生物科學(xué)畢業(yè)論文梨花粉水孔蛋白初探

1、所在院系：專 業(yè)：姓 名：學(xué) 號：指導(dǎo)教師： 本科生畢業(yè)論文本科生畢業(yè)論文(設(shè)計(jì)設(shè)計(jì))題目：梨花粉水孔蛋白初探 生物科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 生物科學(xué) 范洪剛 0810910005 徐 國 華論文完成日期： 2012 年 5 月 目目 錄錄摘要 .3關(guān)鍵詞 .3英文摘要. .3英文關(guān)鍵詞 .3一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制方法 .3（一）實(shí)驗(yàn)材料 .3（二）主要試劑及配制方法 .4-5二、實(shí)驗(yàn)步驟及方法 .5三、實(shí)驗(yàn)中遇到的問題及解決辦法 .5（一）peg4000 藥品用量問題.5（二）每一份花粉培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液體積的問題 .5（三）關(guān)于花粉發(fā)后離心所需要的轉(zhuǎn)速問題 .5（四）關(guān)于熒光顯微鏡的使用方法 .5（五）

2、關(guān)于染色劑選擇的問題 .5-6（六）關(guān)于培養(yǎng)溫度和滲透壓問題 6 (七) 關(guān)于花粉涂抹的問題.6（八）關(guān)于封片的一些問題 .6（九）關(guān)于花粉的選擇問題 6四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論 .6五、 參考文獻(xiàn) .6-7致謝 .7梨花粉水孔蛋白初探梨花粉水孔蛋白初探范洪剛 pb0810910005江蘇教育學(xué)院生物系摘要：摘要：梨花粉在不同滲透壓下萌發(fā)率和花粉管長度會發(fā)生變化，在半抑制條件的滲透壓下，水孔蛋白的抑制劑和激活劑處理花粉培養(yǎng)基，會影響花粉萌發(fā)率及花粉管長度。在半抑制條件下，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的抑制劑會降低萌發(fā)率，花粉管長度變短，適當(dāng)濃度的激活劑會提高花粉萌發(fā)率及增加花粉管長度，說明水孔蛋白的

3、活性在一定程度上影響花粉的萌發(fā)率和花粉管長度的伸長。本文通過熒光顯微鏡觀察花粉萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中一些問題，并舉出一些解決辦法。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：水孔蛋白； 梨；花粉萌發(fā)率；花粉管長度；熒光標(biāo)記abstract: the pear flower powder in different osmotic pressure and pollen tube length under germination ratio can produce change, in half of the conditions of the inhibition osmotic pressure, the hole of t

4、he inhibitors and activate protein processing agent pollen culture medium, can affect pollen germination rate and pollen tube length. in the half inhibit conditions, with appropriate in culture of the concentration of the inhibitors reduce germination rate, pollen tube length are short and the appro

5、priate concentration activation agent can improve the pollen germination rate and increase the pollen tube length, the protein that hole activity in the impact on pollen germination rate and elongation of pollen tube length. this article through the fluorescence microscopeobserve pollen germination

6、experiment, find some of these issues, and given a some solutions.keywords: water holes protein; pear; pollen germination rate; pollen tube length; fluorescent marker很早以前,人們認(rèn)為水分是以自由擴(kuò)散的方式進(jìn)出細(xì)胞的,后來注意到動植物的一些器官、組織具有獨(dú)特的水分運(yùn)轉(zhuǎn)能力，例如: 動物的紅細(xì)胞和腎上皮細(xì)胞,它們運(yùn)輸水分的速度遠(yuǎn)非只憑擴(kuò)散運(yùn)輸所能解釋的,人的腎臟細(xì)胞平均每晝夜要過濾180l的水，植物在種子萌發(fā)及花粉管伸長時(shí)要伴隨著由

