南極魚抗凍蛋白功能和進(jìn)化研究

1、南極魚抗凍蛋白功能和進(jìn)化研究 在6500萬年前的新生代時(shí)期,南極大陸開始緩慢移動(dòng),同時(shí)其溫度逐漸降低,到大約2000萬年前溫度降到0以下。隨著海水溫度的降低,多數(shù)魚類由于無法適應(yīng)而滅絕1。部分魚類發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化,適應(yīng)了極端寒冷環(huán)境而生存下來,形成了現(xiàn)在的南極魚類。據(jù)統(tǒng)計(jì),占地球海洋總面積約10%的南大洋擁有的魚類包括50個(gè)科,322個(gè)種,僅占地球魚類總數(shù)的1.3%。其中硬骨魚南極魚亞目(Notothenioids)魚類達(dá)120多種,占南大洋所有魚類的46%,而在南極洲周圍海域南極魚亞目比例高達(dá)90%2。南極魚常年生活在穩(wěn)定的、極端寒冷和氧氣充足的南極海域中,在生化和生理功能等方面發(fā)生了許多適

2、應(yīng)性改變和新的性狀以適應(yīng)南極的極端環(huán)境,其中抗凍蛋白是南極魚適應(yīng)極端寒冷環(huán)境的最重要特征之一3-4。20世紀(jì)60年代,科學(xué)家首次在南極冰魚(Nototheniidae)血液中發(fā)現(xiàn)抗凍糖蛋白(antifreezeglycoprotein,AFGP)4。目前已知大多極地魚類和冷水魚體內(nèi)都可以產(chǎn)生抗凍蛋白(antifreezeprotein,AFP)或抗凍糖蛋白,這些蛋白質(zhì)可以把魚類體液的冰點(diǎn)降低,從而在環(huán)境水域冰點(diǎn)之下仍能保持體液的流動(dòng)性,避免冷凍損傷的發(fā)生5。近年來研究發(fā)現(xiàn),其他極地物種包括昆蟲、植物、微生物也可以產(chǎn)生抗凍蛋白6。隨著對(duì)抗凍蛋白認(rèn)識(shí)的不斷深入,科學(xué)家漸漸把抗凍蛋白應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥

3、、食品和工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。 1南極魚類抗凍蛋白分子特征和適應(yīng)性進(jìn)化 目前至少1種抗凍糖蛋白和4種抗凍蛋白已經(jīng)被鑒定出來,它們分布在多種分類地位相差很遠(yuǎn)的極地魚類中。這些抗凍蛋白的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)都不相同,但都具有結(jié)合冰晶并抑制冰晶生長的功能。最初在南極冰魚(Nototheniidae)中發(fā)現(xiàn)AFGP,由一個(gè)糖三肽(Thr-Ala-Ala)基本結(jié)構(gòu)單位重復(fù)組成,Thr殘基上可以連接雙糖基團(tuán)(-D半乳糖基,1,3-N-乙酰氨基半乳糖),糖基上發(fā)生化學(xué)修飾會(huì)降低AFGP的抗凍活性。魚類可以合成一系列大小不一的AFGP分子,由不同數(shù)量的糖三肽單位聚合而成。根據(jù)糖三肽單位重復(fù)數(shù)目不同,AFGP可分為8

4、個(gè)類別,重復(fù)數(shù)為450,分子量從2.732kD7。魚類的AFP也根據(jù)氨基酸組成和結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分類。I型抗凍蛋白(AFPI)存在于北極和北大西洋的扁魚(Pleuronectespp.)和杜父魚(Myoxoce-phalusspp.)中,是3.54.5kD的小分子肽。AFPI分子中富含丙氨酸(Ala),形成一個(gè)幾乎規(guī)范的alpha螺旋結(jié)構(gòu)8。II型抗凍蛋白(AFPII)是分子量1417kD的多肽,富含半胱氨酸(Cys),分布范圍較窄,目前僅在大西洋鯡(Clupeaharengus)和美絨杜父魚(Hemitripterusamericanus)等幾種魚中發(fā)現(xiàn)AFPII9。III型抗凍蛋白(AFPII

5、I)是研究最為廣泛的一種抗凍蛋白,主要分布在極地海域和大西洋的幾種綿鳚亞目(Zoarcidae)的魚中,包括斷線真狼綿鳚(Lychodyichthysdearborni)和北極狼綿鳚(Locodespolaris)10。目前已經(jīng)從南極大頭鰻鱺(Lycodichthysdearborni)的血漿中分離出8種AFPIII成分,包括3種主要成分(RD1、RD2、RD3)和5種少量成分11-12。AFPIV是從多棘床杜父魚(Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分離到的一種抗凍蛋白(LS12)13,分子量約12.3kD,含108個(gè)氨基酸殘基,其中17%是谷氨酰胺,N末端被

