高效液相常見問題及解決

1、高效液相色譜儀使用中常見問題及解決方法高效液相色譜儀系統(tǒng)液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件同時(shí)也是易出問題的主要部位。常見問題及解決方法髙效液相作為一種髙精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導(dǎo)致一些 問題。英中最常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題C柱壓問題是使用髙效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)泄與色譜圖峰形的好壞、 柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)左并不是指壓力值穩(wěn)左于一個(gè)恒左值而是指壓 力波動(dòng)范用在345kPa以內(nèi)或在50PSI （針對(duì)Waters高效液相

2、色譜儀）之間（在使用梯度洗脫時(shí)， 柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。1.1壓力過高這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升髙，1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。2、（1）.首先斷開真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自 由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)， 在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，在檢査；3、（2）.打開Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方 法：將過濾白頭取出，用

3、10$的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI以下，過濾白頭正常， 在檢査：4、（3）.把色譜柱岀口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則 用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖 至壓力正常。假如按上而的方法長時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀 器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很 容易造成柱效下降，所以盡量少用。問題無法解決可考慮更換色譜柱。5、流速設(shè)宦不正確：可重新設(shè)定正確流量。6、流動(dòng)相配比不正確：不同配比的流動(dòng)相其黏度系數(shù)不相同

4、，較髙黏度的流動(dòng)相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也 大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。7、系統(tǒng)壓力零點(diǎn)漂移：調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點(diǎn)。8、阻尼器堵塞：拆下后進(jìn)行超聲波淸洗或更換新的阻尼器。9、進(jìn)樣器堵塞：參見說明書淸洗。10、管路或連接口堵塞：更換被堵塞管路或按說明書進(jìn)行清洗。11、柱端過濾器堵塞：拆下過濾器用硝酸超生清洗12、長期使用柱端固定相板結(jié)：挖掉板結(jié)部分修補(bǔ)柱端10、分析生化、染料等易污染固定相的樣品：方法同上，采用保護(hù)柱1. 2壓力過低1、一般是由于系統(tǒng)漁漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋 緊即可。拆下柱子加適當(dāng)力擰緊或襯四氟薄膜。2、泵里進(jìn)了空氣，但此

5、時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽髙忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體。 處理方法：打開Purge閥，用35ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住 外力將氣泡吸出。3、無流動(dòng)相流出：檢查儲(chǔ)液瓶中有無流動(dòng)相，沉子是否浸在流動(dòng)相中，泵是否運(yùn)行。4、參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0. 1-0. 2mL/min后關(guān)閉參比閥。1.3其它壓力問題1、壓力傳感器故障，柱壓升髙或降低或無柱壓:與供應(yīng)商聯(lián)系進(jìn)行維修。2、系統(tǒng)管路中存在氣泡，柱壓不穩(wěn)：重新進(jìn)行排氣操作。（可重復(fù)多次，直至氣泡排岀）3、沉子表而的小孔被堵塞，柱壓在較大范羽內(nèi)波動(dòng)：將沉子取下后進(jìn)行超聲波淸洗?；€問2

6、.1基線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題，在實(shí)際工作中，我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況，特別 是在梯度洗脫的時(shí)候，基線漂移是常有的事。一般說來，機(jī)器剛尼動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要30min 的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長, 但如果你在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：1、柱溫波動(dòng)控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫 外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。）控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器。2、流

7、通池被污染或有氣體用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以 用1N的硝酸（不要用鹽酸）。3、紫外燈能重不足更換新的紫外燈4、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。檢查流動(dòng)相的組成，使用髙品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí) 的溶劑。5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K，值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。 使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過程中，泄期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。6、檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長處將波長調(diào)整至最大吸收波長處7、流動(dòng)相的PH值沒有調(diào)節(jié)好 加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值8、流動(dòng)相不均勻：（流動(dòng)相條件變化引起的基線漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。）使用HPL