7、體積增大而發(fā)生的水分快速吸收,這些現(xiàn)象均使人們猜測是否有介導(dǎo)水分運(yùn)輸?shù)目椎来嬖凇?0世紀(jì)90年代初,wayne 等指出在植物的質(zhì)膜上存在著水分運(yùn)輸通道。1992年preston等第一次分離出具有水分運(yùn)輸特性的蛋白chip28( channel-formingprotein of 28 ku) ,它是紅細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)在蛋白,在質(zhì)膜上形成水分選擇性運(yùn)輸通道,1997年被基因組命名委員會重命名為aqp1。aqp1 的發(fā)現(xiàn),掀起了人們分離、鑒定水孔蛋白( 亦稱水通道蛋白) 的高潮。短短幾年內(nèi),人們已在細(xì)菌、酵母、動物、植物中分離出許多水孔蛋白同源基因。在植物中第一個(gè)水孔蛋白tip是由maure 等于199

8、3 年從擬南芥中分離出來的。tip的crna 在爪蟾卵母細(xì)胞( xenopus oocytes) 中的異源表達(dá),證明它具有水分運(yùn)輸特性,屬于植物水孔蛋白中的液胞膜內(nèi)在蛋白(tonoplas-t membrane intrinsic protein,tip)。植物質(zhì)膜內(nèi)在蛋白( plasma membrane intrinsic protein, pip)也是在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)的，kammerloher 等( 1994)用擬南芥根質(zhì)膜內(nèi)在總蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清來免疫篩選( immunoscreening) 擬南芥根cdna文庫, 得到了幾個(gè)陽性克隆, 經(jīng)鑒定為植物質(zhì)膜水孔蛋白。水孔蛋白與198

9、4 年gorin 等從牛晶體纖維( bovine lens fiber)細(xì)胞膜中分離到的mip 基因(major intrinsic protein)具有很高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性, 因此將它們同歸于mip 家族,分子質(zhì)量在26 29 ku 之間, 在生物膜中形成水通道并攜助水分跨膜運(yùn)輸?shù)哪?nèi)在蛋白。絕大多數(shù)水孔蛋白形成水的選擇性通道, 但也有一些水孔蛋白同時(shí)也可運(yùn)輸小分子中性親水溶質(zhì)。一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制方法一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制方法（一）實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)用梨品種豐水和翠冠花粉為試材，采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院梨園。成熟的花藥采下包裹于稱量紙中置密閉的硅膠瓶中常溫干燥 1 d 后置- 20

10、冰箱中保存?zhèn)溆?。（二）主要試劑及配制方?.花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)基：（母液一：濃縮十倍）mes(g)蔗糖（g）硼酸（g）硝酸鈣（g）水（ml）2.9350.000.050.1550.00激活劑 -巰基乙醇:(取六支試管分別標(biāo)記 100%、10%、1%、0.1%、0.01%、o.oo1%對應(yīng)加入母液 -巰基乙醇逐級稀釋加入)抑制劑氯化汞：（配置 10mmol/l、1mmol/l、0.1mmol/l、0.01mmol/l、0.001mmol/l）peg4000+peg6000 配置 11 份。 （母液二）peg4000(g)peg6000(g)水（ml）5.000.187518花粉培養(yǎng)編號培養(yǎng)皿 11

11、11234567891011母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇100%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇10%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇1%2.5ml 加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇0.1%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇0.01%2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +-巰基乙醇0.001%2.5ml 加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +氯化汞10mmol/l2.5ml加水定容至25ml母液

12、一2.5ml+ +母液二+ +氯化汞1mmol/l2.5ml 加水定容至25ml母液一2.5ml+ +母液二+ +氯化汞0.1mmol/l2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +氯化汞0.01mmol/l2.5ml加水定容至25ml母液一2.5ml+ +氯化汞0.001mmol/l2.5ml 加水定容至25ml2.熒光顯微觀察主要試劑配制方法50%甘油分析純 40ml:量筒分別量取 20ml pipes 和甘油，將兩種液體在試劑瓶中混勻既得所需溶液。4冰箱保存待用。4%多聚甲醛（用 50mmpipes 試劑配制）分析純 50ml:計(jì)算得配制 50ml 的 4%多聚甲醛溶液所需多聚甲醛

