氨基酸藥物的發(fā)酵生產(chǎn)

1、第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸類藥物的基本概念氨基酸類藥物的基本概念 一、氨基酸類藥物的基本知識一、氨基酸類藥物的基本知識 從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有180多種多種，但是但是參與蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二參與蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有二十種。十種。1986年年發(fā)現(xiàn)第21種 硒代胱氨酸硒代胱氨酸 最近發(fā)現(xiàn)第22種遺傳基因編碼的氨基酸 吡咯賴氨酸。吡咯賴氨酸。 180多種天然氨基酸大多數(shù)是不參與蛋白質(zhì)組成的，這些氨基酸被稱為非蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸。 氨基酸是構(gòu)成機體蛋白質(zhì)的基本單位基本單位，且構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的氨基酸都是-氨基酸氨基酸，除

2、甘氨酸甘氨酸外，-碳原子碳原子均為不對稱碳原子不對稱碳原子，具有立體異構(gòu)現(xiàn)象立體異構(gòu)現(xiàn)象，均是l-型氨基酸型氨基酸。1、分類：、分類： （1）根據(jù)氨基酸在ph5.5溶液中帶電狀況分為酸性、酸性、中性及堿性中性及堿性氨基酸三類。 （2）依r基團(tuán)基團(tuán)差異亦分為：脂肪族脂肪族氨基酸、芳香族芳香族氨基酸及雜環(huán)雜環(huán)氨基酸三類三類 其中l(wèi)-組氨酸、組氨酸、l-色氨酸、色氨酸、l-脯氨酸及脯氨酸及l(fā)-羥脯氨羥脯氨酸酸為雜環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸， l-酪氨酸及酪氨酸及l(fā)-苯丙氨酸苯丙氨酸為芳香族氨基酸芳香族氨基酸， 其余均為脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸。2、性質(zhì)：、性質(zhì)：（1）物理通性：）物理通性： 天然氨基酸純品均

3、為白色結(jié)晶性粉末白色結(jié)晶性粉末，熔點及分熔點及分解點解點均在200以上以上。 在有機溶劑有機溶劑中溶解度一般較小。 均為兩性電解質(zhì)均為兩性電解質(zhì)，各有一定等電點等電點。除甘氨酸外都有旋光性旋光性。 氨基酸氨基酸能使水的介電常數(shù)增高,而一般的有機化合物乙醇、丙酮等卻使水的介電常數(shù)降低介電常數(shù)降低。是以離子晶離子晶格格組成，而一般的有機化合物是由分子晶格分子晶格組成的。（2）化學(xué)通性：）化學(xué)通性： -氨基酸氨基酸共同的化學(xué)反應(yīng)有兩性解離兩性解離及林海定反應(yīng)林海定反應(yīng)(ninhyding reactiong) 、?；?、烷基化、酯化、酰氯、酰化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、疊氮化、脫羧及脫氨反應(yīng)、肽

4、鍵結(jié)合反化、酰胺化、疊氮化、脫羧及脫氨反應(yīng)、肽鍵結(jié)合反應(yīng)及與甲醛和亞硝酸的反應(yīng)應(yīng)及與甲醛和亞硝酸的反應(yīng)等。 特殊基團(tuán)反應(yīng)特殊基團(tuán)反應(yīng)： 酪氨酸的酚羥基酪氨酸的酚羥基可產(chǎn)生米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)與福林達(dá)尼斯福林達(dá)尼斯反應(yīng)； 精氨酸的胍基精氨酸的胍基產(chǎn)生坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)； 色氨酸色氨酸的吲哚基吲哚基與芳醛芳醛產(chǎn)生紅色反應(yīng)紅色反應(yīng)； 組氨酸的咪唑基組氨酸的咪唑基產(chǎn)生pauly反應(yīng)反應(yīng)； 苯丙氨酸硝化后于堿性條件下苯丙氨酸硝化后于堿性條件下產(chǎn)生桔黃色反應(yīng)桔黃色反應(yīng)； 胱氨酸及半胱氨酸胱氨酸及半胱氨酸經(jīng)酸或堿破壞后可與醋酸鉛醋酸鉛產(chǎn)生鉛黑反應(yīng)鉛黑反應(yīng)； 半胱氨酸半胱氨酸在堿性條件下與亞硝基鐵氰化鈉（硝普亞硝基

5、鐵氰化鈉（硝普鹽）鹽）反應(yīng)生成紫紅色化合物紫紅色化合物。 色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸色氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸均有特征紫外吸收光紫外吸收光譜譜，色氨酸色氨酸最大吸收波長為279nrn，苯丙氨酸苯丙氨酸為259nm，酪氨酸酪氨酸為278nm。但構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)均無吸收可見光區(qū)均無吸收。 氨基酸的上述理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)與氨基酸合成、轉(zhuǎn)合成、轉(zhuǎn)化化、分離純化分離純化及定性定量檢測的依據(jù)定性定量檢測的依據(jù)二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用二、氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用 1、氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本組成單位基本組成單位，故生物體中眾多蛋白質(zhì)的生物功能生物功能，無不與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸

6、種類、數(shù)量、排列順序種類、數(shù)量、排列順序及由其形成的空間構(gòu)象有密空間構(gòu)象有密切的關(guān)系切的關(guān)系。因此氨基酸對維持機體蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡維持機體蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡有極其重要的意義。生命活動中人及動物通過消化道吸收氨基酸 。 通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化體內(nèi)轉(zhuǎn)化而維持其動態(tài)平衡動態(tài)平衡，若其動態(tài)平衡失調(diào)，則機體代謝紊亂代謝紊亂，甚至引起病變病變。2、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應(yīng)、許多氨基酸尚有其特定的藥理效應(yīng)。 （）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系（）氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系 氨基酸為構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的基本單位，故蛋白質(zhì)營蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值養(yǎng)價值實際是氨甚酸作用氨甚酸作用的反映。健康人靠膳食膳食中的蛋白質(zhì)獲

7、取各種氨基酸滿足機體需求。缺乏蛋白質(zhì)則影響機體生長及正常生理功能，抗病力減弱抗病力減弱引起病變病變。 消化道功能嚴(yán)重障礙者消化道功能嚴(yán)重障礙者及手術(shù)后病人手術(shù)后病人常因禁食無法獲得足夠蛋白質(zhì)，自身蛋白質(zhì)過量消耗，致使?fàn)I養(yǎng)不營養(yǎng)不良而導(dǎo)致病情惡化或預(yù)后不良良而導(dǎo)致病情惡化或預(yù)后不良。 臨床上常通過直接輸入氨基酸制劑氨基酸制劑改善患者營養(yǎng)狀況，增加治療機會，促進(jìn)康復(fù)。 賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸等8種氨基酸種氨基酸 必需氨基酸：必需氨基酸：人及哺乳動物自身不能合成，需由食物供應(yīng)。 半必需氨基

8、酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）半必需氨基酸：氨基酸（胱氨酸及酪氨酸）可分別由其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸和苯丙氨酸)產(chǎn)生產(chǎn)生，若食物中提供了足夠的該氨基酸（氨基酸（氨酸及酪氨酸），可減少對其他氨基酸（氨基酸（蛋氨酸及苯丙氨酸）的需求量。 氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低氨基酸（精氨酸及組氨酸）合成速度較低，通常難以滿足需求，需由外界補充一部分。（二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物（二）治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物（三）治療肝病的氨基酸及其衍生物（三）治療肝病的氨基酸及其衍生物（四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物（四）治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物（五）用于腫瘤治療的氨基酸

9、及其衍生物（五）用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物（六）其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用（六）其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用第二節(jié)第二節(jié) 氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法 1、 目前全世界天然氨基酸全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬噸百萬噸左右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用用于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。 2、 目前構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的20種氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及化學(xué)合成法等四種。法等四

10、種。 3、 氨基酸及其衍生物類藥物衍生物類藥物已有百種百種之多，但主要是以以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；?、取代及成鹽種氨基酸為原料經(jīng)酯化、酰化、取代及成鹽等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。等化學(xué)方法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。一、水解法一、水解法 （一）基本原理與過程（一）基本原理與過程 以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、酸、堿或酶水解堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法水解法。 目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有l(wèi)-胱氨酸、胱氨酸、l-精氨精氨酸、酸、l-亮氨酸、亮氨酸、l-異亮氨酸、異亮氨酸、l-組氨酸、組氨酸、l-脯氨酸脯氨酸及及l(fā)-絲氨酸絲氨酸等。 水解法生產(chǎn)氨基

11、酸的主要過程為水解、分離和結(jié)水解、分離和結(jié)晶精制晶精制三個步驟。 1、蛋白質(zhì)水解方法、蛋白質(zhì)水解方法 目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。解法三種。 （1）酸水解法）酸水解法 蛋白質(zhì)原料用610moll鹽酸鹽酸或8moll硫酸硫酸于110120（回流煮沸）水解1224h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點是水解迅速迅速而徹底徹底，產(chǎn)物全部為l-型氨基酸型氨基酸，無消旋作消旋作用用。缺點是色氨酸色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸絲氨酸及酪氨酸部分被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。（2）堿水解法）堿水解法 蛋白質(zhì)原料經(jīng)6moll氫氧化鈉或氫氧化鈉或4moll氫