8、C級(jí)的溶劑，高 純度的鹽和添加劑，流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用氮?dú)狻?、檢測(cè)器出口阻塞：（髙壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè) 器手冊(cè)更換流通池窗。10、流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化:更改配比或流速。為避免這個(gè)問題可圮期檢査流動(dòng)相組成及流速。11、柱平衡慢特別是流動(dòng)相發(fā)生變化:用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10 20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。12、使用循環(huán)溶劑，但檢測(cè)器未調(diào)整:重新設(shè)定基線。當(dāng)檢測(cè)器動(dòng)力學(xué)范國發(fā)生變化時(shí),使用新的流動(dòng)相。2. 2基線噪音對(duì)于紫外檢測(cè)器，氛燈光源打開后要預(yù)熱30 min以上，基線才能穩(wěn)左。噪聲是指與被測(cè)物

9、無關(guān) 的檢測(cè)器輸出信號(hào)的隨機(jī)擾動(dòng)變化，分短期噪聲和長期噪聲兩種。眾燈用的過久，接近壽命期時(shí)(笊燈的壽命約1 000 h),會(huì)使基線噪音明顯增加，應(yīng)及時(shí)更 換笊燈。除光源外，流路中的氣泡也會(huì)產(chǎn)生噪音。對(duì)于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是 來自流路中的氣泡的問題，可將泵關(guān)上，繼續(xù)走基線，如果噪聲立即停止，基線呈一條直線，說明 基線噪聲來自流動(dòng)相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣；若停泵后仍有噪音出現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測(cè)器中的工作電極(安培型)對(duì)氣泡十分敏感，儀器的平衡時(shí)間較長。流路中如果 有氣泡存在，不僅基線會(huì)岀現(xiàn)尖峰，還會(huì)影響檢測(cè)。因此，做電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相的配制要很嚴(yán)格, 水要超純、除還原

10、物，配好后一左要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué) 分析專用儀器，而是普通的髙效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對(duì)系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和 管道，在分析前用6 molLr硝酸溶液鈍化(注意斷開分離柱)，可縮短基線平衡時(shí)間。還可在流 動(dòng)相中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測(cè)器中，光靠泵沖可能太慢， 可暫時(shí)將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測(cè)器，拆下工作電極，用超純水沖洗電極表而，也很奏效的，但對(duì) 液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作，不宜反復(fù)這樣拆卸。2. 2.1基線噪音(規(guī)則的)產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣；漏液；流動(dòng)相混合不完全；溫

11、度影 響(柱溫過髙，檢測(cè)器未加熱)：在同一條線上有其他電子設(shè)備；泵振動(dòng)。了避免基線噪音，在正式進(jìn)樣之前,需要對(duì)流動(dòng)相脫氣；沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣： 檢査管路接頭是否松動(dòng)；泵是否漏液；是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要,更換泵密封；用手 搖動(dòng)使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器：有苴他電子設(shè)備時(shí)斷開LC、檢 測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正：泵振動(dòng)時(shí)在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。2. 2.2 基線噪音(不規(guī)則的)(1) 漏液：檢查接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封，檢 査流通池是否漏液。(2) 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶

12、劑配成：檢查流動(dòng)相的組成。(3) 流動(dòng)相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動(dòng)相。(4) 檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源,檢查并更正。(5) 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強(qiáng)極性溶液淸洗系統(tǒng)：檢測(cè)器內(nèi)有氣泡，淸洗檢測(cè)器，在檢測(cè)器后而安裝背景 壓力調(diào)節(jié)器。(6) 流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音)：用硝酸淸洗流通池；(7) 檢測(cè)器燈能量時(shí)不足更換燈；(8) 色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。(9) 流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器，在流動(dòng)相不總梯度時(shí)，不建議使用 泵的混合裝置。3保留時(shí)間3. 1保留時(shí)間漂移保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起，而柱老化不可能引起保留時(shí)間的

13、無規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)上，保留 時(shí)間漂移的多半原因是由于不同機(jī)理的色譜柱老化,如固泄相流失(例如通過水解)，色譜柱污染(由 樣品或流動(dòng)相所致)等。保留時(shí)間漂移的幾種最常見的原因和解決方法如下：(1)色譜柱平衡如果觀察到保留時(shí)間漂移,首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運(yùn)行之前給予足夠的 時(shí)間平衡色譜柱。通常平衡需要1020個(gè)柱體積的流動(dòng)相,但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑 （如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長的時(shí)間來平衡色譜柱。流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng) 相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意:水是很容易污 染的流動(dòng)相成分。（2）固定相穩(wěn)定性固立相的穩(wěn)左性都是有限的

