細(xì)胞爬片步驟

1、-作者xxxx-日期xxxx細(xì)胞爬片步驟【精品文檔】細(xì)胞爬片步驟PLL配制和處理（Sigma產(chǎn)品，武漢博士德分裝，10ml/瓶。4存放，有效期1年）(1) 儲(chǔ)存液：1:10稀釋液可以保存在4里，三個(gè)月內(nèi)仍然可以使用。稀釋、儲(chǔ)存和吸取多聚賴(lài)氨酸要使用塑料制品。工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液槍吸取0.3ml PLL3ml無(wú)菌去離子水，混勻放于10ml無(wú)菌塑料離心管中。封口模密封后4存放。 (2) 無(wú)菌處理：PLL不可以高溫消毒，故應(yīng)過(guò)濾除菌分裝于無(wú)菌處理的細(xì)胞凍存管內(nèi)，1ml/管，封口模密封，4保存。另外，準(zhǔn)備無(wú)菌去離子水50ml。多聚賴(lài)氨酸PLL包被（1）滅菌的去離子水(三蒸水)1:

2、10稀釋多聚賴(lài)氨酸溶液。（2）用之前將稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度維持在18-26。（3）將玻片浸在稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液5分鐘。（注意增加時(shí)間不會(huì)提高包被效果）。（4）將過(guò)濾除菌的多聚賴(lài)氨酸加入一個(gè)消毒好的培養(yǎng)皿(超凈臺(tái)內(nèi)操作)，然后將高壓滅菌的小玻片放到多聚賴(lài)氨酸內(nèi)浸泡5min，無(wú)菌晾干即可。（底面貼緊培養(yǎng)皿，存在包被PLL不好的可能，放入培養(yǎng)板孔內(nèi)注意正反面！）或者：鋪片于培養(yǎng)皿中，移液槍將PLL工作液滴加于玻片上，室溫10分鐘后，用消毒好的紗布條吸取玻片上的PLL液。在超靜臺(tái)內(nèi)風(fēng)干后使用，或者超靜臺(tái)內(nèi)過(guò)夜晾干，次日使用。或者：在60烘箱1小時(shí)干燥，或室溫18-26過(guò)夜干燥待用。

3、步驟：（1）準(zhǔn)備24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（消毒好的培養(yǎng)皿）（2）多聚賴(lài)氨酸PLL包被（3）培養(yǎng)板每孔中滴1滴培養(yǎng)基，然后將玻片置于液滴上，壓緊（通過(guò)表面張力的作用將玻片吸附于培養(yǎng)板上）（4）常規(guī)細(xì)胞消化，離心，重懸，將吹打的細(xì)胞懸液分別加到每個(gè)孔蓋玻片上，讓其貼壁生長(zhǎng)， 可以用移液槍加樣30l于蓋玻片上（5）24孔板做完細(xì)胞爬片后，再小心用鑷子將爬片取出，細(xì)胞面朝向載玻片，用中性樹(shù)膠封片，照相。（主張用20%-50%甘油封片，中性樹(shù)膠封的不好容易“花片”）（6）PBS洗滌，以去除血清等物質(zhì)。（接著做IC）細(xì)胞爬片方法與技巧爬片的準(zhǔn)備：1、爬片可用一般的蓋玻片，也可用專(zhuān)用爬片；2、應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己

4、的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；3、將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過(guò)夜，第二天先用自來(lái)水沖洗20遍，再用三蒸水沖洗3遍（個(gè)人認(rèn)為主要目的是沖洗干凈就可以了），放在飯盒或者培養(yǎng)皿（一定是玻璃的哦，要不然就）中烘干后進(jìn)行高壓消毒。培養(yǎng)板的準(zhǔn)備：1、 泡酸過(guò)夜2、 沖洗，烘干（1、2步驟與前大致相同）3、 放入超凈工作臺(tái)用紫外線照12小時(shí)就可以用了（在照之前可以將爬片一并放入，若細(xì)胞貼壁能力不強(qiáng)，可經(jīng)多聚賴(lài)氨酸浸片后放入。貼壁能力強(qiáng)的話，就可以省略了，進(jìn)行紫外線消毒）注： 此步自己的經(jīng)驗(yàn)是爬片可以先浸入消毒后的PBS內(nèi)，緊接著放入培養(yǎng)板內(nèi)。目的：浸過(guò)PBS的爬片依靠表面的液體，可以用培養(yǎng)板孔底貼和緊密，以利于細(xì)胞長(zhǎng)到爬片上。（自己剛開(kāi)始做的時(shí)候，經(jīng)常就是細(xì)胞全都長(zhǎng)在了爬片與培養(yǎng)板之間，爬片上細(xì)胞罕見(jiàn)