第六章 分子生物學(xué)研究法下 ppt課件

1、第六章第六章分子生物學(xué)研究法（下）分子生物學(xué)研究法（下）content一、基因表達研究技術(shù)一、基因表達研究技術(shù)content 1995 1995年年velculescuvelculescu等提出了基等提出了基因表達系列分析因表達系列分析(serial analysis (serial analysis of gene expression,sage)of gene expression,sage)技術(shù)，技術(shù)，能同時對上千個轉(zhuǎn)錄物進行研究。能同時對上千個轉(zhuǎn)錄物進行研究。a. a. 基因表達系列分析技術(shù)基因表達系列分析技術(shù)contentsagesage的主要依據(jù)有兩個。的主要依據(jù)有兩個。第一，一個

2、第一，一個9 91010堿基的短核苷酸序列標簽堿基的短核苷酸序列標簽包含有足夠的信息，能夠唯一確認一種轉(zhuǎn)錄包含有足夠的信息，能夠唯一確認一種轉(zhuǎn)錄物。例如，一個物。例如，一個9 9堿基順序能夠分辨堿基順序能夠分辨262144262144個不同的轉(zhuǎn)錄物個不同的轉(zhuǎn)錄物(4(49 9) )，而人類基因組估計僅，而人類基因組估計僅能編碼能編碼8000080000種轉(zhuǎn)錄物，所以理論上每一個種轉(zhuǎn)錄物，所以理論上每一個9 9堿基標簽?zāi)軌虼硪环N轉(zhuǎn)錄物的特征序列。堿基標簽?zāi)軌虼硪环N轉(zhuǎn)錄物的特征序列。第二，如果能將第二，如果能將9 9堿基的標簽集中于一個克堿基的標簽集中于一個克隆中進行測序，并將得到的短序列核苷

3、酸順隆中進行測序，并將得到的短序列核苷酸順序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計算機中進行處理，序以連續(xù)的數(shù)據(jù)形式輸入計算機中進行處理，就能對數(shù)以千計的就能對數(shù)以千計的mrnamrna轉(zhuǎn)錄物進行分析。轉(zhuǎn)錄物進行分析。content 以以biotinylated oligo(dt)biotinylated oligo(dt)為引物反為引物反轉(zhuǎn)錄合成轉(zhuǎn)錄合成cdnacdna； 以一種限制性內(nèi)切酶以一種限制性內(nèi)切酶( (錨定酶錨定酶 anchoring enzymeanchoring enzyme， ae)ae)酶切。酶切。 錨定酶要求至少在每一種轉(zhuǎn)錄物上有一個錨定酶要求至少在每一種轉(zhuǎn)錄物上有一個酶切位點，一般酶

4、切位點，一般4 4堿基限制性內(nèi)切酶能達到這種堿基限制性內(nèi)切酶能達到這種要求，因為大多數(shù)要求，因為大多數(shù)mrnamrna要長于要長于256256堿基堿基(4(44 4) )。 通過鏈霉抗生物素蛋白珠收集通過鏈霉抗生物素蛋白珠收集cdna3cdna3端部分。端部分。 對每一個對每一個mrnamrna只收集其只收集其polyapolya尾與最近尾與最近的酶切位點之間的片段。的酶切位點之間的片段。sagesage的實驗路線的實驗路線content 將將cdnacdna等分為等分為a a和和b b兩部分，分別兩部分，分別連接接頭連接接頭a a或接頭或接頭b b。 每一種接頭都含有標簽酶每一種接頭都含有標

5、簽酶(tagging enzyme te)(tagging enzyme te)酶切位點序列酶切位點序列( (標簽酶是一種標簽酶是一種類限制酶，它能在距類限制酶，它能在距識別位點約識別位點約2020堿基的位置切割堿基的位置切割dnadna雙雙鏈鏈) )。 接頭的結(jié)構(gòu)為引物接頭的結(jié)構(gòu)為引物a/ba/b序列序列+ +標簽標簽酶識別位點酶識別位點+ +錨定酶識別位點。錨定酶識別位點。content用標簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短用標簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cdnacdna片段片段( (約約9 91010堿基堿基) )，混合并連接兩個，混合并連接兩個cdnacdna池的短池的短cdnacdna片段，構(gòu)成雙