14、，即使在推薦的pH范用內(nèi)使用，固左相也會(huì)慢慢水解。例如,硅膠基 質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性最好，水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單 官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)泄；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氛基鍵合相穩(wěn)左的多。經(jīng) 常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固立相的水解。英他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解, 如氨基鍵合相等。（3）色譜柱污染保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可 以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是:流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器 和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來

15、源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的 組分，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)，如:配藥中的賦形劑,生化樣 品（如血淸）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉，環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng) 保留組分具有較髙的分子量，在此情況下，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加，可以通過使 用固相提取（SPE）等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響，避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于 未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)訃有效的淸洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給左 色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多 污染物，但蛋

16、白在THF中就不能溶解，DHSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個(gè)非常 有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。（4）流動(dòng)相組成流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使 用流動(dòng)相等，應(yīng)防止流動(dòng)相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。（5）疏水坍塌當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生分離突 然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌，此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤 固定相表而而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動(dòng)相浸潤固龍相，再用髙水含量的流動(dòng)相進(jìn) 行平衡。由是色譜柱長期儲(chǔ)存也會(huì)

17、發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Waters Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過 15s,超過了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：1、溫控不當(dāng)：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。2、流動(dòng)相比例變化：檢查四元泵的比例閥是否有故障3、色譜柱沒有平衡：在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱4、流速變化：重新設(shè)泄流速5、泵中有氣泡:從泵中除去氣泡6、流量變化：在正確使用流速與流動(dòng)相的前

18、提下檢查泵是否存在問題，比如漏液與在線混合的準(zhǔn)確 性。7、流動(dòng)相的問題：使用預(yù)混合則要注意每次配液的準(zhǔn)確性，精密度與PH的變化。有可能是流動(dòng)相 被污染或加入的添加劑對(duì)被測(cè)組分的干擾。、8、色譜柱被污染：正/反相沖洗色譜柱或更換新色譜柱。9、梯度滯后時(shí)間設(shè)置不正確；檢查泵和流路系統(tǒng)維護(hù)記錄，確左很多系統(tǒng)最后使用之前有無調(diào)整。如有變化，重新訃算新的梯度滯后體積。10、色譜柱使用問題：不同的色譜柱尺寸與填料對(duì)同一物質(zhì)的保留時(shí)間是不同的。同一批樣品的分 析最好使用同一色譜柱。11、系統(tǒng)不平衡：應(yīng)該用充足的時(shí)間來平衡整個(gè)系統(tǒng)，特別在色譜柱第一次使用離子對(duì)試劑時(shí)，要 有充足時(shí)間和流動(dòng)相體積來平衡色譜柱。每

19、次開機(jī)使用時(shí)平衡時(shí)間至少為0. 5lh,在改變流動(dòng)相時(shí) 也需要0.5h來重新平衡柱子。3.2保留時(shí)間波動(dòng)保留時(shí)間有的縮短，有的延長,有的上下波動(dòng)，保留時(shí)間波動(dòng)的主要原因：色譜柱溫度范圍控制的不好，溫度波動(dòng)太大；流動(dòng)相當(dāng)中組分發(fā)生變化：色譜柱沒 有平衡：流動(dòng)相流速發(fā)生變化；泵中有氣泡：流動(dòng)相選擇不恰當(dāng)?shù)?。解決辦法：嚴(yán)格控制柱子的溫度，室內(nèi)溫度保持恒立，上下波動(dòng)二度為宜：流動(dòng)相的組成恒左，防 I匕變化（蒸發(fā)、反應(yīng)等）：色譜柱在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡：選擇合適的流動(dòng)相或者混 合流動(dòng)相，并使流速保持恒泄，發(fā)生變化時(shí)重新設(shè)左流速；管線內(nèi)有氣泡時(shí)要用脫氣機(jī)進(jìn)行脫氣并時(shí) 時(shí)監(jiān)控保持。4峰型異常問峰

