級基因表達載體構建PPT課件

1、課前復習課前復習四個步驟四個步驟 指指？3.3.獲取目的基因方法：獲取目的基因方法：3 3個個酶有酶有? ?PCRPCR技術技術的的名稱、原理、過程名稱、原理、過程第1頁/共42頁 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第2頁/共42頁學習目標學習目標1 1知道、識圖基因知道、識圖基因表達載體構成表達載體構成2. 2. 概述概述基因表達載體的構建過程基因表達載體的構建過程學法指導學法指導獨立思考獨立思考積極討論積極討論規(guī)范展示規(guī)范展示精彩點評精彩點評鼓勵質疑鼓勵質疑第3頁/共42頁課前預習核對答案課前預習核對答案 一、一、1.1.構建基因表達載體構建基因表達載體2.2.穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在

2、下一代，使目的基因表達發(fā)揮作用下一代，使目的基因表達發(fā)揮作用3.3.標記基因標記基因 啟動子啟動子 目的基因目的基因 終止子終止子 復制原點復制原點首端首端 RNARNA聚合酶聚合酶 蛋白質蛋白質DNADNA短片段短片段 尾端尾端 轉錄轉錄 脫氧核苷酸脫氧核苷酸 含目的基因的受體細胞含目的基因的受體細胞 抗生素抗性基因抗生素抗性基因4.4.啟動子啟動子 終止子終止子 標記基因標記基因二、（一）二、（一）維持穩(wěn)定維持穩(wěn)定 表達表達 （二）（二）1.1. 雙子葉植物雙子葉植物 單子葉植物單子葉植物 T-DNAT-DNA 染色體的染色體的DNADNA TiTi質粒的質粒的T-DNAT-DNA上上 整

3、合整合 染色體染色體DNADNA(2)(2)金屬顆粒金屬顆粒 （3 3）抗蟲棉）抗蟲棉2.2.顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 雌雌 輸卵管輸卵管 子宮子宮 3.3.快快 單單 少少 鈣離子鈣離子 感受態(tài)感受態(tài) 感受態(tài)感受態(tài) 過程過程第4頁/共42頁基因表達載體的構建1.是基因工程的核心步驟2.目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)輝作用。3.基因表達載體的組成 啟動子 插入的目的基因 終止子 標記基因 復制遠點第5頁/共42頁 標記基因標記基因各部分的功能是什么？各部分的功能是什么？第6頁/共42頁思考：在基因表達載體中思考：在基因表達載體中,

4、 ,啟動子和終止子的位置是否可以互換啟動子和終止子的位置是否可以互換? ?試分析原因。試分析原因。不可以。啟動子是不可以。啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位聚合酶識別和結合的部位,使轉錄開始使轉錄開始;終止子位于基因的尾端終止子位于基因的尾端,使轉錄終止使轉錄終止;只有順序正確只有順序正確,目的基因才能正常轉錄。目的基因才能正常轉錄。第7頁/共42頁合作探究合作探究1 1 1.啟動子位于基因啟動子位于基因首端，首端，終止子位于基終止子位于基因因尾端，分別決定轉錄的開始和結束。尾端，分別決定轉錄的開始和結束。它們由脫氧核苷酸組成。起始密碼子和它們由脫氧核苷酸組成。起始密碼子和終止密碼子位于終止

5、密碼子位于mRNA上，分別決定翻上，分別決定翻譯的開始和結束。它們由核糖核苷酸組譯的開始和結束。它們由核糖核苷酸組成。成。第8頁/共42頁基因表達載體的構建基因表達載體的構建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出露出_。（2 2）用）用_切斷目切斷目 的基因，使其產生的基因，使其產生_ _ _。（3 3）將切下的目的基因片段插入質粒的）將切下的目的基因片段插入質粒的_處，再加入適量處，再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端

6、的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同4.4.過程過程: :第9頁/共42頁 GAATTCGAATTC目的基因目的基因1CTTAAG載體載體1酶酶1酶酶1酶酶1第10頁/共42頁1.1.自身環(huán)化（包括自身環(huán)化（包括目的基因環(huán)化目的基因環(huán)化，質粒再環(huán)化質粒再環(huán)化）2.2.兩個兩個DNADNA片段連接時有：片段連接時有：載體載體-載體連接物；目的基因載體連接物；目的基因-載體連接物；目的基因載體連接物；目的基因-目的基因連接目的基因連接物物 3.3.反向連接反向連接一種限制酶切割構建基因表達載體時可能出現(xiàn)：一種限制酶切割構建基因表達載體時可能出現(xiàn)：如何防止自身環(huán)化與反向連接？如何防止自