6、焦谷氨?；鶊F(tuán)所封閉。AFPIV廣泛分布于硬骨魚類中,具有降低冰點(diǎn)和冰晶修飾等AFP的特征性功能13。抗凍蛋白的進(jìn)化是南極魚寒冷適應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制,其中南極魚的AFGP從頭進(jìn)化機(jī)制是近年來的重要發(fā)現(xiàn)。南極魚類的AFGP基因由功能上不相關(guān)的胰蛋白酶原基因(trypsinogen)演化而來。trypsinogen第一內(nèi)含子和第二外顯子交接處的編碼ThrAlaAla的9核苷酸序列在5端微衛(wèi)星DNA序列的引導(dǎo)下擴(kuò)增,首先形成一個(gè)trypainogenAFGP中間分子,隨后經(jīng)歷了大部分trypsiongen編碼區(qū)序列缺失而形成獨(dú)立的AFGP編碼基因,并進(jìn)一步通過分子內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增形成一個(gè)龐大的AFGP基因家

7、族14。北極魚類的AFGP蛋白在氨基酸序列上與南極魚類的AFGP幾乎沒有區(qū)別,但經(jīng)過研究卻發(fā)現(xiàn)北極魚類的AFGP蛋白在基因進(jìn)化上與trypsinogen毫無關(guān)系4。有研究發(fā)現(xiàn)來自于南極大頭鰻鱺的AFPIII基因起源于一個(gè)唾液酸合成酶(SAS)基因拷貝15。IV型AFP與其他類型的魚類AFP相似度較低,被鑒定并歸類為新的IV型AFP,并且這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是從載脂蛋白進(jìn)化而來的13?？箖龅鞍谆蚱鹪吹陌l(fā)現(xiàn)揭示了一種新基因起源的進(jìn)化機(jī)制,同時(shí)也把分子進(jìn)化、環(huán)境適應(yīng)和物種分化緊密地聯(lián)系在一起。 2抗凍蛋白的作用機(jī)制 抗凍蛋白作用機(jī)制在于可以結(jié)合微小的冰晶并抑制冰晶的繼續(xù)生長?？箖龅鞍滓苑且罃?shù)性形式降低

8、水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)(meltingpoint,MP)影響甚微,從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)(MP)和冰點(diǎn)(freezingpoint,FP)之間出現(xiàn)差值,這個(gè)差值稱為熱滯活性(thermalhysteresisactivity,THA)16。THA已被用于定量描述AFP的活性(圖1),對(duì)于大多數(shù)魚類AFP,觀察到的THA約為1。在冬季(1.9),這種溫度差距可以為海水提供足夠的緩沖,使極地魚在寒冷的環(huán)境中生存17?？箖龅鞍椎牡诙€(gè)功能是冰重結(jié)晶抑制(icerecrystal-lizationinhibition,IRI)。冰重結(jié)晶(IR)解釋了一個(gè)熱力學(xué)上有利的過程,其中較大的冰晶的形成以犧牲較小

9、的冰晶為代價(jià)。較大的冰晶對(duì)于冷凍保存的細(xì)胞以及棲息在極地或寒冷地區(qū)的生物體可能是致命的,而抗凍蛋白可以在非常低的濃度下抑制冰重結(jié)晶,冰晶晶體之間界面處的AFP可以與冰粒表面結(jié)合并抑制其生長過程,其依賴AFP的冰重結(jié)晶抑制機(jī)制仍不是很明確18-19。將含AFP的溶液與30%蔗糖以11的比例混合。將混合溶液點(diǎn)在兩個(gè)蓋玻片之間并快速冷凍。然后,將樣品置于6,并在特定時(shí)間段內(nèi)觀察變化。如圖1所示,較大的冰粒以較小的冰晶為代價(jià)而增長,而在AFP存在的情況下,在較低的面板中停止生長20。冰重結(jié)晶抑制更可能是耐寒生物在極冷環(huán)境中生存的關(guān)鍵屬性,冰重結(jié)晶抑制被認(rèn)為可以保護(hù)細(xì)胞膜免受凍傷。圖1使用改良的激冷板實(shí)