6、標簽后，片段，構(gòu)成雙標簽后，以引物以引物a a和和b b擴增。擴增。用錨定酶切割擴增產(chǎn)物，抽提雙標簽用錨定酶切割擴增產(chǎn)物，抽提雙標簽(ditga)(ditga)片段并克隆、測序。一般每一片段并克隆、測序。一般每一個克隆最少有個克隆最少有1010個標簽序列，克隆的個標簽序列，克隆的標簽數(shù)處于標簽數(shù)處于10105050之間。之間。對標簽數(shù)據(jù)進行處理。對標簽數(shù)據(jù)進行處理。contentcontentb.rnab.rna的選擇性剪接技術(shù)的選擇性剪接技術(shù)通過不同的剪接方式有一個通過不同的剪接方式有一個mrnamrna前前體產(chǎn)生不同的體產(chǎn)生不同的mrnamrna剪接異構(gòu)體的過剪接異構(gòu)體的過程程rnarna

7、的選擇性剪接的選擇性剪接平衡剪接平衡剪接5 5/ /選擇性剪接選擇性剪接3 3/ /選擇性剪接選擇性剪接外顯子遺漏性剪接外顯子遺漏性剪接相互排斥性剪接相互排斥性剪接content使用使用rt-pcrrt-pcr技術(shù)技術(shù)對不同組織來源的對不同組織來源的rnarna樣品進行擴增樣品進行擴增pcrpcr產(chǎn)物是否存在大小差異產(chǎn)物是否存在大小差異測序，差異產(chǎn)生的原因是否是選擇性剪接測序，差異產(chǎn)生的原因是否是選擇性剪接contentc.c.原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)( (in situ hybridizationin situ hybridization，ishish) )是分子生物

8、學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于2020世紀世紀6060年代。年代。19691969年美國耶魯大學(xué)的年美國耶魯大學(xué)的gallgall等首先用爪蟾等首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，與此同時基因進行定位，與此同時buongiornobuongiornonardellinardelli和和amaldiamaldi等等(1970)(1970)相繼利用同位相繼利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜

9、交技術(shù)。定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。content 原位雜交技術(shù)的原位雜交技術(shù)的基本原理基本原理是利用是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸將有放射性或非放射性的外源核酸( (即即探針探針) )與組織、細胞或染色體上待測與組織、細胞或染色體上待測dnadna或或rnarna互補配對，結(jié)合成專一的核互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。置顯示出來。content為顯示特定的核酸序列必須具備為顯示特定的核酸

10、序列必須具備3 3個重要條件：個重要條件：u組織、細胞或染色體的固定；組織、細胞或染色體的固定；u具有能與特定片段互補的核苷具有能與特定片段互補的核苷 酸序列酸序列( (即探針即探針) )；u有與探針結(jié)合的標記物。有與探針結(jié)合的標記物。content基因組原位雜交技術(shù)基因組原位雜交技術(shù) 基因組原位雜交基因組原位雜交(genome in (genome in situ hybridizationsitu hybridization，gish)gish)技術(shù)是技術(shù)是2020世紀世紀8080年代末發(fā)展起來的一種原位年代末發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間雜交技術(shù)。它主要是利用物種之間d

11、nadna同源性的差異，用另一物種的基因組同源性的差異，用另一物種的基因組dnadna以適當?shù)臐舛茸鞣庾?，在靶染色體以適當?shù)臐舛茸鞣庾?，在靶染色體上進行原位雜交。上進行原位雜交。gishgish技術(shù)最初應(yīng)用技術(shù)最初應(yīng)用于動物方面的研究于動物方面的研究content熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ (fluorescence in situ hybridizationhybridization，fish)fish)技術(shù)是在已有的放射性技術(shù)是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非