13、質(zhì)量為 2g，分析天平稱取 2g 多聚甲醛加入 45ml 蒸餾水在水浴鍋中將其溶解，將溶液轉(zhuǎn)移入 50ml 容量瓶中加蒸餾水定容至 50ml 混勻既得所需溶液。4冰箱保存待用。磷酸緩沖液（pbs） ph 7.4 200ml:磷酸緩沖液由磷酸二氫鉀和氫氧化鈉配制，分析天平稱取 1.36g 磷酸二氫鉀加入 79ml0.1mol/l 氫氧化鈉中溶解，將溶液轉(zhuǎn)移入 200ml 容量瓶中加蒸餾水定容至 200 ml 混勻既得所需溶液。4冰箱保存待用。染色液的配制：染色液用的緩沖液配制，其中加入終濃度質(zhì)量比的二甲基亞砜，終濃度的乙二醇二乙醚二胺四乙酸，終濃度質(zhì)量體積比的蔗糖，再加入終濃度的異硫氰酸熒光素標(biāo)

14、記的鬼筆環(huán)肽；二、實(shí)驗(yàn)步驟及方法二、實(shí)驗(yàn)步驟及方法取出在-20下保存的豐水花粉，放在室溫下 2 小時(shí)，取出培養(yǎng)皿，在編號一至十一的培養(yǎng)皿中均勻的涂抹花粉，放入 20培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置一組對照組 12（沒有添加激活劑或者抑制劑，且在正常滲透壓下） 。1. 在花粉培養(yǎng)一小時(shí)后，用移液器分別取出 1ml 培養(yǎng)基液體，放入標(biāo)記好的 1.5ml 離心管，編號 1h1、1h2、1h12。2用離心機(jī)進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速設(shè)置為 8000，時(shí)間 4min，用移液器小心吸盡培養(yǎng)液。3.固定：將花粉在 4%多聚甲醛固定液中室溫固定一小時(shí)。4.分別重復(fù)步驟 13 將 2h-7h 的花粉固定。5.洗滌：用 50mmpip

15、es 緩沖液洗兩次，每次十分鐘6.用 pbs 緩沖液沖洗一次，10min7.染色：將花粉在染色液中黑暗處理 0.51h8.封片及封邊：以 50%甘油封片，透明指甲油封邊，熒光顯微鏡(zeiss，axiovert 40 cel)觀察，采集圖片。三、三、實(shí)驗(yàn)中遇到的問題及解決辦法實(shí)驗(yàn)中遇到的問題及解決辦法1.peg4000 藥品用量問題由于花粉培養(yǎng)基中配置所需要的 peg4000 的量比較大，如果直接加入，所購買的藥品量不夠，因此，通過和指導(dǎo)老師交流找到了解決辦法，在剛開始配置花粉培養(yǎng)母液時(shí)不加入peg4000，等到最后一步配制花粉培養(yǎng)最終培養(yǎng)基時(shí)加入，每一份僅需 5g，這樣大量減少了其使用的量，

16、既避免了浪費(fèi)，又可以使實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行下去。2.每一份花粉培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液體積的問題 第一次做的時(shí)候，取花粉培養(yǎng)液進(jìn)行離心時(shí)，取到第四個(gè)小時(shí)之后，培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液基本減少完畢，不能夠繼續(xù)做剩下的第 5、6、7 小時(shí)的花粉離心固定，因此通過計(jì)算，通過增加花粉培養(yǎng)液體積，最終每次培養(yǎng)用 25ml 培養(yǎng)液。經(jīng)過實(shí)踐可以得到 17 小時(shí)的，并且還有足量的剩余。3.關(guān)于花粉發(fā)后離心所需要的轉(zhuǎn)速問題 剛開始參照花粉熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中提到低速離心，用的四 40rpm，30s。但是離心下來之后基本上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的沉淀，通過詢問老師，又加長了離心的時(shí)間和次數(shù)，40rpm，5min三次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉淀的效果仍然不明顯，于是我

17、又查閱了一些資料將知道問題出在轉(zhuǎn)速的問題上，于是我將轉(zhuǎn)速調(diào)到了 120rpm，80rpm，60rmp。最終發(fā)現(xiàn) 120rpm 的效果最明顯，80rpm 的效果也很不錯(cuò)，但是在 120rpm 時(shí)沉淀物不夠純凈。因此最終確定了離心的轉(zhuǎn)速80rpm。4.關(guān)于熒光顯微鏡的使用方法1打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮點(diǎn)。 2用低倍鏡白光觀察，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。 3選擇合適的激發(fā)光和濾光片。 4觀察。 使用中應(yīng)注意：末裝濾光片不要用眼直接觀 察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒光的特殊鏡頭油；5.關(guān)于染色劑選擇的問題參照文獻(xiàn)一開始選擇了染色劑為 trtitc

