煙草遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)八 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)和掌握植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的操作技術(shù)與方法。 實(shí)驗(yàn)器材：超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)室、高壓滅菌器、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、 250 mL 、500 mL 三角瓶、鑷子、酒精燈等。配置 MS 液體培養(yǎng)基（ 2， 4-D 2 mg/L+1% 甘露醇 +3% 蔗糖， pH 5.8 ）分裝于 250ml 的三角瓶中，每瓶 50ml 。實(shí)驗(yàn)材料：煙草葉片愈傷組織。實(shí)驗(yàn)方法：1.70% 乙醇凈化工作臺(tái)并擦洗干凈，將所用的材料、工具、培養(yǎng)基等 放入工作臺(tái)。 打開紫外燈和風(fēng)機(jī)， 15 分鐘后關(guān)閉紫外燈開始方可 操作。2. 在超凈臺(tái)上用無菌鑷子夾取出生長(zhǎng)旺盛的松軟愈傷組織，放入15

2、0ml 三角瓶中并輕輕夾碎 ,每個(gè)三角瓶加入培養(yǎng)基 20-30ml ，每 瓶接種1-2g愈傷組織，按愈傷組織與液體培養(yǎng)基 1 10的比例， 以保證最初培養(yǎng)物中有足夠量的細(xì)胞。3. 接種后的三角瓶用天平稱取重量并記載，然后置于搖床上，在轉(zhuǎn)速100-120rpm ,25 C下培養(yǎng)以及散射光條件下，進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)。4. 每周更換新鮮液體培養(yǎng)基兩次，每次更換1/3 。每次更換新鮮培養(yǎng)基時(shí)稱取重量。5. 每個(gè)人接種懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 1 瓶,觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。6. 培養(yǎng) 7 天后,制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng) 態(tài),可用以下方法繪制生長(zhǎng)曲線圖：鮮重法：在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時(shí)間,取一定體積的懸

3、浮培養(yǎng)物,離 心收集后,稱量細(xì)胞的鮮重,以鮮重為縱座標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫座標(biāo), 繪制鮮重增長(zhǎng)曲線。煙草遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒煵菔沁z傳轉(zhuǎn)化的模式植物， 已經(jīng)建立了一套完善的轉(zhuǎn)化再生體系。 本實(shí)驗(yàn)以煙草為實(shí) 驗(yàn)材料，了解根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本原理和一般步驟，掌握遺傳轉(zhuǎn)化的基本操作技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)要求：掌握根癌農(nóng)桿菌侵染植物獲取轉(zhuǎn)基因材料的方法；理解農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化 的機(jī)理；了解轉(zhuǎn)基因植物篩選的方法。實(shí)驗(yàn)原理根癌農(nóng)桿菌是一種能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤的細(xì)菌，根癌農(nóng)桿菌中誘導(dǎo)植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì) 粒，簡(jiǎn)稱為 Ti 質(zhì)粒。野生型農(nóng)桿菌的 Ti 質(zhì)粒，含有兩個(gè)與致瘤有關(guān)的區(qū)域： 一個(gè)是 T DNA 區(qū)，含致瘤基因；

4、另一個(gè)是毒性區(qū)，在 T DNA 的切割、轉(zhuǎn)移與整合過程中起作用。用于 植物基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌 Ti 質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，是將野生 Ti 質(zhì)粒中的致瘤基因刪除，并在 T DNA 區(qū)域內(nèi)插入適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)。p BI121 載體是常用的植物表達(dá)載體，載體的骨架是 pUC18 ，以 CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 NPTII 為卡那霉素( kan )抗性選擇標(biāo)記基因，含有卡那霉素抗 性基因作為篩選基因。3-葡萄糖苷酶gus基因作為報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化的獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或植株，具有抗卡那霉素的特性，經(jīng)組織化學(xué)染色呈藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)器材搖床、超凈工作臺(tái)、小型離心機(jī)、冰箱、移液搶、鑷

5、子、手術(shù)刀、酒精燈、棉球、培養(yǎng) 皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽。實(shí)驗(yàn)材料植物材料：煙草無菌苗農(nóng)桿菌與載體：農(nóng)桿菌 LBA4404 p BI121YEB培養(yǎng)基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO 4(0.5 g/L) 、pH 7.0煙草分化培養(yǎng)基： MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA煙草生根培養(yǎng)基： MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan)母液：50mg/ml，過濾除菌，分裝，20C保存。頭孢霉素(cef)母液：300mg/ml，過濾除菌，分裝，20 C保存。利福平(rif): 50mg/ml，過濾

6、除菌，分裝，20 C保存。實(shí)驗(yàn)步驟1. 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備：1) 接菌于5 ml YEB液體培養(yǎng)基(Rif 50 mg/L)中，28 C, 200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)12天；2) 取 1mL 活化的菌液接種于 50mlYEB 液體培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)至 OD600 值為 0.4 0.6 左右。3) 將菌液倒入 50mL 的離心管中，冰浴 20 分鐘。4) 4 C, 5000g離心10分鐘，收集菌體。5) 用 0.15M NaCl /0.1M CaCl 2 中懸浮細(xì)胞。6) 5000 rpm 離心 5 分鐘,去上清；7) 用冰預(yù)冷 20mM CaCl 2重懸沉淀, 如不是馬上使用,加入甘油分裝,

7、液氮速凍后, -70C 保存。2. 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：1) 取200山感受態(tài)細(xì)胞于 Eppendorf管；2) 加入1質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘；3) 立即放入液氮中冰凍 5分鐘；(-70 C放置10min)4) 取出 Eppendorf 管，立即放入 37 oC 水浴 5 分鐘；5) 加入YEB培養(yǎng)基I ml, 28oC, 150 rpm 搖床培養(yǎng)23小時(shí)；6) 離心 1 分鐘，懸浮細(xì)胞在 100ul YEB 培養(yǎng)基中。7) 在 YEB 固體培養(yǎng)基 (Kan 50 mg/L, Rif 50 mg/L) 涂板；8) 28 oC 下暗培養(yǎng) 2 3 天；9) 挑單菌落，提取質(zhì)粒，酶切，電

8、泳檢查。10)取轉(zhuǎn)化菌株培養(yǎng)液于 1.5 ml的離心管中，加15%的無菌甘油，貯存在-70 oC長(zhǎng)期保存。3. 農(nóng)桿菌活化1) 挑取攜帶植物表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種在35ml含50mg/L rif和50mg/L Kan 的YEB液體培養(yǎng)基中，28C, 180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)ODeoo為0.6-0.8。2) 活化過夜的農(nóng)桿菌按1: 1001 : 50的比例接種在相同的20-50ml YEB液體培養(yǎng)基中， 繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。4. 外植體的侵染及共培養(yǎng)1) 取煙草無菌葉片,切成 4 6mm 的葉盤到無菌瓶中,加入農(nóng)桿菌菌液,感染10min ,期間輕微振蕩,取出外植體用無菌濾紙吸去附著的菌液。2) 將浸染過的外植體接種在分化培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)2d4d 。5篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到含 cef 300mg/l和50mg/L Kan分化培養(yǎng)基上，25 C ,光照培養(yǎng)。每隔 3-4周繼代一次 ，,待轉(zhuǎn)化后的外植體長(zhǎng)出大量叢生芽。6生根培養(yǎng) :培養(yǎng)篩選的抗性芽長(zhǎng) 11.5cm 時(shí),從基部將芽切下, 并轉(zhuǎn)入含有 300mg/L Cef 和 50