20、型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型, 對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。1、色譜圖中未出峰 系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解：泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確：檢測(cè)器設(shè)置不正 確；針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。2、一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰流動(dòng)相吸收本底高：進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于 流動(dòng)相。3、所有峰均為負(fù)峰信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸岀極性設(shè)苣顛倒：光學(xué)裝垃尚未達(dá)到平衡。4、所有峰均為寬峰系統(tǒng)未達(dá)到平衡：溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類 型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低：溫度變化造成的影響。、5、所

21、出峰比預(yù)想的小樣品黏度過大：進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測(cè)器設(shè)置不正確.定量 環(huán)體積不正確：檢測(cè)池污染：檢測(cè)器燈出現(xiàn)問題。6、出現(xiàn)雙峰或肩峰 進(jìn)樣量過大：樣品濃度過髙：保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞：保護(hù)拄或色譜 柱污染或失效：柱塌陷或形成短通道。7、前伸峰：進(jìn)樣量或樣品濃度髙，溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng)：保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。 柱溫低：升高柱溫；樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：使用流動(dòng)相作為樣品溶劑；樣品過載：降低樣 品含屋：色譜柱損壞：更換柱子。8、拖尾峰：柱超載，降低樣品量：增加柱直徑采用較高容量的固立相；絳干擾，對(duì)樣品進(jìn)行淸潔過 濾：調(diào)整流動(dòng)相：硅疑基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃

22、度降低流動(dòng)相pH值; 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼：加在線過濾器，對(duì)樣品進(jìn)行過濾；死體枳或柱外體枳過大, 將連接點(diǎn)降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn) 行再生。色譜穌拖尾是色譜分析中最常見問題之一。產(chǎn)生的原因很多，早期的液相色譜柱由于封尾技術(shù) 原因，硅膠基質(zhì)上的硅疑基殘留多，被分析物與色譜柱間的相互作用導(dǎo)致蜂拖尾，認(rèn)為是殘留硅疑基 與分析物中的游離氨基與硅疑基的氫鍵作用力的結(jié)果。峰拖尾一般發(fā)生在堿性化合物上，這是由于殘 留的硅羥基和帶正電荷的堿性化合物之間的相互作用引起的。這也是許多有機(jī)含氮藥物色譜峰拖尾 的原因，解決這類藥物拖尾的方法有加入掃尾

23、劑、磷酸鹽、或者加入離子對(duì)試劑。一般可以得到有效 的解決。當(dāng)流動(dòng)相的值大于4. 55. 0時(shí)，色譜柱表而的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，因此，消除郵拖尾的最 有效方式是使用pH值小于4的緩沖流動(dòng)相。由于硅輕基的活性和離子化會(huì)降低，因此選擇更換新的高 純疑基化硅膠色譜柱也會(huì)減少峰拖尾。目前色譜填充技術(shù)已相對(duì)成熟，許多色譜柱甚至可以達(dá)到硅疑 基的完全封尾但是對(duì)很多藥物色譜拖尾仍然非常嚴(yán)重，因此硅疑基作用力只是造成色譜唸拖尾的可 能原因之一。9、出現(xiàn)平頭峰檢測(cè)器設(shè)置不正確：進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。10、10、出現(xiàn)鬼峰進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和 淸洗系統(tǒng)；樣品中存在

24、未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理：流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用， 隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過濾：盡可能使用HPLC級(jí)試劑：流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大 流速排除。11、峰分叉保護(hù)柱或分析柱污染：取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析，如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻 塞,拆下來淸洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果問題 仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動(dòng)相改變樣品溶劑，如果可 能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。12、峰變形樣品過載，減少樣品載量。13、早出的峰變形樣品溶劑選擇不恰當(dāng)減少進(jìn)樣體積運(yùn)用低極性樣品溶劑14、早出的峰拖尾程度大

