雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗

1、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗( Vero 細(xì)胞)Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimao ( Vero Xibao ) Haemorrhagic Fever with Renal SyndromeB ivalent Vaccine (Vero Cell), Inactivated本品系用型和型腎綜合征出血熱（簡稱出血熱）病毒分別接種 Vero 細(xì)胞， 經(jīng)培養(yǎng)、收獲、病毒滅活、純化，加入氫氧化鋁吸附后制成。用于預(yù)防 I 型和 II 型 腎綜合征出血熱。1 基本要求 生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符 “凡例”的有關(guān)要 求。2 制

2、造2.1 生產(chǎn)用細(xì)胞 生產(chǎn)用細(xì)胞為 Vero 細(xì)胞。2.1.1 細(xì)胞的管理及檢定應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。各種子 批代次應(yīng)不超過批準(zhǔn)的限定代次。取自同批工作細(xì)胞庫的 1 支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)增后的細(xì)胞僅用于一批疫 苗的生產(chǎn)。2.1.2 細(xì)胞制備取工作細(xì)胞庫的 1 支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)增至接種病毒的細(xì)胞為一批。將 復(fù)蘇后的單層細(xì)胞消化，分散成均勻的細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后混合均勻，置37培養(yǎng)3-4 天，成均勻單層細(xì)胞。2.2 毒種2.2.1 名稱及來源 生產(chǎn)用毒種為分離自腎綜合征出血熱病人血清中的 I 型出血熱病毒 SD9805株和 II 型出血熱病毒 H

3、B9908株， 或其他經(jīng)批準(zhǔn)的出血熱 I 型和 II 型毒株。2.2.2 病毒種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版中國藥典三部 通則中“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī) 程”規(guī)定出血熱毒種 SD9805株和 HB9908株的原始種子批代次均為鼠腦第 3 代。原始種 子批毒種經(jīng) Vero 細(xì)胞傳代分別建立主種子批和工作種子批。 I 型出血熱毒種 SD9805 株主種子批應(yīng)不超過第 9 代，工作種子批應(yīng)不超過第 14 代；II 型出血熱毒種 HB9908 株主種子批應(yīng)不超過第 8 代，工作種子批應(yīng)不超過第 13。2.2.3 種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)進(jìn)行以下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進(jìn)行 2.2.3.1-2.2

4、.3.4 項(xiàng)檢 定。2.2.3.1 鑒別試驗(yàn)將各型毒種 10 倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度分別與已知的相應(yīng)型別的出血熱病毒血 清參考品等量混合，同時(shí)以正常兔血清做空白對(duì)照。分別置 37水浴 90分鐘，接種 Vero-E6單層細(xì)胞，于 37 CO2 濃度為 5%條件下培養(yǎng) 10-14 天，以免疫熒光法測(cè)定， 中和指數(shù)應(yīng)大于 1000。2.2.3.2 病毒滴定將各型毒種 10倍系列稀釋，取適宜稀釋度接種 Vero-E 6細(xì)胞，于 33培養(yǎng) 10-12 天，采用免疫熒光法進(jìn)行測(cè)定，病毒滴度均應(yīng)不低于 7.0lgCCID 50/ml 。2.2.3.3 無菌檢查依法檢查（附錄 XII A ），應(yīng)符合規(guī)定。2.

5、2.3.4 支原體檢查依法檢查（附錄 XII B ），應(yīng)符合規(guī)定。2.2.3.5 病毒外源因子檢查依法檢查（附錄 XII C ），應(yīng)符合規(guī)定。2.2.3.6 免疫原性檢查取主種子批毒種制備雙價(jià)原疫苗，接種 2kg 左右的白色家兔（家兔血清出血熱 病毒抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性） ，每批 4 只，后腿肌肉注射 1.0ml ， 7 天后以同法再免疫一 次。第一次免疫后 4 周采血分離血清，用空斑減少中和試驗(yàn)測(cè)中和抗體，中和用病 毒為出血熱病毒 76-118 株和 UR株，同時(shí)用血清參考品作對(duì)照（應(yīng)符合參考血清效 價(jià)的標(biāo)示值），4只家兔的 I 型和 II 型出血熱中和抗體滴度均應(yīng)不低于 1：10。2.2. 4

6、 毒種保存凍干毒種保存于 - 20以下，液體毒種應(yīng)置 - 60以下保存。2.3 單價(jià)原液2.3.1 細(xì)胞制備按 2.1.2 項(xiàng)進(jìn)行。2.3.2 培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為含 10%滅能新生牛血清的 MEM。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合現(xiàn)行版中國 藥典三部的要求。人血白蛋白的質(zhì)量應(yīng)符合現(xiàn)行版中國藥典三部的要求。2.3.3 對(duì)照細(xì)胞病毒外源因子檢查依法檢查（附錄 XII C ），應(yīng)符合規(guī)定。2.3.4 病毒接種、培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)成致密單層后， 按 0.02-0.002MOI 分別接種出血熱病毒 I 型和 II 型毒種（每個(gè)型別的同一工作種子批毒種應(yīng)按同一 MOI 接種）， 置適宜的溫度下培 養(yǎng)一定時(shí)間后， 棄去培養(yǎng)