12、放射性性dnadna分子原位雜交技術(shù)。分子原位雜交技術(shù)。 它利用熒光標記的核酸片段為探針，與染它利用熒光標記的核酸片段為探針，與染色體上或色體上或dnadna顯微切片上的特異顯微切片上的特異fl-nfl-n：- -行雜交，行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)通過熒光檢測系統(tǒng)( (熒光顯微鏡熒光顯微鏡) )檢測信號檢測信號dnadna序列在染色體或序列在染色體或dnadna顯微切片上的目的顯微切片上的目的dnadna序列，序列，進而確定其雜交位點。進而確定其雜交位點。 fishfish技術(shù)檢測時間短，檢測靈敏度高，無技術(shù)檢測時間短，檢測靈敏度高，無污染，已廣泛應(yīng)用于染色體的鑒定、基因定位污染，已廣泛應(yīng)用于染

13、色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領(lǐng)域。和異常染色體檢測等領(lǐng)域。content多彩色熒光原位雜交技術(shù)多彩色熒光原位雜交技術(shù) 多彩色熒光原位雜交多彩色熒光原位雜交(multicolor (multicolor fluorescence in situ hybridizationfluorescence in situ hybridization，mfish)mfish)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)是在熒光原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)。展起來的一種新技術(shù)。 它用幾種不同顏色的熒光素單獨或混它用幾種不同顏色的熒光素單獨或混合標記的探針進行原位雜交，能同時檢測合標記的探針進行原位雜交

14、，能同時檢測多個靶位，多個靶位，各靶位在熒光顯微鏡下和照片各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩上的顏色不同，呈現(xiàn)多種色彩，因而被稱，因而被稱為多彩色熒光原位雜交。為多彩色熒光原位雜交。 它克服了它克服了fishfish技術(shù)的局限，能同時檢技術(shù)的局限，能同時檢測多個基因，在檢測遺傳物質(zhì)的突變和染測多個基因，在檢測遺傳物質(zhì)的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用色體上基因定位等方面得到了廣泛的應(yīng)用contentcontentcontentcontentd.d.基因定點突變技術(shù)基因定點突變技術(shù) 定點突變定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)（ pcr pcr ）等

15、方法向目的）等方法向目的 dna dna 片段（可以片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高能迅速、高效的提高 dna dna 所表達的目的蛋所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。非常有用的手段。content點突變，也稱作點突變，也稱作 單堿基替換單堿基替換 （ single single base substitution b

16、ase substitution ），指由單個堿基改），指由單個堿基改變發(fā)生的突變。變發(fā)生的突變。 可以分為轉(zhuǎn)換（可以分為轉(zhuǎn)換（ transitions transitions ）和顛換）和顛換（ transversions transversions ）兩類。）兩類。 轉(zhuǎn)換：轉(zhuǎn)換：嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘧啶之間的替換。嘧啶之間的替換。 顛換：顛換：嘌呤和嘧啶之間的替換。嘌呤和嘧啶之間的替換。 content點突變可依發(fā)生位置對基因功能的影點突變可依發(fā)生位置對基因功能的影響而作以下分類：響而作以下分類： 無義突變無義突變（ nonsense mutatio

17、n nonsense mutation ）：）：使原本可制造使原本可制造 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 的密碼變成停的密碼變成停止密碼。止密碼。 錯義突變錯義突變（ missense mutation missense mutation ）：）：使密碼所對應(yīng)的氨基酸改變。使密碼所對應(yīng)的氨基酸改變。 沉默突變沉默突變（ silent mutation silent mutation ）：密）：密碼改變，但對應(yīng)的氨基酸不變。碼改變，但對應(yīng)的氨基酸不變。 contentcontentcontentcontent二、基因敲除技術(shù)二、基因敲除技術(shù)content 經(jīng)典遺傳學(xué)經(jīng)典遺傳學(xué)的認知路線為由表及里，即通的認知路線為