25、于晚出的峰柱外效應(yīng)調(diào)整系統(tǒng)連接（使用更短、內(nèi)徑更小的管路） 使用小體積的流通池15、K'增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重（1）二級(jí)保留效應(yīng)，反相模式加入三乙胺（或堿性樣品）加入乙酸（或酸性樣品）加入鹽或緩沖 劑（或離子化樣品）更換一支柱子（2）二級(jí)保留效應(yīng)，正相模式加入三乙胺（或堿性樣品）加入乙酸（或酸性樣品）加入水（或多官 能團(tuán)化合物）試用另一種方法（3）二級(jí)保留效應(yīng),離子對(duì) 加入三乙胺（或堿性樣品）16、酸性或堿性化合物的峰拖尾緩沖不合適使用濃度50100 mM的緩沖液使用Pka等于流動(dòng)相 pH值的緩沖液17、額外的峰（1）樣品中有其他組分：正?，F(xiàn)象：（2）、前一次進(jìn)樣的洗脫峰：增加運(yùn)行時(shí)間或

26、梯度斜率提高流速；（3）空位或鬼峰：檢查流動(dòng)相是否純凈使用流動(dòng)相作為樣品溶劑減 少進(jìn)樣體積。5結(jié)語以上內(nèi)容只是對(duì)液相色譜中出現(xiàn)的常見的問題進(jìn)行了分析，當(dāng)然在我們實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中還會(huì)遇到 更多的其它問題，在故障排除時(shí)要遵守以下原則：一次只改變一個(gè)因素，確怎假左因素與問題之間 的聯(lián)系：如果通過更換組件來排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費(fèi)：養(yǎng)成良好 的記錄習(xí)慣，這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵?？傊谑褂皿{效液相色譜時(shí)一泄要注意樣品的前處 理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。輸液泵的常見故障及對(duì)策輸液泵/高壓泵是保址HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)左的重要儀器部件，目前多用 往復(fù)式恒流柱塞泵，主

27、要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成，用馬達(dá)帶動(dòng)凸輪驅(qū)動(dòng)柱塞桿作吸 液和排液的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動(dòng)相混 合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。1單向閥故障由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要 是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動(dòng)相應(yīng)使用HPLC級(jí)的溶劑，并且配好的流動(dòng)相一 左要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。 沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的

28、溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。氣泡進(jìn)入閥中會(huì)緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會(huì) 明顯改變。此時(shí)，應(yīng)立即打開泄液閥，大流2ml/min）沖洗泵，直至排除液為直線型。因?yàn)榧状?可潤濕泵內(nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲 醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固泄住進(jìn)氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽， 手動(dòng)泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓岀來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊3。采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)泄，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更 換部件。2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況

29、下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶 液，因?yàn)檫@會(huì)損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動(dòng)著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運(yùn) 動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊 圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì)加速墊圈的磨損，應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí), 表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。為避免上述故障的發(fā)生，我們?cè)诜治龉ぷ髦袘?yīng)注意以下幾點(diǎn)： 使用超純水（18HQ.cm）、純度級(jí)別較高的試劑和色譜級(jí)溶劑配制流動(dòng)相； 配好的流動(dòng)相一左要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也最好在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾 既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效

30、。 泵在起動(dòng)前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。 用緩沖鹽洗脫時(shí)，分析結(jié)束后一左要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中， 最后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。色譜分離柱的使用與維護(hù)在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們 目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。1怎樣維護(hù)好色譜分離柱加保護(hù)柱（預(yù)柱）是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱, 接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾 如果直接進(jìn)入分離柱會(huì)逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品

31、，如分析血漿樣品，一 般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。避免髙壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將 改變柱床體積，影響柱效。引起髙壓沖擊的原因主要有：進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、 柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大，自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢，可能會(huì)造成壓力沖擊。合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn)，一是根據(jù)待測(cè)組分的分子量的 大??；二是根據(jù)流動(dòng)相條件，包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流 動(dòng)相PH值在3- 7之間，極端PH值（8）的流動(dòng)相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進(jìn)的 雜化顆粒技術(shù)研制的高