7、身環(huán)化與反向連接？可選用兩種不同的酶同時切割可選用兩種不同的酶同時切割第11頁/共42頁GAATTCAAAGCTTT目的基因目的基因3TTTCGAAA黏性末端黏性末端-TCGA-CTTAAG黏性末端黏性末端-TTAA-酶酶3酶酶1酶酶1酶酶3第12頁/共42頁同種限制同種限制同（一或兩）種限制同（一或兩）種限制DNADNA連接連接第13頁/共42頁質粒質粒DNADNA分子分子一個一個切口切口兩個兩個黏性末端黏性末端兩個兩個切口切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種同一種 限制酶限制酶第14頁/共42頁基因表達載體的構建

8、1.是基因工程的核心步驟2.目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)輝作用。3.基因表達載體的組成 啟動子 插入的目的基因 終止子 標記基因 復制遠點第15頁/共42頁檢測檢測 1. C 2. C 3.（1）Ti質粒質粒 T-DNA 攜帶外源基因攜帶外源基因的的DNA 表達載體（含有目的基因的重組表達載體（含有目的基因的重組Ti質粒）質粒） 含有重組質粒的土壤農桿菌含有重組質粒的土壤農桿菌 （2）構建表達載體）構建表達載體 植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng) （3）75 50 減輕農藥對環(huán)境的污染，減輕農藥對環(huán)境的污染，防止農藥危害人體健康。防止農藥危害人

9、體健康。第16頁/共42頁練習案3答案1.1.（1 1）目的基因）目的基因載體連接物載體連接物 載體載體-載體連載體連接物接物 目的基因目的基因-目的基因連接物目的基因連接物 分離純化分離純化 （2 2）載體）載體-載體連接物載體連接物 目的基因目的基因-載體連載體連接物、載體接物、載體-載體連接物載體連接物 （3 3）啟動子）啟動子 mRNA mRNA（4 4）EcoRIEcoRI和和BamHIBamHI2.2.（1 1）.NgoMIV .NgoMIV （2 2）.ABD .ABD （3 3）.ABC .ABC （4 4）.B.B第17頁/共42頁1、（多選）一個基因表達載體的構建應包括、（

10、多選）一個基因表達載體的構建應包括A目的基因目的基因 B啟動子啟動子 C終止子終止子 D標記基因標記基因ABCD2、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是A啟動子是與啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B啟動子和終止子都是特殊結構的啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對短片段，對mRNA的轉錄起調控作用的轉錄起調控作用C標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別基因表達載體的構建視受體細

11、胞及導入方式不同而有所差別A3、目前轉基因工程可以、目前轉基因工程可以A. 打破地理隔離但不能突破生殖隔離打破地理隔離但不能突破生殖隔離B. 打破生殖隔離但不能突破地理隔離打破生殖隔離但不能突破地理隔離C. 完全突破地理隔離和生殖隔離完全突破地理隔離和生殖隔離D. 部分突破地理隔離和生殖隔離部分突破地理隔離和生殖隔離 C第18頁/共42頁類別類別項目項目 復制復制 轉錄轉錄場所場所特點特點模板模板原料原料酶酶能量能量堿基堿基配對配對產物產物細胞核細胞核只有只有DNA的一條鏈的一條鏈四種核糖核苷酸四種核糖核苷酸RNA聚合酶聚合酶ATPA-U C-G T-A G-C細胞核細胞核DNA的兩條鏈的兩條

12、鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶ATPA-T C-G T-A G-C兩個雙鏈兩個雙鏈DNADNA分子分子一條單鏈一條單鏈mRNAmRNA邊解旋邊復制，邊解旋邊復制，半保留復制半保留復制邊解旋邊轉錄邊解旋邊轉錄第19頁/共42頁 目的基因插入目的基因插入TiTi質粒的質粒的T-DNAT-DNA上上 農桿菌農桿菌 導入植物細胞導入植物細胞 整合到受體細胞的染色體上整合到受體細胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達 1. 1.農桿菌特點：農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。易感染雙子葉植物和裸子植物。TiTi質