18、由表及里，即通過雜交等手段觀察表型性狀的變化而推知遺傳過雜交等手段觀察表型性狀的變化而推知遺傳基因的存在與變化?；虻拇嬖谂c變化。 反向遺傳學(xué)反向遺傳學(xué)是一條由里及表的認知路線，是一條由里及表的認知路線，即通過即通過dnadna重組等技術(shù)有目的地、精確定位地重組等技術(shù)有目的地、精確定位地改造改造基因的精細結(jié)構(gòu)以確定這些變化對表改造改造基因的精細結(jié)構(gòu)以確定這些變化對表型性狀的直接影響。型性狀的直接影響。content利用同源重組構(gòu)建基因敲除動物模型的基本步驟利用同源重組構(gòu)建基因敲除動物模型的基本步驟基因載體的構(gòu)建：基因載體的構(gòu)建： 把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同

19、源的異片段同源的dna dna 分子都重組到帶有分子都重組到帶有標記基因標記基因( (如如neo neo 基因，基因，tk tk 基因等基因等) )的載體上，成為重組載體。的載體上，成為重組載體。 基因敲除是為了使某一基因失去基因敲除是為了使某一基因失去其生理功能，所以一般設(shè)計為替換型其生理功能，所以一般設(shè)計為替換型載體載體contentes es 細胞的獲得：細胞的獲得： 現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。雞等的胚胎干細胞也有使用。 常用的鼠的種系是及其常用的鼠的種系是及其雜合體，因為

20、這類小鼠具有自發(fā)突雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。被發(fā)展應(yīng)用。content同源重組：同源重組： 將重組載體通過一定的方式將重組載體通過一定的方式( (電穿電穿孔法或顯微注射孔法或顯微注射) )導(dǎo)入同源的胚胎干細導(dǎo)入同源的胚胎干細胞胞(es cell)(es cell)中，使外源中，使外源dnadna與胚胎干與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的將重組載體

21、中的dnadna序列整合到內(nèi)源基序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達。因組中，從而得以表達。 一般地，顯微注射命中率較高，一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用微注射低，但便于使用content選擇篩選已擊中的細胞：選擇篩選已擊中的細胞： 由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率為低，動物的重組概率為10102 21010-5-5，植物的，植物的概率為概率為10104 410105 5。因此如何從眾多細胞中。因此如何從眾多細胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細胞非常篩出真正發(fā)

22、生了同源重組的胚胎干細胞非常重要。重要。 目前常用的方法是正負篩選法（目前常用的方法是正負篩選法（pnspns法），標記基因的特異位點表達法以及法），標記基因的特異位點表達法以及pcrpcr法。其中應(yīng)用最多的是法。其中應(yīng)用最多的是pnspns法。法。content 表型研究：表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。 得到純合體：得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對染由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條

23、染色體中色體上中一條染色體中, ,所以如果所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。除模型，需要進行至少兩代遺傳。content基因同源重組法敲除靶基因的基本步驟基因同源重組法敲除靶基因的基本步驟content由嵌合體得到基因敲除的純合體小鼠由嵌合體得到基因敲除的純合體小鼠content 條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。敲除方法。 它實際上是在常規(guī)的基因敲除的

24、基礎(chǔ)它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶上，利用重組酶crecre介導(dǎo)的位點特異性重介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕按鈕”，從而使對小，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)?？貭顟B(tài)。content 利用利用crecreloxp loxp 和來自酵母的和來自酵母的flpfrt flpfrt 系統(tǒng)可系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導(dǎo)以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型。致的表型。 通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位

25、點上裝上兩通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的個同向排列的1oxp1oxp，并以此兩側(cè)裝接上，并以此兩側(cè)裝接上loxp loxp 的的(“l(fā)oxp floxed”)es (“l(fā)oxp floxed”)es 細胞產(chǎn)生細胞產(chǎn)生“l(fā)oxp floxed”loxp floxed”小鼠小鼠, ,然后，通過將然后，通過將“l(fā)oxp floxed”loxp floxed”小鼠與小鼠與cre cre 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因鼠雜交基因鼠雜交( (也可以其他方式向小鼠中引入也可以其他方式向小鼠中引入cre cre 重重組酶組酶) )，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式( (如特定的組織特如特定的組織