12、氧化鋇氫氧化鋇于100水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但含羥基或巰基羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作且產(chǎn)生消旋作用用。工業(yè)上多不采用。（3）酶水解法）酶水解法 蛋白質(zhì)原料在一定ph和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽氨基酸和小肽的過程稱為酶水解法。 此法優(yōu)點為反應(yīng)條件溫和，無需特殊設(shè)備，氨基酸不破壞，無消旋作用無消旋作用。缺點是水解不徹底水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨水解蛋白及蛋白胨。2、氨基酸分離方法、氨基酸分離方法 氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法溶解度法、等電點

13、等電點沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。 （1）溶解度法）溶解度法 是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異溶解度差異而進(jìn)行分離的方法。 胱氨酸和酪氨酸胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。 （2）特殊試劑沉淀法）特殊試劑沉淀法 系采用某些有機或無機試劑有機或無機試劑與相應(yīng)氨基酸形成不溶性衍生物不溶性衍生物的分離方法。 如鄰二甲苯鄰二甲苯-4-磺酸能與亮氨酸磺酸能與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀不溶性鹽沉淀，后者與氨水反應(yīng)

14、氨水反應(yīng)又可獲得游離亮氨酸游離亮氨酸； 組氨酸可與組氨酸可與hgc12形成不溶性汞鹽沉淀汞鹽沉淀，后者經(jīng)處理后又可獲得游離組氨酸組氨酸； 精氨酸可與苯甲醛精氨酸可與苯甲醛生成水不溶性苯亞甲基精氨酸苯亞甲基精氨酸沉淀，后者用鹽酸鹽酸除去苯甲醛苯甲醛即可得精氨酸。 （3）吸附法）吸附法 是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差異進(jìn)行分離的方法。如顆?；钚蕴款w?；钚蕴繉Ρ奖彼帷⒗冶奖彼?、酪氨酸氨酸及色氨酸色氨酸的吸附力大于對其它非芳香族非芳香族氨基酸的吸附力，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出來。 （4）離子交換法）離子交換法 是利用離子交換劑對不同氨基酸吸附能力的差異進(jìn)行分離的方法。氨基酸為兩性

15、電解質(zhì)兩性電解質(zhì)，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。3、氨基酸的精制方法、氨基酸的精制方法 分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì)，需進(jìn)行精制，常用的有結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶和重結(jié)晶技術(shù)，也可采用溶解溶解度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)度法或結(jié)晶與溶解度法相結(jié)合的技術(shù)。 丙氨酸在稀乙醇或甲醇稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pi為為6.0，故丙氨酸可在ph6.0時，用50冷乙醇冷乙醇結(jié)晶或重結(jié)晶加以精制。 溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合溶解度與結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含

16、少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（wv）的熱水中，調(diào)ph4.0左右左右，經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨酸；濾液濃縮至原體積的13，加2倍體積（vv）的95乙醇乙醇，4放置，濾取結(jié)晶，用95%乙醇洗滌乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。（二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝（二）用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝 絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法酸水解法生產(chǎn)，但目前由于發(fā)酵方法及酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展，僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產(chǎn)?，F(xiàn)胱氨酸及亮氨酸生產(chǎn)為例。 1、l-胱氨酸（胱氨酸（l-cystine，l-cys2）的制備）的制備 （1）l-胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)胱氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l-胱氨酸存在于所有蛋白

17、質(zhì)分子中，尤以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化脫氫氧化而成，結(jié)構(gòu)為： l-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體六角形或六角柱形晶體，分分解點解點258261，pi為為5.05，25d 為為-232。在25水中溶解度為0.011，在75水中為0.052。溶于無機酸及無機堿，在熱堿液中可被分解熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醇、乙醚及丙酮乙醚及丙酮?？杀贿€原為還原為l-半胱氨酸半胱氨酸。 （2）工藝路線）工藝路線 （3）工藝過程）工藝過程水解水解 110117水解7h（自100時計）后出料,玻璃布過濾,收集濾液。中和中和 直至ph4.8，靜置36

18、h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干得l-胱氨酸粗品。粗制粗制 升溫至6570，攪拌半小時，加活性炭16kg，于8090保溫半小時，濾除活性炭。調(diào)濾液至ph4.8，靜置結(jié)晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨酸粗品（）。 精制精制 中和中和 升溫至70，加活性炭1.52.5kg，85攪拌半小時，過濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫至7580，攪拌下用12氨水氨水（化學(xué)純）中和至ph3.54.0，析出結(jié)晶，濾取胱氨酸結(jié)晶，蒸餾水洗至無氯離子，真空干燥得l-胱氨酸成品。（4）檢驗）檢驗 應(yīng)為六角形或六角柱形白色結(jié)晶，含量在98.5以上，干燥失重小于0.5，熾灼殘渣小于0.2，氯化物小于0.15，鐵鹽小于0

