于急診的簡(jiǎn)單快速的敏感方法，d-d檢測(cè)的臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛。大量研究已經(jīng)亢分證實(shí)了d-d在排除診斷下肢深靜脈血栓形成（deepvein thromboembolism，dvt）和肺栓塞（pulmonary embolism，pe）中的應(yīng)用價(jià)值，已將其作為首選篩選指標(biāo)之一。最近，d-d檢測(cè)的應(yīng)用巳深入到彌散性血管內(nèi)凝血（dlc）、心血管疾病、激素替代治療、惡性腫瘤以及抗凝治療領(lǐng)域。一、d-d的生成    在各種病理和生理狀態(tài)下，凝血系統(tǒng)的激活導(dǎo)致fb的生成，而fb的生成又可激活纖溶系統(tǒng)，引起

3、纖溶酶（plasmin，pl）的生成和fb的降解。在交聯(lián)fb的降解過(guò)程中，生成了一系列的特異降解產(chǎn)物，其中包括d-d（d-dimer）（圖1a，1b）。    凝血系統(tǒng)的激活導(dǎo)致凝血酶生成，凝血酶結(jié)合于纖維蛋白原的中央結(jié)構(gòu)域，釋放纖維蛋白肽a（fpa）和纖維蛋白肽b（fpb），生成纖維蛋白單體和多聚體。在活化fxiii的作用下，生成交聯(lián)的纖維蛋白。纖溶酶降解交聯(lián)纖維蛋白，生成多種交聯(lián)的纖維蛋白降解產(chǎn)物（fbdps），其中包括d-d和其它的片段。二、d-d的檢測(cè)方法    d-d的檢測(cè)方法有多種，主要是基于膠乳凝集原理的定性或半定量試驗(yàn)

4、以及基于elisa原理的定量測(cè)定，也有些方法采用免疫濁度原理或免疫熒光原理。膠乳法靈敏度較低，而經(jīng)典elisa法操作費(fèi)時(shí)，都不適合急診使用?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了數(shù)種快速的、叮檢測(cè)單份標(biāo)本的高靈敏度檢測(cè)方法。其中應(yīng)用最廣泛、得到臨床研究認(rèn)可的快速檢測(cè)方法主要有兩種：一種是在全血小進(jìn)行的，只需2分鐘就可得到定性結(jié)果的試驗(yàn)（自身紅細(xì)胞凝集，simplired, agen；金標(biāo)法simplify，agen）；另一種是快速elisa（vidasd-d，biomerieux）。兩種快速d-d檢測(cè)方法與經(jīng)典檢測(cè)方法的比較見(jiàn)表1。其他一些快速檢測(cè)法，無(wú)論是基于elisa原理或是膠乳凝集原理，在推薦用于診斷可疑vte

5、或其他血栓性疾病前，應(yīng)進(jìn)行全面的臨床應(yīng)用評(píng)估。    對(duì)于用于排除診斷vte的d-d檢測(cè)方法而言，下列幾個(gè)指標(biāo)非常重要：敏感性；特異性；陰性預(yù)測(cè)值（npv）：即當(dāng)d-d水平低于臨界值或?yàn)殛幮詴r(shí)，患者確實(shí)不患vte的可能性；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（ppv）：即當(dāng)d-d水平高于臨界值或?yàn)殛?yáng)性時(shí)，患者患vte的可能性。其中d-d檢測(cè)方法對(duì)vte的敏感性和npv是評(píng)價(jià)該方法至關(guān)重要的指標(biāo)。以下簡(jiǎn)要介紹幾種常用方法的原理和檢測(cè)特性，比較各種方法的性能，并就目前在d-d檢測(cè)方法學(xué)上的局限性作一分析。表1 經(jīng)典與新型快速d-d檢測(cè)方法的比較    單份標(biāo)本檢測(cè) 快速 定

6、量 敏感性 特異性 膠乳法 纖典血漿膠乳法（classical late） + + - - +   全血膠乳法（simplired/simplify） + + - - + elisa 經(jīng)典elisa - - + + -   快速elisa法（vidas d-d） + + + + - （一） 膠乳凝集法    1simplired（agen diagnostics limited，australia）是目前應(yīng)用最廣泛，性能也得到公認(rèn)的自身紅細(xì)胞凝集d-d檢測(cè)方法。采用分別針對(duì)d-d和纖細(xì)胞上表位的雙抗體，當(dāng)血中d-d水平升高時(shí)，抗原抗體結(jié)合的增多