26、特異性異性) )修飾的條件性突變小鼠。修飾的條件性突變小鼠。 content 在在“l(fā)oxp floxed”loxp floxed”小鼠，雖然靶基因的兩小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個側(cè)已各裝上了一個loxploxp，但靶基因并沒有發(fā)生，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故其他的變化，故“1oxp noxed”1oxp noxed”小鼠表型仍同小鼠表型仍同野生型的一樣。野生型的一樣。 但當它與但當它與cre cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時，產(chǎn)生的子轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時，產(chǎn)生的子代中將同時帶有代中將同時帶有“l(fā)oxp floxed”loxp floxed”靶基因和靶基因和cre cre 基因?；?。 cr

27、e cre 基因表達產(chǎn)生的基因表達產(chǎn)生的cre cre 重組酶就會介導(dǎo)靶重組酶就會介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的基因兩側(cè)的1oxp 1oxp 間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個loxp loxp 和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾( (切切除除) )是以是以cre cre 的表達為前提的。的表達為前提的。content cre cre 的表達特性決定了靶基因的修飾的表達特性決定了靶基因的修飾( (切除切除) )持性：即持性：即cre cre 在哪一種組織細胞中在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾表達，靶基因的修飾( (切除切除) )就發(fā)生在哪種就發(fā)生在哪種組織

28、細胞；而組織細胞；而cre cre 的表達水平將影響靶基的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。因在此種組織細胞中進行修飾的效率。 所以只要控制所以只要控制cre cre 的表達特異性和表的表達特異性和表達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。異性和程度。content條件性基因敲除的基因重組及切除步驟條件性基因敲除的基因重組及切除步驟content 誘導(dǎo)性基因敲除也是以誘導(dǎo)性基因敲除也是以cre/loxp cre/loxp 系統(tǒng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制為基礎(chǔ)，但卻是利用控制cre cre 表達的啟動表達的啟動子的活性或所表達的子的活

29、性或所表達的cre cre 酶活性具有可誘酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利用或利用cre cre 基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在1oxp 1oxp 動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)。 content 人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)人們可以通過對誘導(dǎo)

30、劑給予時間的預(yù)先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。 常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。病毒介導(dǎo)型。content四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程content 基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法。機插入突變進行基因敲除的新型方法。 通?；虿东@載體

31、還包括一個無啟動通?；虿东@載體還包括一個無啟動子的報道基因，通常是子的報道基因，通常是neo neo 基因，基因，neo neo 基基因插入到因插入到es es 細胞染色體組中，并利用捕細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達的獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達的es es 克克隆可以很容易地在含隆可以很容易地在含g418 g418 的選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基中篩選出來。中篩選出來。 從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該克隆應(yīng)該100100地含有中靶基因。中靶基地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側(cè)翼因的信息可以通過篩選標記基因側(cè)翼cdn

32、acdna或染色體組序列分析來獲得。或染色體組序列分析來獲得。content需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白content插入了靶目標的基因轉(zhuǎn)錄翻譯出無活插入了靶目標的基因轉(zhuǎn)錄翻譯出無活性的目標蛋白隨機插入內(nèi)含子中性的目標蛋白隨機插入內(nèi)含子中content需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白content 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌ti(tumor inducing)ti(tumor inducing)或或ri(root inducing)ri(root inducing)質(zhì)粒中的一段質(zhì)粒中的一段dnadna序列序列, ,可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移

33、并穩(wěn)定整合可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中到植物核基因組中, ,已成為植物分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用已成為植物分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化載體。的遺傳轉(zhuǎn)化載體。 農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有有titi質(zhì)粒和質(zhì)粒和riri質(zhì)粒，其上有一段質(zhì)粒，其上有一段t-dnat-dna，農(nóng)桿菌通，農(nóng)桿菌