32、純硅膠顆粒填料（如Waters公司的XTerra色譜柱），集硅膠和多孔聚合物 填料的優(yōu)點(diǎn)為一體，使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表而位置的硅疑基，使這種 新型填料具有分辨率高、穩(wěn)左性強(qiáng)、PH范囤寬（1- 12）的優(yōu)勢(shì)，苴性能突破了傳統(tǒng)髙效液相色譜 柱的極限。所以一立要根據(jù)分析的對(duì)象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱，茫然時(shí)可向公司的技術(shù) 人員咨詢。上期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí)，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子, 如可用色譜純甲醇、乙臘沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水 為流動(dòng)相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。2怎樣減少柱的污染

33、？最有效的辦法是純化樣品。我們?cè)诙嗄甑姆治龉ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，凡是樣品純化的越干凈，分離柱的 壽命就越長;反之，只有提取沒有純化的樣品，分離柱柱效下降較快。建立一個(gè)理想的色譜分析方法 應(yīng)該有一套有效的樣品前處理方法，特別是在分析血漿和尿液樣品時(shí)，要特別注意樣品的提取與純 化，盡量使處理過的樣品中雜質(zhì)（如大分子蛋白、有機(jī)物等）降到最低，保護(hù)柱頭和柱子。提取純化好的樣品最好用流動(dòng)相來溶解，一方而減少色譜圖中的溶劑峰干擾，另一方面也是 檢査樣品在流動(dòng)相中的溶解性，如果樣品進(jìn)樣后在流動(dòng)相中沉淀，會(huì)堵塞進(jìn)樣器和柱頭，甚至樣品 分解，出現(xiàn)怪峰。如果出現(xiàn)樣品與流動(dòng)相不溶要設(shè)法改變?nèi)芙鈼l件，如更換樣品溶劑，或改進(jìn)處理

34、 樣品的方法，或過濾，去除不溶性物質(zhì)。檢測(cè)器的常見故障及對(duì)策液相色譜儀常用的檢測(cè)器主要有紫外、熒光和電化學(xué)檢測(cè)器。這些檢測(cè)器的作用就是收集流經(jīng) 色譜分離柱的各組分在檢測(cè)器中的信號(hào)，根據(jù)組分光吸收值/熒光強(qiáng)度/電極表而電流的變化計(jì)算 出組分的濃度4。各檢測(cè)器常見故障主要有：1基線噪音較大和對(duì)策對(duì)于紫外檢測(cè)器，嵐燈光源打開后要預(yù)熱30分鐘以上，基線才能穩(wěn)建。氛燈用的過久，接近受命期時(shí)（笊燈的壽命約束1000小時(shí)），會(huì)使基線噪音明顯增加，應(yīng)及 時(shí)更換笊燈。除光源外，流路中的氣泡也會(huì)產(chǎn)生噪音。怎樣判斷基線噪音增大是由于光源燈的老化 還是來自流路中的氣泡？可將泵關(guān)上，繼續(xù)泄基線，如果噪音立即停止，基線呈

35、一條直線，說明基 線噪音來自流動(dòng)相中的氣泡，應(yīng)設(shè)法排氣；若停泵后仍有噪音岀現(xiàn)，應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測(cè)器中的工作電極（安培型）對(duì)氣泡十分敏感，儀器的平衡時(shí)間較長。流路中如果有 氣泡存在，不僅基線會(huì)出現(xiàn)尖峰，還會(huì)影響檢測(cè)。因此，做電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相的配制要很嚴(yán)格, 水要超純、除還原物，配好后一左要過濾脫氣，還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料，即電化學(xué) 分析專用儀器，而是普通的髙效液相色譜不銹鋼泵，應(yīng)對(duì)系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和 管道，在分析前用6mol/L硝酸溶液鈍化（注意斷開分離柱），可縮短基線平衡時(shí)間。還可在流動(dòng)相 中加入EDTA離子隱蔽劑，也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測(cè)器中，光靠泵沖有時(shí)太慢，可暫 時(shí)將泵停止，關(guān)上電化學(xué)檢測(cè)器，拆下工作電極，用超純水