19、.001，重金屬小于20ppm。含量測定含量測定：（5）作用與用途）作用與用途 l-胱氨酸具有增強造血機能、升高白細(xì)胞、促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。 2、l-亮氨酸（亮氨酸（l-leucine，l-leu）的制備）的制備（1）l-亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l-亮氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，以玉米麩質(zhì)及血粉玉米麩質(zhì)及血粉中含量最豐富，其次在角角甲、棉籽餅和雞毛甲、棉籽餅和雞毛中含量也較多。l-亮氨酸為人體必亮氨酸為人體必需氨基酸之一需氨基酸之一，化學(xué)名稱為2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨基異己酸，分子式：c6h

20、13no2,分子量：131.17 ,結(jié)構(gòu)式： l-leu自水及乙醇水及乙醇中得白色片狀結(jié)晶片狀結(jié)晶，pi為為5.98，熔點為熔點為293，在25水水中溶解度為2.19，乙醇中為0.017;在75水水中為3.82，在醋酸中為10.9，不溶于乙醚。 （2）工藝路線：）工藝路線： （3）工藝過程：）工藝過程：水解、趕酸水解、趕酸 取6moll hc1 500l于1噸水解罐中，投入100kg動物血粉，110120回流水解回流水解24h后，于7080減壓濃縮至糊狀。加50l水稀釋后，再濃縮至糊狀，如此趕酸趕酸三次，冷卻至室溫濾除殘渣。吸附、脫色吸附、脫色 上述濾液稀釋1倍后，以每分鐘0.5l的流速流進(jìn)顆

21、粒活性炭柱（30180cm）至流出液出現(xiàn)苯丙氨酸苯丙氨酸為止，用去離子水以同樣流速洗至流出液ph4.0為止，穿柱液與洗滌液合并。濃縮、沉淀與解析濃縮、沉淀與解析 上述流出液減壓濃縮減壓濃縮至進(jìn)柱液體積的13，攪拌下加入110體積（vv）的鄰二甲鄰二甲苯苯-4-磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀磺酸，產(chǎn)生亮氨酸磺酸鹽沉淀。濾取沉淀并用2倍體積（wv）去離子水?dāng)嚢柘礈靸纱?，抽濾壓干得亮氨酸磺酸鹽。濾餅加2倍體積（wv）去離子水?dāng)噭颍糜?mol/l 氨水中和至氨水中和至ph68，7080保溫攪保溫攪拌拌1h，冷卻過濾。沉淀用2倍體積（wv）去離子水?dāng)嚢柘礈靸纱危^濾得亮氨酸粗品。精制精制 l-亮氨酸粗品用

22、40倍體積（wv）去離子水加熱溶解加熱溶解，加0.5活性炭于70攪拌脫色1h，過濾，濾液濃縮至原體積的14，冷卻后即析出白色片狀亮氨酸結(jié)晶。過濾收集結(jié)晶，用少量水洗滌、抽干，7080烘干得l-亮氨酸成品。 （4）檢驗）檢驗 應(yīng)為白色片狀結(jié)晶，含量98.5101.5%，干燥失重不超過0.2，熾灼殘渣不超過0.4，氯化物不超過0.05，鐵鹽不超過0.003%，重金屬不超過0.0015，砷鹽不超過1.5ppm。 含量測定含量測定（5）作用與用途）作用與用途 l-亮氨酸為人體必需氨基酸之一，是各種氨基酸輸液的原料之一。二、發(fā)酵法二、發(fā)酵法 （）基本原理與過程（）基本原理與過程 1、發(fā)酵的基本原理、發(fā)酵

23、的基本原理 生物化學(xué)中稱酵母無氧呼吸無氧呼吸過程為發(fā)酵發(fā)酵，反應(yīng)過程中電子供體與受體皆為有機物，有時電子受體為電子供體的分解產(chǎn)物，氧化作用不完全，最終形成還原性產(chǎn)物。 工業(yè)上，發(fā)酵發(fā)酵實質(zhì)上是利用微生物細(xì)胞中酶的作用，將培養(yǎng)基中有機物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞或其它有機物的過程。 初生氨基酸：初生氨基酸：微生物通過固氮作用固氮作用、硝酸還原硝酸還原及自外界吸收氨使酮酸氨基化酮酸氨基化成相應(yīng)的氨基酸，或微生物通過轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一種酮酸酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸。初生氨基酸。 次生氨基酸：次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸為初生氨基酸為前體轉(zhuǎn)化成的其它氨基酸前體轉(zhuǎn)化