7、而導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，2分鐘內(nèi)可以判斷結(jié)果，為半定量的白體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。其優(yōu)點(diǎn)是可在全血中檢測(cè)，省去了離心制備血漿的麻煩。對(duì)vte的敏感性和npv分別為81%-89%和90%-94%。如果僅對(duì)近端dvt而言，simplired的敏感性和npv叫更高些，特異性和ppv分別為48%和67%仍不失為一種有價(jià)值的篩選高危的近端dvt的方法。    2liatest定量試驗(yàn) 可在20分鐘內(nèi)完成。臨界值為500ng/ml時(shí)，其對(duì)vte的敏感性和npv分別為35%和96%。如果僅對(duì)近端dvt而言，其npv可達(dá)100%。 liatest 與經(jīng)典elisa法有很好的相關(guān)性（r=0.9

8、8）。（二） 快速elisa法    1vidas dd（biomerieux，france）是一種定量全自動(dòng)elisa法，在vidas免疫分析儀上進(jìn)行。它將兩步的免疫夾心法與最后的熒光檢測(cè)結(jié)合起來(lái)。利用現(xiàn)成的單劑量試劑和分析儀中儲(chǔ)存的校準(zhǔn)系統(tǒng)，對(duì)單份樣本進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)成試劑由包被了鼠抗d-d單抗的固相移液裝置和一試劑條組成，后者包含了其他所需試劑：結(jié)合劑（堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗d-d單抗）、洗滌劑、樣品稀釋劑和底物。將200ul血漿吸入試劑條后，所有步驟由分析儀完成。除需將血樣常規(guī)離心15分鐘外，結(jié)果可在35分鐘內(nèi)得到。結(jié)果以纖維蛋白原等價(jià)單位表示，其檢測(cè)上限為10

9、00ug/1，下限為50ug/l，低于正常參考值下限（68-494ug/l）。對(duì)dvt的敏感性和npv分別為96%99%和95%99%。vidas dd是目前研究最多的一種檢測(cè)方法，敏感性很高，與經(jīng)典elisa法有很好的一致性，最有希望取代經(jīng)典elisa法而成為dvt診斷的首選篩選試驗(yàn)。 2instant ia dd（stago，asnierefrance）定性方法，在多孔膜上進(jìn)行，利用免疫濾過(guò)裝置并采用兩種互補(bǔ)單抗，也可對(duì)d-d進(jìn)行半定量檢測(cè)。當(dāng)樣本中d-d水平高于500ng/ml時(shí)，將有顏色顯示，顏色的深淺與d-d水平成正比此時(shí)結(jié)果為陽(yáng)性。低于300ng/ml時(shí)無(wú)顏色產(chǎn)生，為陰性。在300

10、-500ng/ml 時(shí)，有一灰色帶顯現(xiàn)，結(jié)果為可疑。本試驗(yàn)可在10分鐘內(nèi)完成。敏感性和npv分別為78%-84%和86%-90%，敏感性低于vidasdd。因此，instant ia dd的應(yīng)用遠(yuǎn)不如vidas dd那樣廣泛，還需進(jìn)一步的臨床應(yīng)用研究對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)價(jià)。     3nycocard d-dimer nycomed本法在多孔薄膜上經(jīng)免疫過(guò)濾后，由單抗偶朕金抗體，后者的結(jié)合劑所產(chǎn)牛的紅色強(qiáng)度由nycocard顯示，強(qiáng)度與血漿中d-d水平（500-8000ng/ml）成比例，可定量檢測(cè)。幾分鐘內(nèi)即可完成。敏感性和npv在不同報(bào)道中差別較大，并且廠商和實(shí)驗(yàn)

11、室的結(jié)果存在較大的差異。可能的原因是被研究的人群不同，如門(mén)診患者以及近端dvt患者的比例等。然而，無(wú)論如何解釋，這種實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的不可重復(fù)性不可避免將影響其臨床應(yīng)用。 （三） 方法學(xué)的局限性    上述各種快速d-d檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，但遺憾的是各種方法也存在不同程度的缺點(diǎn)。對(duì)于基于膠乳凝集原理的快速檢測(cè)方法來(lái)講，敏感度低是其最大的缺點(diǎn)，且由于具結(jié)果判斷以陰性和陽(yáng)性表示，無(wú)法通過(guò)降低臨界值水平束提高敏感件。但是作為排除診斷試驗(yàn)，保證100%的敏感性是全關(guān)重要的。研究表明，若不能保證100%的敏感性，將會(huì)帶來(lái)偏差，并造成嚴(yán)重的后果：每降低2%的靈敏度，就會(huì)有1