34、通過侵染植物傷口進入細胞后，可將過侵染植物傷口進入細胞后，可將t-dnat-dna插入到植插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的t-dnat-dna區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 contentcontent三、蛋白質(zhì)及三、蛋白質(zhì)及rnarna相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)content 酵母

35、單雜交技術(shù)最早是酵母單雜交技術(shù)最早是19931993年由年由lili等從酵等從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，通過對報告基因的表母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，通過對報告基因的表型檢測，分析型檢測，分析dnadna與蛋白之間的相互作用，以與蛋白之間的相互作用，以研究真核細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控。研究真核細胞內(nèi)的基因表達調(diào)控。 由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄

36、因子。a.a.酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)content 酵母單雜交酵母單雜交(yeast one-hybrid)(yeast one-hybrid)是根據(jù)是根據(jù)dnadna結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白( (即轉(zhuǎn)錄因子即轉(zhuǎn)錄因子) )與與dnadna順式作用元件結(jié)順式作用元件結(jié)合調(diào)控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特合調(diào)控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cdna)(cdna)的有效方法。的有效方法。 其理論基礎(chǔ)是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活其理論基礎(chǔ)是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由子由物理和功能上獨立的物理和功能上獨立的dnadna結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū)(dna-(dna-bi

37、nding domain bd)binding domain bd)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(activation domain ad) (activation domain ad) 組成，因此可構(gòu)建組成，因此可構(gòu)建各種基因與各種基因與adad的融合表達載體，在酵母中表達的融合表達載體，在酵母中表達為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。 理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白?？杀挥糜诤Y選一種與之有特異結(jié)

38、合區(qū)域的蛋白。contentv 將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（pminpmin）的上游）的上游，把報告基因連接到，把報告基因連接到pminpmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cdnacdna與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（adad）融合表達載體導(dǎo)入酵母）融合表達載體導(dǎo)入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活激活 pminpmin啟動子，使報告基因得到表達。啟動子，使報告基因得到表達。content從擬南芥從擬南芥cdna文文庫中庫中 篩選篩

39、選與順式元與順式元 件件dre結(jié)結(jié)合的合的 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄因子示意因子示意圖。圖。contentb.b.酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子( (如如gal4gal4等等) )的的dnadna結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和gal4gal4激活結(jié)激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達載體，構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。用的系統(tǒng)。content 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)

40、上是組件式的(modular), (modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, , 其中有其中有dnadna結(jié)合結(jié)結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)域(dna binding domain, (dna binding domain, 簡稱為簡稱為db)db)和轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, (activation domain, 簡稱為簡稱為ad)ad), , 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的單獨的dbdb雖然能和啟動子結(jié)合雖然能和啟動子結(jié)合, , 但

41、是不能但是不能激活轉(zhuǎn)錄。激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的dbdb和和adad形形成的成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。 content 酵母雙雜交的基本原理示意圖酵母雙雜交的基本原理示意圖contentcontentc.c.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)far westernfar western印跡技術(shù)印跡技術(shù)用用32p32p標記的體外表達蛋白作探針標記的體外表達蛋白作探針, ,直直接檢測接檢測 與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達該蛋白或表達該蛋白 的的cdnacdna。contentco

42、ntentgstgst融合蛋白沉降技術(shù)融合蛋白沉降技術(shù)利用利用gstgst對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親的親 和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作得到相互作 用蛋白。用蛋白。contentcontent蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的的 相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)白質(zhì) 芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可后，可 以通過掃描芯片上的熒光點檢測到以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相穩(wěn)定的相 互

43、作用蛋白點。互作用蛋白點。contentcontent免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可可 能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入加入 反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法過濾法 在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合蛋白復(fù)合 物沉淀到試管的底部或微膜上。物沉淀到試管的底部或微膜上。contentcontentd.d.細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（fretfret）vfre