24、成的其它氨基酸。 大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生微生物轉(zhuǎn)化物轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生。 2、發(fā)酵法的基本過程、發(fā)酵法的基本過程 發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的基本過程包括培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制與滅菌處理滅菌處理，菌種誘變與選育菌種誘變與選育，菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)、滅菌滅菌及接種接種發(fā)酵發(fā)酵，產(chǎn)品提取及分離純化等步驟。 現(xiàn)代生物工程采用細(xì)胞融合細(xì)胞融合技術(shù)及基因重組基因重組技術(shù)改造微生物細(xì)胞，已獲得多種高產(chǎn)氨基酸高產(chǎn)氨基酸雜種菌株及基因工程菌基因工程菌。 如用北京棒狀桿菌和鈍齒棒狀桿菌原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合形成的雜種，其中70雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞產(chǎn)生兩親菌株所產(chǎn)生的氨基酸氨基酸。 氨基酸發(fā)酵方式發(fā)酵方式主要是液

25、體通風(fēng)深層培養(yǎng)法，其過程是由菌種試管培養(yǎng)逐級放大直至數(shù)噸至數(shù)百噸發(fā)酵罐。發(fā)酵結(jié)束，除去菌體，清液用于提取、分離純提取、分離純化和精制化和精制有關(guān)氨基酸，其分離純化、精制方法及過程與水解法相同。 （二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 構(gòu)成動物、植物及微生物體所有蛋白質(zhì)的氨基酸種類與構(gòu)型均無任何差異均無任何差異，但植物體內(nèi)所有氨基酸皆由co2、氨和水合成、氨和水合成，動物體除8種必需氨基酸需從外界攝取外，其余非必需氨基酸均可通過體內(nèi)氨基酸之間的轉(zhuǎn)化或碳水化合物中間代謝物而合成，而微生物微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有

26、氨基酸。 目前絕大部分氨基酸絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其缺點是產(chǎn)物濃度低，設(shè)備投資大，工藝管理要求嚴(yán)格，生產(chǎn)周期長，成本高。本文僅以l-異亮氨酸及l(fā)-賴氨酸直接發(fā)酵法為例，說明發(fā)酵法的基本過程。 1、l-異亮氨酸（異亮氨酸（l-isoleucine，l-ile）的制備）的制備 （1）l-異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)異亮氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)：l-ile存在子所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一必需氨基酸之一，分子式為c6h13no2，分子量為131.17，結(jié)構(gòu)式為： l-ile在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體，分解點為285286，l-ile溶于熱醋酸溶于熱醋酸，在20乙醇中溶解度為0.072，在25

27、水中為4.12，在75水中為6.08，不溶于乙醚溶于乙醚。 （2）工藝路線）工藝路線 （3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 種子培養(yǎng)基組成（種子培養(yǎng)基組成（%）為：）為：葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米漿 2.5豆餅水解液0.1（以干豆餅計） ph6.5。 二級種子培養(yǎng)基另加菜籽油0.4，其余同一級種子培養(yǎng)基。 一級種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面as1.998菌種，搖床30培養(yǎng)（沖程7cm，頻率105次min）16h。 二級種子培養(yǎng)：接種量3.5，培養(yǎng)8h，如此逐級放大培養(yǎng)得足夠量菌種。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液組成（%）為: 硫酸銨 4.

28、5 豆餅水解液 0.4，玉米漿 2.0 碳酸鈣 4.5 ph7.2，淀粉水解還原糖初糖濃 度 11.5。 在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118120，維持在1.1105pa壓力，滅菌30min，立即通冰鹽水冷卻至25。接入1菌種菌種（vv），維持180轉(zhuǎn)min的攪拌速度，升溫至3031， 以0.2l（minl）通氣量發(fā)酵60h，在2450h之間不斷補加尿素至0.6，氨水至0.27。 除菌體、酸化除菌體、酸化 發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100并維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至ph3.5，過濾除沉淀。 離子交換、吸附分離離子交換、吸附分離 上述濾液每分鐘以樹脂量1.5的流

29、速進(jìn)h十-型732離子交換柱（40100cm），以100l去離子水洗柱，再以60、0.5moll氨水按3l/min的流速進(jìn)行洗脫，分部收集洗脫液。 濃縮趕氨濃縮趕氨 合并ph312的洗脫液，7080減壓蒸餾、濃縮至粘稠狀，加去離子水至原體積的14，再濃縮至粘稠狀。如此重復(fù)三次。 脫色、濃縮、中和脫色、濃縮、中和 上述濃縮物加去離子水至原體積的14，攪拌均勻，加2moll鹽酸調(diào)ph3.5，加上1（wv）活性炭，70攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當(dāng)體積，用2moll氨水調(diào)ph6.0，5沉淀過夜,過濾抽千，105烘干得：l-異亮氨酸半成品。精制、烘干精制、烘干 每10kg l-異亮氨酸半