10、驗(yàn)檢測AFP的冰重結(jié)晶抑制功能20Fig.1IcerecrystallizationinhibitionassayofAFPusingmodifiedsplatassay20熱滯活性(THA)和冰重結(jié)晶抑制(IRI)均基于AFP對(duì)冰的親和力。然而,THA并不總是與IRI活性成正比(圖2),較低THA活性的AFP可以表現(xiàn)出較高的IRI活性20。Olijve等21證明了AFP及其突變體顯示出不同的THA值,但具有幾乎相同的IRI活性。與中度熱滯活性的抗凍蛋白LeIBP相比,高熱滯活性的抗凍蛋白FfIBP卻在IRI中表現(xiàn)出較低的活性22。這些結(jié)果提示,抗凍蛋白的THA并不能夠直接轉(zhuǎn)化為生物樣品的冷凍

11、保存效率,因此不能僅靠THA來考慮AFP在冷凍保存中的應(yīng)用。 3抗凍蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究 抗凍蛋白的熱滯活性(THA)和冰重結(jié)晶抑制(IRI)活性使其在冷凍保存中具有重要作用。冷凍保存可用于在極低溫度下儲(chǔ)存各種類型的細(xì)胞、組織和器官、鮮冷食品等,已成為生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。冷凍保存中最重要的是避免冰晶形成導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。目前常用的冷凍保存劑(如二甲基亞砜和甘油)可以減少冰的形成,但高濃度的冷凍保存劑對(duì)細(xì)胞具有毒性23。解凍期間的冰再結(jié)晶也是冷凍保存對(duì)細(xì)胞損傷的重要因素,而AFP在抑制冰再結(jié)晶,提高冷凍保存效率方面具有良好的應(yīng)用潛力。3.1在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用冷凍

12、保存是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一,可以解決不孕不育、延遲生育等問題。AFP可應(yīng)用于精子、卵子和胚胎等組織器官的冷凍保存24。研究報(bào)道極地魚類來源的抗凍蛋白AFPIII對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保存具有顯著的保護(hù)作用。使用抗凍蛋白明顯降低了小鼠卵母細(xì)胞冷凍保存復(fù)蘇后的損傷,ROS的產(chǎn)生、DNA雙鏈斷裂程度和細(xì)胞凋亡的程度明顯降低,復(fù)蘇后卵子的發(fā)育完整性增強(qiáng),使用抗凍蛋白冷凍保存的受精卵發(fā)育水平明顯高于對(duì)照組25-26。在牛的卵子玻璃化冷凍保存研究中發(fā)現(xiàn),抗凍蛋白AFGP-8的加入也明顯降低了冷凍損傷的發(fā)生,提高了冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇后正常發(fā)育的水平27。在魚類的胚胎冷凍保存實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),用加入含有AFPI

13、的冷凍保存液進(jìn)行顯微注射或孵育的魚胚胎,在低溫(4或10)冷卻后存活率顯著提高28-29。哺乳動(dòng)物精子的冷凍保存技術(shù)比較成熟,但也有研究報(bào)道AFP和AFGP在精子冷凍保存中發(fā)揮重要作用,可明顯降低冷凍損傷,提高精子的活力和漿膜的完整性30-32。這些研究表明AFP在精子、卵子、胚胎冷凍保存中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。3.2在外科中的應(yīng)用冷凍手術(shù)是目前腫瘤治療的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù),研究報(bào)道手術(shù)前將少許AFP注射到待切除組織中,可以提高手術(shù)成功率,減少冷凍手術(shù)后的目標(biāo)組織發(fā)生冷凍損傷問題33。AFP也被用于器官移植手術(shù)的組織、器官的冷凍保存,AFP在器官冷凍儲(chǔ)存中的保護(hù)效果受多種因素的影響,包括AFP的濃度、

14、冷凍保護(hù)液的成分等。如有研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的AFGP對(duì)低溫儲(chǔ)存的心臟沒有保護(hù)作用34。同時(shí)有報(bào)道AFP可以保護(hù)低溫保存的大鼠心臟,用含有AFP的保存液保存的心臟在移植手術(shù)后具有更高的存活率、表現(xiàn)出更好的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和更低的細(xì)胞凋亡水平35-36。目前對(duì)AFP在組織、器官低溫儲(chǔ)存中的作用機(jī)理和應(yīng)用潛能方面的研究較薄弱,該方面的基礎(chǔ)研究對(duì)AFP在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)是急需開展的。 4抗凍蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究 抗凍蛋白作為食品添加劑可以抑制冰晶生長,改善冷凍食品的品質(zhì)37。添加有AFP的冰激凌,冰碴的產(chǎn)生顯著減少,而未加AFP的冰淇淋樣品中冰晶較大且不均勻,AFP添加改善了冰激凌的質(zhì)量和口感38。