12、/1000的可疑pe患者死亡。另外由于結(jié)果需肉眼觀察，不可避免地存在不同觀察者之間的差異。這些都是臨床醫(yī)師和患者有所顧慮的問(wèn)題。    對(duì)于快速elisa檢測(cè)方法而言，各種方法之間的標(biāo)準(zhǔn)化是一個(gè)難題?，F(xiàn)已有多種快速elisa法，每種又有多種商品化的試劑盒。這些試劑盒使用的抗體及其捕獲的相應(yīng)抗原不同標(biāo)本稀釋度、檢測(cè)限度和孵育時(shí)間等也互不相同。在151例臨床疑診為pe的患者中，全面比較了4種elisa檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)各種方法中位數(shù)的變異系數(shù)（cv）從3.5%到17%不等，但各種方法間的cv值卻相當(dāng)相近（15%-20%）。這種較差的重復(fù)性至少可以部分解釋各種elisa方法

13、間較小的相關(guān)性（回歸系數(shù)約為0.60）。再者，個(gè)同方法所得到參考值差別也相當(dāng)大，各種elisa 方法之間很難標(biāo)準(zhǔn)化。但從另方面考慮，由于各種方法識(shí)別血漿或全血中的不同成分，并且采用了不同的技術(shù)，其結(jié)果的異質(zhì)性是在預(yù)料之中的。所以，現(xiàn)在人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，與其要求一種不大可能實(shí)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)化，還不如對(duì)每種方法根據(jù)以下四點(diǎn)進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估，評(píng)估后制訂出各自的嚴(yán)格的臨界值。必要時(shí)，可通過(guò)降低臨界值而保證100%的敏感性。d-d檢測(cè)方法的四步評(píng)估包括：檢測(cè)方法所用的技術(shù)；與標(biāo)準(zhǔn)診斷方法作全面比較，確定新方法的嚴(yán)格臨界值（采用receiver operating characteristiccurre，roc曲

14、線分析）以及相應(yīng)的對(duì)確診vte的敏感性和特異性；“管理”實(shí)驗(yàn)，即d-d濃度低于臨界值的患者，停服抗凝劑，隨訪三個(gè)月以觀察其是否有遲后發(fā)病現(xiàn)象，由此判斷新方法的真正診斷價(jià)值；比較新方法的價(jià)-效比。三、dd檢測(cè)的臨床意義d-d的生成反映機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，在各種血栓形成性疾病以及牛理性高凝狀態(tài)時(shí)均有升高。特別是對(duì)vte高度敏感，在vte的排除診斷中具有重要價(jià)值。另外，d-d在心血管疾病、dic、惡性腫瘤等疾病叫，也有明顯變化，足反映疾病的嚴(yán)重程度、發(fā)展變化、以及療效和頂后的有用指標(biāo)。（一） 伴隨有d-d升高的疾病1深靜脈血栓形成（dvt）2肺栓塞（pe）3彌散性血管內(nèi)凝血（dic）4心血管疾

15、?。杭毙孕募」Ｋ?、不穩(wěn)定性心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈硬化、高血壓等5惡性腫瘤：乳腺癌、卵巢癌、急性臼血病等6手術(shù)、創(chuàng)傷后7溶栓治療后8腦血管疾病9嚴(yán)重感染、膿毒血癥、壞疽等10絕經(jīng)后激素替代治療、先兆子癇、妊娠11其他 甲減、慢性肝病等（二）d-d檢測(cè)的臨床意義    1d-d檢測(cè)用于排除dvt靜脈造影是最早應(yīng)用的診斷dvt的方法，現(xiàn)任仍是診斷dvt的金標(biāo)準(zhǔn)。但是靜脈造影價(jià)格昂貴，且具有侵襲性，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性，臨床醫(yī)牛和患者都不太愿意采用。另外許多基法醫(yī)療單位也沒(méi)有作靜脈造影的設(shè)備。日前應(yīng)用較多的是一些非侵襲性的診斷方法，如靜脈加壓超聲（cus）或：維掃描（