44、tfret熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：n給體與受體在合適的距離（給體與受體在合適的距離（1 110 nm10 nm）；）；n給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；的重疊（這是能量匹配的條件）；n給體與受體的偶極具有一定的空間取給體與受體的偶極具有一定的空間取 向向（這是偶極（這是偶極- -偶極耦合作用的條件）。偶極耦合作用的條件）。contentcontente. rnaie. rnai（rnarna干涉）技術(shù)及其應(yīng)用干涉）技術(shù)及其應(yīng)用 利用雙鏈小利用雙鏈小rnarna高效、特異性降解高效、特異性降解細

45、胞內(nèi)同源細胞內(nèi)同源mrnamrna從而阻斷靶基因表達從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。content 這些小的雙鏈這些小的雙鏈rnarna稱為稱為sirna sirna （small /short small /short interfering rna interfering rna ，sirnasirna） 。 研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈rnarna是是rnairnai的觸發(fā)物，引的觸發(fā)物，引 發(fā)發(fā)與之互補的單鏈與之互補的單鏈rnarna（ssrna, single- ssrna, single- stranded rnastranded rn

46、a）的降解。）的降解。content發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)rna干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物中細胞。又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期幾乎所有的真核生物中細胞。又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在干擾現(xiàn)象胚胎中和大腸桿菌中也存在干擾現(xiàn)象 sirna在細胞內(nèi)在細胞內(nèi)rna解旋酶的作用下解鏈成正義解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義鏈和反義鏈，繼之由反義sirna再與體內(nèi)一些酶再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成結(jié)

47、合形成rna誘誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物導(dǎo)的沉默復(fù)合物(rna-induced silencing complex，risc)。contentcontentcontentcontent四、基因芯片及數(shù)據(jù)分析四、基因芯片及數(shù)據(jù)分析content 基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析 基因芯片（基因芯片（dna chipdna chip），又稱），又稱dnadna微陣列微陣列 （dna dna microarraymicroarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶 基因表基因表達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)

48、錄闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄 本的變化本的變化規(guī)律。規(guī)律。該技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點該技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于陣密度高于 400 400 ）探針分子固定于支持）探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。content在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列液中帶有熒光標記的核酸序列tatgcaatctag

49、tatgcaatctag，與基因芯片，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。 content基因芯片研制的總體藍圖 研制方向的確定研制方向的確定基因組序列分析與待檢基基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定因探針序列的確定檢測樣品檢測樣品 的制備的制備探針陣列的探針陣列的準備準備檢測設(shè)備的檢測設(shè)備的研制研制雜交檢測與數(shù)據(jù)分析雜交檢測與數(shù)據(jù)分析content基因芯片技術(shù)的主要特

50、點：基因芯片技術(shù)的主要特點： 技術(shù)操作簡單技術(shù)操作簡單 自動化程高自動化程高 序列數(shù)量大序列數(shù)量大 檢測效率高檢測效率高 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣 成本相對低成本相對低contentcontent五、利用酵母鑒定五、利用酵母鑒定靶基因功能靶基因功能content六、其他分子生物學(xué)技術(shù)六、其他分子生物學(xué)技術(shù)content凝膠阻滯實驗?zāi)z阻滯實驗（electrophoretic mobility shift assay, emsaelectrophoretic mobility shift assay, emsa）又叫作又叫作dnadna遷移率變動試驗（遷移率變動試驗（dna mobility dna

51、 mobility shift assayshift assay），是用于體外研究），是用于體外研究dnadna與蛋與蛋白質(zhì)白質(zhì) 相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。content 原理：在凝膠電泳中，由于電場的作原理：在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的用，裸露的dnadna朝正電極移動的距離與朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。其分子量的對數(shù)成反比。 如果此時如果此時dnadna分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。就相應(yīng)縮短了。 所以，當某個所以，當某個dnadna片段與細胞提取物混片段與細胞提取物混合之后，若它在凝膠電泳中的移動距合之后，若它在凝膠電泳中的移動距離變小了，就說明它可能已與提取物離變小了，就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合了。中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合了。cont