15、抗凍蛋白還可以應(yīng)用在冷鮮、冷凍食品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)AFP在肉類的冷凍保存中,可以減少肌肉細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,可以保持肌球蛋白ATP酶的活性,從而提高冷凍肉類的品質(zhì)和口感39-40。在羔羊屠宰前注射AFPG,宰后肉在20凍藏216周后解凍檢測產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)現(xiàn):屠宰前注射AFPG均可顯著降低冰晶的體積和液滴的數(shù)量41。速凍果蔬容易出現(xiàn)汁液流失、軟爛、失去原有形態(tài)。運(yùn)用基因工程的方法將異源高活性抗凍蛋白基因?qū)牍咧?能夠有效改善這種狀況。美國DNA工程公司把抗凍蛋白基因?qū)敕阎?這種新的轉(zhuǎn)基因番茄耐寒性能增強(qiáng),可以在6生存幾個(gè)小時(shí),而且果實(shí)冷藏后不變形42。 5抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究 5

16、.1抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高動(dòng)植物的耐寒能力。低溫冷害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要危害,每年因低溫冷害造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,提高動(dòng)植物的耐寒能力是解決這一問題的關(guān)鍵。近年來,隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟,抗凍蛋白基因被引入植物和動(dòng)物物種,以擴(kuò)大其地理適應(yīng)范圍,增加低溫生存的能力。目前科學(xué)家已經(jīng)生產(chǎn)出多種能夠合成抗凍基因的轉(zhuǎn)基因物種,包括煙草,番茄和馬鈴薯植物等,初步觀察發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植物中獲得了增加的抗凍能力43-44。而表達(dá)外源AGFP的小鼠對(duì)于低溫引起的凍傷具有更好的抵抗力45,同樣表達(dá)外源AGFP的果蠅也具有更強(qiáng)的低溫耐受能力46?？箖龅鞍邹D(zhuǎn)基因作物的推廣,將有效地幫助農(nóng)業(yè)生產(chǎn)避免惡劣天氣帶來的損失,擴(kuò)

17、展作物的栽種范圍和生長季節(jié),提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外,抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物還有望在后續(xù)的運(yùn)輸、低溫儲(chǔ)藏和加工等多個(gè)環(huán)節(jié)更加有效和便利,抗凍蛋白在農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)極具應(yīng)用前景。5.2抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因能有效提高水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類的耐寒能力。每年因低溫冷害造成的漁業(yè)損失巨大,將抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入溫度敏感經(jīng)濟(jì)魚類,可以提高這些魚類的抗寒能力,改善這些魚類的養(yǎng)殖區(qū)域。20世紀(jì)90年代,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)將抗凍蛋白轉(zhuǎn)基因羅非魚顯示出增強(qiáng)的耐寒能力,但當(dāng)時(shí)由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不成熟,抗凍蛋白的表達(dá)水平比較低47。直接顯微注射南極魚抗凍蛋白到斑馬魚受精卵,斑馬魚發(fā)育成熟后表現(xiàn)出強(qiáng)的耐寒能力29。美國AquaBountyTechn

18、ologies公司擁有世界上首個(gè)被批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因魚,他們研發(fā)的轉(zhuǎn)基因三文魚AquAdvantage被轉(zhuǎn)入了兩種基因:太平洋奇努克三文魚的生長激素基因和大洋鱈的抗凍蛋白基因,使其可以在大西洋寒冷的底部也能快速持續(xù)生長48。由于來自極地魚類的抗凍蛋白屬于長期被人類食用的天然蛋白,在食品安全方面沒有問題,容易被大眾接受。 6南極魚抗凍蛋白研究和應(yīng)用開發(fā)所存在的問題 盡管南極魚抗凍蛋白在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景,但是目前在生產(chǎn)成本和產(chǎn)業(yè)化等方面還存在一些限制和不足,生產(chǎn)僅限于研究和專門的應(yīng)用。因此,如何低成本地生產(chǎn)高活性的抗凍蛋白是其應(yīng)用開發(fā)的技術(shù)關(guān)鍵。目前有學(xué)者通過原核或真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和純化了重組的南極魚AFP49-50,但上述研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段,有待于進(jìn)一步提高表達(dá)量和規(guī)模化生產(chǎn)。此外,也有研究報(bào)道通過混合使用