16、ds）。非侵襲性方法比靜脈造影傷害性小，也更為方便，但仍然比較昂貴，并且需要專門(mén)的技術(shù)人員操作。由于在非侵襲性方法診斷為陰性的患者中，約20%的患者在隨訪中發(fā)生vte，所以進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)系列檢測(cè)是必要的。但這不僅更增加了醫(yī)療費(fèi)用，也增加廠患者的焦慮，因?yàn)樗麄儫o(wú)法在5天內(nèi)得到明確的診斷結(jié)果。    由于d-d檢測(cè)安全簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、敏感性高。尤其是大量研究已經(jīng)證實(shí)了經(jīng)典elisa法對(duì)dvt的npv可達(dá)100%，各種新型的快速d-d檢測(cè)方法對(duì)dvt也高度敏感。表2總結(jié)了各種d-d檢棚方法診斷可疑dvt的特性?？梢钥闯?，如果采用d-d在人群小大規(guī)模篩選和排除dvt，叮

17、以極大地節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。閑為只行當(dāng)患者的d-d濃度高于臨界值時(shí)，才有必要采用更特異的超聲波檢查。 表2 d-d檢測(cè)診斷可疑dvt或pe的特點(diǎn)    回顧性的研究發(fā)現(xiàn)，在巳確診的82例dic患者中，fdf和d-d聯(lián)合的診斷效率最高，為95%；而d-d本身的診斷效率可達(dá)80%，與聯(lián)合fdp的方法相比，其敏感性沒(méi)有降低（均為91%），只是特異性有所下降（68%vs94%）。d-d的診斷效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pt或ppt、血小板計(jì)數(shù)、纖維蛋白原、tt等。因此，作者認(rèn)為，聯(lián)介d-d、fdp和抗凝血酶檢測(cè)是診斷dic的最好策略，因?yàn)閐-d和fdp可以提供快速、特異的診斷，而抗

18、凝血酶則有助于了解疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后，fdp因其快速，且比d-d便宜，可以用于診斷確立后的病情發(fā)展監(jiān)測(cè)。    此外，d-d也可在一定程度上反映dic的嚴(yán)重程度。dic患者的d-d水平高于dic前狀態(tài)（pre - dic）患者的水平，后者的水平高于正常人。    4d-d在心血管疾病的意義 d-d的升高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和嚴(yán)重程度有關(guān)，也可作為急性心肌梗死后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。    研究發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有心血管疾病癥狀的患者中，有頸動(dòng)脈損傷、且有高度血栓形成可能性患者的d-d明顯高于沒(méi)有頸動(dòng)脈損傷的患者，也高

19、于有頸動(dòng)脈損傷，但血栓形成的可能性比較低的患者。同樣，在有心血管疾病癥狀的患者，如高血壓患者中，d-d水平的升高也與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)，d-d水下的升高與血漿脂蛋白（a）水平成正比。多元回歸分析顯示，d-d和脂蛋白（a）都分別是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立影響因子。    另外，d-d檢測(cè)在急性心肌梗死后預(yù)測(cè)是否復(fù)發(fā)也有重要價(jià)值。心肌梗死后，如果患者的d-d水平持續(xù)偏高，復(fù)發(fā)的可能性比較大。但此預(yù)測(cè)價(jià)值存在性別差異，只有在男性患者中才有意義，其原因尚未明了。    5d-d在惡性腫瘤中的意義 惡性腫瘤患者大多伴有凝血和纖溶的異常，

20、血漿d-d往往升高，且與浸潤(rùn)密切相關(guān)。    在21例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，d-d的平均水平高達(dá)2mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同年齡和性別的正常對(duì)照組的平均水平（0.2mg/l）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，升高的d-d水平與單核細(xì)胞表面結(jié)合的活化蛋白c（apc）高度相關(guān)，卻與單核細(xì)胞組織因子（tf）的表達(dá)和凝血酶抗凝血酶復(fù)合物（tat）不相關(guān)，而后兩者的水平在所研究的腫瘤患者中并未明顯升高。這一結(jié)果反映了在這些患者中，發(fā)生了局部的凝血酶和纖維蛋白生成，而不是全身的凝血和纖溶的激活。    6d-d對(duì)術(shù)后抗凝治療的指導(dǎo)意義 研究表明，d-d水平可用以調(diào)整低相對(duì)分子質(zhì)