7、液， 用 PBS沖洗去除牛血清， 加入適量的維持液， 置 33- 35繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。2.3.5 病毒收獲 繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，收獲病毒液。根據(jù)細(xì)胞情況，可換以維持液繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn) 行多次收獲病毒液。 同一細(xì)胞批的同一次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單次病 毒收獲液。236 單次病毒收獲液檢定按 3.1.1 3.1.4 項(xiàng)進(jìn)行。237 單次病毒收獲液保存于 2- 8°C保存不超過 30 天。2.3.8 病毒滅活病毒收獲液中按 1：4000 的比例加入 - 丙內(nèi)酯（應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi) 進(jìn)行病毒滅活），置適宜溫度、在一定的時(shí)間內(nèi)滅活病毒， 并于適宜的溫度放置適 宜的時(shí)間，以確保

8、 - 丙內(nèi)酯完全水解。病毒滅活到期后， 每個(gè)滅活容器應(yīng)立即取 樣，分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。2.3.9 合并、超濾濃縮 同一細(xì)胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價(jià)病毒收獲液，并 進(jìn)行適宜的倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。2.3.10 純化 采用柱色譜法或其他適宜的方法進(jìn)行純化。純化后取樣進(jìn)行抗原量及蛋白含量 測(cè)定，加入適宜的穩(wěn)定劑， 即為原液。2.3.11 單價(jià)原液保存于 2- 8條件下保存。2.3.12 單價(jià)原液檢定按 3.2 項(xiàng)進(jìn)行。2.4 半成品2.4.1 配制將I 型和II 型出血熱病毒單價(jià)原液分別按抗原量為 1：128稀釋后等量混合， 加 入適宜濃度的穩(wěn)定劑及硫柳汞

9、作為防腐劑，并加入終濃度為 0.50mg/ml 氫氧化鋁佐 劑吸附后即為半成品。2.4.2 半成品檢定按 3.3 項(xiàng)進(jìn)行。2.5 成品2.5.1 分批 應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.5.2 分裝應(yīng)符合 “生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。2.5.3 規(guī)格每瓶 1.0ml 。每 1 次人用劑量為 1.0ml 。2.5.4 包裝 應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1 單次病毒收獲液檢定3.1.1 病毒滴定按 2.2.3.2 項(xiàng)進(jìn)行，病毒滴度應(yīng)不低于 6.5 lgCCID 50/ml 。3.1.2 無菌檢查依法檢查（附錄 XII A ），應(yīng)符合規(guī)定。3.1.3 支原體檢查 依法檢查（附錄

10、XII B ），應(yīng)符合規(guī)定。3.1.4 抗原量測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，應(yīng)不低于 1：643.1.5 病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn) 按滅活后的單次病毒收獲液總量的 0.1%抽取供試品，透析后接種 Vero-E6 細(xì)胞， 盲傳 3代，每 10-14 天傳 1代，每代以免疫熒光法檢查病毒抗原，結(jié)果應(yīng)均為陰性。3.2 單價(jià)原液檢定3.2.1 蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于 160g/ml （附錄 VI B 二法）。3.2.2 抗原量采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)不低于 1： 512。3.2.3 無菌檢查 依法檢查（附錄 XII A ），應(yīng)符合規(guī)定。3.2.4 牛血清蛋白殘留量應(yīng)不高于 50ng/ml （附錄 VIII F ）。3.2.

11、5 Vero 細(xì)胞 DNA殘留量應(yīng)不高于 100pg/ml （附錄 IX B）。3.3 半成品檢定3.3.1 無菌檢查 依法檢查（附錄 XII A ），應(yīng)符合規(guī)定。3.4 成品檢定3.4.1 鑒別試驗(yàn)按 2.2.3.6 項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。效價(jià)測(cè)定不合格時(shí)，鑒別試驗(yàn)不成立。3.4.2 外觀 應(yīng)為微乳白色混懸液體，含氫氧化鋁佐劑，久放形成可搖散的沉淀，不應(yīng)有其 他異物。3.4.3 裝量按附錄 I A 裝量項(xiàng)進(jìn)行， 應(yīng)不低于標(biāo)示量。3.4.4 化學(xué)檢定3.4.4.1 pH 值應(yīng)為 7.2 8.0 （附錄 V A ）。3.4.4.2 硫柳汞含量應(yīng)為不高于 50g/ml（附錄VII B ）。3.4.4.3 氫氧化鋁含量應(yīng)不高于 0.6mg/ml （附錄 VII F ）。3.4.4.4 抗生素殘留量檢查細(xì)胞制備過程中加入抗生素的應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查， 采用 ELISA 法，應(yīng)不高于 10ng/ml 。3.4.5 效價(jià)測(cè)定按 2.2.3.6 項(xiàng)進(jìn)行，四只家兔的 I 型和 II 型出血熱中和抗體滴度均應(yīng)不低于 1 ： 10。3.4.6 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)， 于 37放置 7 天，按 3.4.5 項(xiàng)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定， 如合格，視為效價(jià)測(cè)定合格。3.4.7 無菌檢查依法檢查（附錄