18、pholloidin，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，又無法找到其母液具體的配制方法，因此最終選擇放棄，后來又查閱了南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張紹鈴等的專利一種梨花粉及花粉管微絲骨架的熒光標(biāo)記方法選擇了其染色液配制方法。在藥品的購買的過程當(dāng)中，知道其 0.1mg 藥品需要的價(jià)格為 3000，所要的花費(fèi)太大，因此沒有購買。6.關(guān)于培養(yǎng)溫度和滲透壓問題 培養(yǎng)溫度的選擇是根據(jù)劉靜等學(xué)姐梨花粉水孔蛋白初探中的花粉培養(yǎng)對照實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論 20為其最適培養(yǎng)溫度，0.5 mmol/l 聚乙二醇時(shí)，萌發(fā)率為正常情況下的一半。顧本實(shí)驗(yàn)對豐水花粉選擇的溫度為 20，半抑制滲透壓為 0.5mmol/l 的聚乙二醇。7.關(guān)于花粉涂抹的問題 由于

19、要進(jìn)行離心處理，且所需要移取多，因此，在前兩次實(shí)驗(yàn)，花粉量過少，導(dǎo)致離心觀察花粉濃度不夠，所以在涂抹的時(shí)候應(yīng)該涂抹整個(gè)培養(yǎng)液表面。8.關(guān)于封片的一些問題 免疫熒光要注意避光，因?yàn)樗羌す饧ぐl(fā)，需要在暗室里進(jìn)行。封片后最好立即去拍照，實(shí)在不行，可以選擇抗猝滅的封閉液，貌似 invitrogen 有，不過不便宜！可以選擇在 4 度避光保存，時(shí)間 24h 之內(nèi)拍照最好。9.關(guān)于花粉的選擇問題 一開始取的是南農(nóng)的材料，是 2010 年的，因此在開始的實(shí)驗(yàn)過程出現(xiàn)了一些花粉萌發(fā)率低甚至沒有萌發(fā)的情況，后來，指導(dǎo)老師又去采取了新的花粉，實(shí)驗(yàn)效果顯著，萌發(fā)率，明顯提升。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

20、與討論花粉落到柱頭上以后，開始進(jìn)行水合萌發(fā)花粉管，花粉的萌發(fā)率和花粉管的伸長與梨自交的效率有著直接的關(guān)系。花粉隨時(shí)間的積累萌發(fā)率逐漸升高，花粉管長度也是逐漸增長，一般在 6 h 左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，但期間也會有起伏變化，因?yàn)橛行┗ǚ酃艹霈F(xiàn)破損情況，且花粉管破損率隨時(shí)間增加而增高。 培養(yǎng)基中含有 20%聚乙二醇，控制花粉萌發(fā)情況，不同濃度的聚乙二醇可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中滲透壓。當(dāng)花粉萌發(fā)率是正常滲透壓情況下的一半時(shí)即為半抑制狀態(tài)。在半抑制狀態(tài)下滲透壓中培養(yǎng)加入不同濃度的水孔蛋白的激活劑 -巰基乙醇和抑制劑氯化汞，抑制劑抑制花粉的萌發(fā)，而激活劑促進(jìn)花粉的萌發(fā)。水孔蛋白抑制劑降低水孔蛋白活性，降低水的通透性，花粉萌發(fā)率降低?；ǚ酃荛L度減小。水孔蛋白激活劑可以提高水孔蛋白活性，增加水的通透性，花粉萌發(fā)率增加，花粉管長度增加。本實(shí)驗(yàn)通過水孔蛋白抑制劑和激活劑處理梨花粉細(xì)胞，表明水孔蛋白抑制劑和激活劑會影響花粉的萌發(fā)情況，花粉細(xì)胞水孔蛋白活性被抑制，花粉萌發(fā)率降低；而水孔蛋白活性恢復(fù)，花粉萌發(fā)率也隨之恢復(fù)。這些結(jié)果初步表明：aqps 可能參與了梨花粉萌發(fā)和花粉管伸長的過程。五參考文獻(xiàn)五參考文