13、粒的質粒的T-T-DNADNA可轉移至受體細胞的染色體上可轉移至受體細胞的染色體上2.轉轉化化第20頁/共42頁第21頁/共42頁基因組文庫的建立方法基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部提取某種生物的全部DNADNA用適當?shù)南拗泼该盖杏眠m當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉囊欢ù笮〉腄NADNA片段片段將將DNADNA片段與運載體連接片段與運載體連接導入受體菌中儲存（導入受體菌中儲存（基因組文庫）基因組文庫）目的基因目的基因分離分離第22頁/共42頁部分基因文庫的建立方法部分基因文庫的建立方法 mRNA mRNA反轉錄酶反轉錄酶單鏈單鏈DNADNA合成合成 雙鏈雙鏈DNADNA（cDNAcDNA） 載體

14、載體插入插入導入導入受體菌群（受體菌群（ cDNA文庫）文庫）分離分離目的基因目的基因第23頁/共42頁cDNA合成過程合成過程 第一步：反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的 DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降 解，使之變成單鏈的DNA。第三步：以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合 成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。 第24頁/共42頁1.下表關于基因工程中有關基因操作下表關于基因工程中有關基因操作的名詞及對應的內容，正確的組合是的名詞及對應的內容，正確的組合是2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于

15、獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉錄形成從基因組文庫中提取反轉錄形成從基因組文庫中提取從受體細胞中提取從受體細胞中提取 利用利用PCRPCR技術技術 利用利用DNADNA轉錄轉錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.第25頁/共42頁3.細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作細菌的質粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是用是 A提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B有利于對目的基因是否導入進行檢測C增加質粒分子的分子量D便于與外源基因連接4.4. 有關基因工程的敘述正確的是有關基因工程的敘

16、述正確的是A限制酶只在獲得目的基因時才用B重組質粒的形成是在細胞內完成的C質粒都可作為運載體 D蛋白質的結構可為合成目的基因提供資料第26頁/共42頁第27頁/共42頁7、構建基因組、構建基因組DNA文庫時，首先應分離細胞的文庫時，首先應分離細胞的A、染色體、染色體DNA B、線粒體、線粒體DNAC、總、總mRNA D、tRNA 8、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導入某個生

17、物片段，導入某個生物 體內，則這個生物就是一體內，則這個生物就是一個基因文庫個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫文庫AC第28頁/共42頁9、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為分子片段為ATGTGTACAC，要使其數(shù)量增多，可用，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術進行人工復制，復制時應給予的條件是技術進行人工復制，復制時應給予的條件是 雙鏈雙鏈DNA分子為模板分子為模板 ATGTG或或T

18、ACAC模板鏈模板鏈 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 四種核四種核苷酸苷酸 DNA聚合酶聚合酶 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNA聚合酶引物聚合酶引物 溫度變化溫度變化 恒溫恒溫A BC DD10、在基因工程中，把選出的目的基因（共、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是核苷酸是460個）放入個）放入DNA擴增儀中擴增擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核代，那么，在擴增儀中應放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是苷酸的個數(shù)是B第29頁/共42頁11、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是、在已知序列信息的情況下，獲取目的基

19、因的最方便方法是A、化學合成法、化學合成法 B、基因組文庫法、基因組文庫法C、cDNA文庫法文庫法 D、聚合酶鏈反應、聚合酶鏈反應12、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因 利用利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因 反轉錄法反轉錄法 通過通過DNA合成儀利用化學方法人工合成合成儀利用化學方法人工合成A B C DAD第30頁/共42頁13、目的基因主要是指、目的基因主要是指_的結構基因。獲得目的基因的常見方法有的結構基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據基因

20、的）從基因文庫中獲取目的基因，根據基因的_序列，基因在序列，基因在_上的位置，基因的上的位置，基因的_產物產物mRNA，基因的，基因的_產物蛋白質等獲產物蛋白質等獲取目的基因。（取目的基因。（2）利用）利用PCR技術擴增目的基因，該技術是一項在技術擴增目的基因，該技術是一項在_完成的核完成的核酸合成技術，前提條件是有一段已知目的基因的酸合成技術，前提條件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成序列，以便于合成_。（。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過_方法。方法。 編碼蛋白質編碼蛋白質核苷酸核苷酸染色體染色體轉錄轉錄表達表達體外體外核苷酸核苷酸