30、成品加8l濃鹽酸和20l去離子水，加熱至80，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工業(yè)液堿調(diào)ph1.5，過濾，濾液用堿調(diào)ph 1.5，5放置過夜。濾取沉淀，用80l，去離子水加熱至80攪拌溶解，加適量氯化鈉氯化鈉和1%（wv）活性炭，70攪拌脫色lh過濾，濾液減壓濃縮至適當(dāng)濃度，用氨水調(diào)ph6.0，5放置結(jié)晶過夜。次日過濾收集結(jié)晶，抽干，于105烘房中烘干得l-異亮氨酸成品。（4）檢驗）檢驗 應(yīng)為菱形葉片狀或片狀晶體，含量應(yīng)為98.5101.5，干燥失重不超過0.3，熾灼殘渣不大于含量測定與l-亮氨酸的規(guī)定相同。0.3%，氯化物不超過0.05，硫酸鹽不超過0.03，鐵鹽不超過0.003,重金屬

31、不超過0.0015，砷鹽不超過1.5ppm。（5）作用與用途）作用與用途 l-ile為必需氨基酸，是復(fù)方氨基酸輸液的重要成份之一。 2、l-賴氨酸（賴氨酸（l-lysine，l-lys）的制備）的制備 （1）l-賴氨酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) l-賴氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一人體必需氨基酸之一。分子量為146.20，結(jié)構(gòu)為： l-lys自乙醇水溶液中得針狀結(jié)晶針狀結(jié)晶，其鹽酸鹽為單斜鹽酸鹽為單斜晶系白色粉末晶系白色粉末，無臭、味苦，熔點熔點263264，易溶于水，幾乎不溶于乙醇和乙醚。pi為為10.56， （2）工藝路線）工藝路線（3）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 菌種為北京棒狀

32、桿菌北京棒狀桿菌（corymebacterium perkinense）as l.563。斜面培養(yǎng)基成分（）為斜面培養(yǎng)基成分（）為:葡萄糖0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨0.5，瓊脂2.0，ph7.0。種子培養(yǎng)基成分（種子培養(yǎng)基成分（%）為）為:葡萄糖2.0，磷酸氫二鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨0.4，玉米漿2.0，毛發(fā)水解廢液1.0，ph6.87.0，caco3 0.5。 1000ml三角瓶中種子培養(yǎng)基裝量200ml，接種一環(huán)斜面培養(yǎng)菌種，30振搖（沖程7.6cm，頻率108次min），培養(yǎng)16h。二級種子培養(yǎng)接種量2.5，培養(yǎng)48h。如此逐級擴大培養(yǎng)。 滅菌、發(fā)酵滅菌、發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)液成分

33、（）為發(fā)酵培養(yǎng)液成分（）為 淀粉水解糖13.5，磷酸二氫鉀0.1，硫酸鎂0.05，硫酸銨1.2，尿素0.4，玉米漿1.0，毛發(fā)水解廢液1.0，甘蔗糖蜜2.0，ph6.7，滅菌前加甘油聚醚ll（指5m3發(fā)酵罐）。在5m3發(fā)酵罐中投入培養(yǎng)液3噸，在1.01105pa壓力下，加熱至118120滅菌30min，立即通入冰鹽水冷卻至30，按10（vv）比例接種，以1:0.6（vv）通氣量于30發(fā)酵4251h，攪拌速度為180轉(zhuǎn)min。 發(fā)酵液處理：離心除菌體；發(fā)酵液處理：離心除菌體；80 加熱；加熱；離子交換：銨型離子交換：銨型732樹脂樹脂;ph=5.0為飽和為飽和(串聯(lián)串聯(lián))濃縮結(jié)晶：收集濃縮結(jié)晶：

34、收集ph=8.014.0洗脫液（氨水洗脫）洗脫液（氨水洗脫）三、酶轉(zhuǎn)化法三、酶轉(zhuǎn)化法 （一）基本原理及過程（一）基本原理及過程 酶轉(zhuǎn)化法酶轉(zhuǎn)化法亦稱為酶工程技術(shù)酶工程技術(shù)，實際上是在特定酶特定酶的作用下使某些化合物轉(zhuǎn)化某些化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸相應(yīng)氨基酸的技術(shù)。 酶工程法酶工程法與直接發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸之反應(yīng)本質(zhì)相本質(zhì)相同同，皆屬酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，但前者為單酶或多酶的高密度單酶或多酶的高密度轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化，而后者為多酶低密度多酶低密度轉(zhuǎn)化。 酶工程技術(shù)酶工程技術(shù)工藝簡單，產(chǎn)物濃度高產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率及生轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率產(chǎn)效率較高，副產(chǎn)物少。 固定化酶或細(xì)胞固定化酶或細(xì)胞可進(jìn)行連續(xù)操作，節(jié)省能源和勞務(wù)，并可長