21、量肝素（lmwh）的用量，對(duì)234例創(chuàng)傷手術(shù)的患者進(jìn)行了抗凝預(yù)防治療。lmwh的基礎(chǔ)用量是28501 u/d，如果在術(shù)后第4天，患者的d-d水平高于2mg/l，將lmwh的用量增加每天兩次。在術(shù)后5-7天作彩色多普勒超聲檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危組（臀、股骨或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，n=102）的d-d水平明顯高于十危組（膝關(guān)節(jié)的其它于術(shù)、胚骨、腓骨和足部手術(shù)，n=132）。術(shù)后第2天和第4天的d-d檢測(cè)對(duì)確實(shí)存在血栓危險(xiǎn)的患者（即手術(shù)第4天以后d-d水平仍高于2mg/l的患者）的敏感性和特異性分別為100%和72.8%。高危組的dvt發(fā)生率為3.9%，其中近端dvt的發(fā)牛率為1.96%；中危組有一例（0.8

22、%）發(fā)生遠(yuǎn)端dvt。這一結(jié)果顯示，d-d是監(jiān)測(cè)術(shù)后凝血激活情況以及l(fā)mwh抗凝預(yù)防治療的良好指標(biāo)。7d-d在絕經(jīng)后婦女激素替代治療中的變化 絕經(jīng)后婦女激素替代治療（hrt）對(duì)凝血和纖溶系統(tǒng)的影響尚未定論。大多資料顯示，hrt有增強(qiáng)纖溶活性的作用，d-d水平有所增高。 8其它引起d-d升高的因素 在腦血管意外、溶栓治療后、嚴(yán)重感染、膿毒血癥、壞疽、先兆子癇、甲狀腺功能減低、慢性肝病、結(jié)節(jié)病等情況f，常有機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，也可見(jiàn)d-d升高。因此，d-d對(duì)住院患者的特異性比門(mén)診患者差，更適用于門(mén)診患者的vte篩選診斷。    另外，一些生理因素也可影響d-d水平

23、，如年齡和妊娠等。老年人d-d水平有所升高，與年輕人相比有顯著性差別。在30-39歲組，d-d對(duì)vte的特異性為72%；而在80歲以上患者，特異性降至9%。另有兩組研究顯示在70歲以上患者，d-d對(duì)vte的特異性僅為14.3%和8.i%。妊娠婦女d-d水平也升高，且雙胎妊娠升高的更明顯。因此，在分析d-d結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮這些可能的影響因素。    10引起假陰性d-d的情況 由于d-d對(duì)vte高度敏感，但特異性較差，人們把注意力主要集中在假陽(yáng)性問(wèn)題上。但是d-d檢測(cè)也可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。既往血栓患者的d-d水平低于新近發(fā)牛血栓的患者水平，小血栓的d-d水平低于大血栓

24、。因此，有一些時(shí)間校長(zhǎng)的小血栓會(huì)出現(xiàn)亞臨床表現(xiàn)或陰性的d-d結(jié)果。另外，d-d對(duì)遠(yuǎn)端血栓的敏感性低，如果患者的臨床癥狀不明顯，d-d也可能出現(xiàn)假陰性。四結(jié)語(yǔ)    迄今，d-d的最人臨床意義是在排除診斷可疑vte中的作用。d-d對(duì)vte高度敏感，如果患者的d-d低于臨界值水平，?？膳懦齰te。采用d-d作為叮疑vte的首選篩選指標(biāo)，可以排除約30%的可疑dvt和pe患者；如果再結(jié)合臨床預(yù)測(cè)患病率的盾，可排除診斷約50%的患者。這樣不儀人人提高了診斷效率，而且降低了診斷費(fèi)用，也較血管造影等方法更安全、快速，更方便于醫(yī)生和患者。此外，d-d在診斷dic、預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、心梗復(fù)發(fā)和術(shù)后血栓形成、惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移中的作用也受到廠關(guān)注。相信隨著方法學(xué)的不斷進(jìn)步和臨床應(yīng)用研究的進(jìn)一步廣泛深入，d-d檢測(cè)的應(yīng)用前景將會(huì)更加寬廣。  墾骨謠莢第宵萌慰鎬誓諧妻癱播畔軋皆忘沖淮坊顱秉渦桂礎(chǔ)頑共重銻追綜屜生歲何撂費(fèi)腿儒澇銹覺(jué)棺莢拔辟各混糧