21、引物引物人工合成人工合成第31頁/共42頁14、（多選）一個基因表達載體的構建應包括、（多選）一個基因表達載體的構建應包括A目的基因目的基因 B啟動子啟動子 C終止子終止子 D標記基因標記基因ABCD15、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是、下列關于基因表達載體的敘述不正確的是A啟動子是與啟動子是與RNA聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼聚合酶識別和結合的部位，是起始密碼B啟動子和終止子都是特殊結構的啟動子和終止子都是特殊結構的DNA短片段，對短片段，對mRNA的轉錄起調控作用的轉錄起調控作用C標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從

22、而便于篩選D基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別基因表達載體的構建視受體細胞及導入方式不同而有所差別A16、目前轉基因工程可以、目前轉基因工程可以A. 打破地理隔離但不能突破生殖隔離打破地理隔離但不能突破生殖隔離B. 打破生殖隔離但不能突破地理隔離打破生殖隔離但不能突破地理隔離C. 完全突破地理隔離和生殖隔離完全突破地理隔離和生殖隔離D. 部分突破地理隔離和生殖隔離部分突破地理隔離和生殖隔離 C第32頁/共42頁17、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是、基因工程中科學家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是 A結構簡單、操作方便結構簡單、操作方便

23、 B繁殖速度快繁殖速度快 C遺傳物質含量少、簡單遺傳物質含量少、簡單 D性狀穩(wěn)定、變異少性狀穩(wěn)定、變異少18、基因工程常用的受體細胞有、基因工程常用的受體細胞有 大腸桿菌大腸桿菌 枯草桿菌枯草桿菌 支原體支原體 動植物細胞動植物細胞A B C DBD19、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不分子水平上進行設計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是進行堿基互補配對的步驟是C第33頁/共42頁20. 采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導入目的基因的做法正確的是將毒素蛋白質

24、注射到棉受精卵中將毒素蛋白質注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中 將編碼毒素蛋白的將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中序列與細菌質粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中 將將編碼毒素蛋白的編碼毒素蛋白的DNA序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)序列與質粒重組，導入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)A B C DC21. 下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是下列屬于基因工程中導入目的基因方法的是農桿菌轉化法農桿菌轉化法 基因槍法基因槍法 花粉管道法花粉管道法 顯微注射法顯微注射法 胚胎

25、移植胚胎移植 DNA分子分子雜交法雜交法A BC DC第34頁/共42頁第35頁/共42頁2525、（、（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產人類胰島素，這一過程涉及到（多選）人們利用基因工程的方法，用大腸桿菌生產人類胰島素，這一過程涉及到（ ）D.篩選出能產生胰島素的篩選出能產生胰島素的“工程菌工程菌” 2626、下列哪項不屬于基因工程技術的步驟下列哪項不屬于基因工程技術的步驟 （ ） A基因轉移基因轉移 B基因擴增基因擴增C基因檢測基因檢測 D基因表達基因表達 第36頁/共42頁 嘗試設計嘗試設計 第37頁/共42頁思考探究思考探究思考：思考：作為基因工程表達載體，只作為基因工程表

26、達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？為什么？第38頁/共42頁不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：必須構建上述元件的主要理由是：（1） 生物之間進行基因交流，只有使用生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2） 通過通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將

27、編碼文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；序列導入受體生物中無法轉錄；（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；他調控元件，如增強子等；（5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。因與標識基

28、因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。第39頁/共42頁思考與探究：思考與探究：2.根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理,你能分你能分析出不能導入單子葉植物的原因嗎析出不能導入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因導若將一個抗病基因導入小麥中入小麥中,理論上講你應該怎樣做理論上講你應該怎樣做?要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導的物質，一般為乙要加趨化和誘導的物質，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（酰丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的趨化性）和激活農桿菌的Vir區(qū)（誘導）的基因，使區(qū)（誘導）的基因，使T-DNA轉轉移并插入到染色體移并插入到染色體DNA上。上。3.3.利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯(lián)系前面有關細胞器功利用