35、期反復(fù)使用。（二）酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 目前醫(yī)藥工業(yè)中，用酶工程法生產(chǎn)的氨基酸已有十十多種多種。 dl-蛋氨酸、dl-纈氨酸、dl-苯丙氨酸、dl-色氨酸、dl-丙氨酸及dl-蘇氨酸等分別經(jīng)氨基?；覆鸢被；覆鸱址肢@得了相應(yīng)的l-氨基酸，并已投入了工業(yè)化生產(chǎn)。 1、l-天冬氨酸及天冬氨酸及l(fā)-丙氨酸的制備丙氨酸的制備 （1）l-天冬氨酸及天冬氨酸及l(fā)-丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)丙氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l天冬氨酸（天冬氨酸（l-aspartic acid，asp）的結(jié)構(gòu)與）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)性質(zhì) l-asp存在于所有蛋白質(zhì)分子中，含兩個羧基兩個羧基和一個氨基，為酸

36、性酸性氨基酸，分子式為c4h7no4，分子量為133.10，結(jié)構(gòu)式為： l-asp的化學(xué)名稱為-氨基丁二酸或氨基琥珀酸，純品為白色菱形葉片狀結(jié)晶菱形葉片狀結(jié)晶，等電點為等電點為2.77，熔點為269271。溶于水及鹽酸溶于水及鹽酸，不溶于乙醇及乙醚不溶于乙醇及乙醚，在25水中溶解度為水中溶解度為0.8，在，在75水中為水中為2.88，在乙醇中為0.00016。在堿性溶液中為左旋性左旋性，在酸性溶液中為右旋性右旋性。25d 為 +5.05（c0.52.0，在水中）， 25d為 +25.4（c0.52.0，在5moll hcl中）。 l-丙氨酸（丙氨酸（l-alanine，簡稱，簡稱l-ala）的

37、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l-ala存在于所有蛋白質(zhì)分子中,為中性氨基酸中性氨基酸。分子式為c3h7no2，分子量為89.09，結(jié)構(gòu)式為： l-ala自水和乙醇中形成菱形結(jié)晶自水和乙醇中形成菱形結(jié)晶，等電點為等電點為6.0，分解點為297，在在25水中溶解度為水中溶解度為16.65，在在75水中為水中為28.5，在20乙醇中為0.16，不溶于丙酮及乙醚。25d 為+18（c0.52.0，在水中）， 25d為-14.6（c0.52.0，在5moll hcl中）。（2）l-asp和和l-ala的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) （3）工藝路線）工藝路線固定化酶固定化酶 凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)的

38、使用的酶都稱為固定化酶。固定化酶。 通常采用的固定化方法可大體概括為四種類型：吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法。 吸附法吸附法 這是通過載體表面和酶分子表面間的次級次級鍵相互作用鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，又可分：物理吸物理吸附和離子交換吸附附和離子交換吸附。 物理吸附物理吸附是通過氫鍵、疏水鍵和氫鍵、疏水鍵和電子親和力電子親和力等物理作用力將酶固定于不溶性載體不溶性載體的方法。 常用的載體載體有：皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠和微孔玻璃等無機吸附劑，纖維素、膠原、賽珞玢賽珞玢以及火棉膠等有機吸附劑有機吸附劑。 最常用的交換劑有cm（羧甲基）纖維素、（羧

39、甲基）纖維素、deae（二乙基氨基乙基）纖維素、（二乙基氨基乙基）纖維素、deae葡聚葡聚糖凝膠糖凝膠等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑，約50150mg蛋白g載體。 共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法 這是借助共價鍵共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。 常用的載體載體有：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐共聚物、聚苯乙烯、尼龍等；還有無機載體如多孔玻璃等。 交聯(lián)法交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶分子與酶分子間或酶分子與惰性蛋白間、或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以共價惰性蛋白

40、間、或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以共價鍵鍵制備固定化酶。 包埋法包埋法 將聚合物聚合物的單體單體和酶溶液混合后，再借助聚合促進(jìn)聚合促進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行聚合，將酶包埋于聚合物中以達(dá)到固定化的目的。 （1）膠格包埋膠格包埋最常用的包埋劑是聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠，它以丙烯酰胺丙烯酰胺為單體、n，n-亞甲基雙丙烯酰胺為交亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聯(lián)劑聚合而成。（2）微囊型包埋微囊型包埋是用直徑幾十到幾百微米、厚約25nm的半透膜半透膜將酶分子進(jìn)行包埋固定化的方法。（3）脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋 脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包裹空間的微球體微球體。 輔酶及偶聯(lián)酶輔酶

41、及偶聯(lián)酶的固定化 輔酶物質(zhì)的固定化一般采用載體共價偶聯(lián)法載體共價偶聯(lián)法。 （4）工藝過程）工藝過程 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng) 大腸桿菌（大腸桿菌（esscherichia coli）as1.881的培養(yǎng)的培養(yǎng) 斜面培斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基； 搖瓶培養(yǎng)基成分（）搖瓶培養(yǎng)基成分（）為玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，mgso47h2o0.02，氨水調(diào)ph6.0,煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量50100m1。 從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種于搖瓶培養(yǎng)基中，37振搖培養(yǎng)24h，逐級擴大培養(yǎng)至10002000l規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1moll hcl調(diào)ph5.0，升溫至45并保

42、溫1h，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)筒式高速離心機轉(zhuǎn)筒式高速離心機收集菌體（含天冬氨酸酶）收集菌體（含天冬氨酸酶），備用。德阿昆哈假單胞菌（德阿昆哈假單胞菌（pseudomonas dacunhae）68變異變異株的培養(yǎng)株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（）為斜面培養(yǎng)基組成（）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，nac1 0.5，ph7.0，瓊脂2.0。 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基相同，唯不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為40m1。 搖瓶培養(yǎng)基組成搖瓶培養(yǎng)基組成（）為l-谷氨酸3.0，蛋白胨0.9，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氯鉀0.05，mgso47h2o 0.01，用氨水調(diào)ph 7.2，5

43、00ml三角瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。 將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30振搖培養(yǎng)8h，再接種子搖瓶培養(yǎng)基中，30振蕩培養(yǎng)24h，如此逐級擴大至10002000l的培養(yǎng)罐培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后用1mollhcl調(diào)ph至4.75，于30保溫1h，用轉(zhuǎn)筒式高速離心機離心收集菌體（含含l-天冬氨天冬氨酸酸-脫羧酶），備用。脫羧酶），備用。 細(xì)胞固定細(xì)胞固定ecoli的細(xì)胞固定的細(xì)胞固定 取濕菌體20kg懸浮于80l，生理鹽水（或離心后的培養(yǎng)清液）中，保溫保溫至至40，再加入90l保溫至保溫至40的12明膠明膠溶液及10l1.0戊二醛戊二醛溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置冷卻凝固，再漫于漫于0.25

44、戊二醛溶液戊二醛溶液中。于5過夜后，切成35mm的立方小塊，浸于0.25戊二醛戊二醛溶液中5過夜、蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶的固定化e.coli，備用。假單胞菌體固定假單胞菌體固定 取濕菌體20kg，加生理鹽水?dāng)噭虿⑾♂屩?0l，另取溶于生理鹽水的5角叉菜膠角叉菜膠溶液85l，兩液均保溫至45后混合，冷卻至5成膠。浸于600l2%kcl和和0.2moll己二胺的己二胺的0.5moll ph7.0的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液中中，5下攪拌10分鐘，加戊二醛至戊二醛至0.6moll濃度濃度，5攪拌30分鐘，取出切成35mm的立方小塊，用2% kcl溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得含含l-天冬天

45、冬氨酸氨酸-脫羧酶的固定化細(xì)胞脫羧酶的固定化細(xì)胞，備用。 轉(zhuǎn)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng) 將保溫至保溫至37的lmoll延胡索酸銨延胡索酸銨（含1mmoll mgc12，ph8.5）底物溶液按一定空間速度（sv）連續(xù)流過生物反應(yīng)堆反應(yīng)堆i，控制達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率（最大轉(zhuǎn)化率（95）為限度，收集轉(zhuǎn)化液制備制備l-asp或用于生物反應(yīng)堆反應(yīng)堆的再轉(zhuǎn)化。 當(dāng)需要生產(chǎn)l-丙氨酸時，向上述轉(zhuǎn)化液中加磷酸磷酸吡哆醛吡哆醛至0.1mmoll濃度濃度，調(diào)ph6.0，保溫至37，按一定空間速度流入1.515105pa壓力下的生物反應(yīng)堆，控制達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率（最大轉(zhuǎn)化率（95）為限，收集轉(zhuǎn)化液，用于制取l-丙氨酸丙氨酸。 產(chǎn)品純化與

46、精制產(chǎn)品純化與精制 生物反應(yīng)堆生物反應(yīng)堆轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清，攪拌下用1moll hcl調(diào)調(diào)ph2.8，5結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌抽干，105干燥干燥得l-asp粗粗品。品。粗品用稀氨水溶解（稀氨水溶解（ph5）成15溶液，加1%（wv）活性炭，）活性炭，70攪拌脫色攪拌脫色1h過濾過濾,濾液于5結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，85真空干燥得藥用藥用l-asp。 生物反應(yīng)堆生物反應(yīng)堆轉(zhuǎn)化液過濾澄清，于于6070下減壓濃縮至原體積的50，冷卻后加等體積甲醇甲醇，5結(jié)晶過夜結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶并用少量冷甲醇洗滌抽干，80真空干燥得l-ala粗品。粗品用3倍體積（倍體積（wv）去離子水于80攪拌溶解，加

47、0.5%（wv）藥用活性）藥用活性炭炭于70攪拌脫色攪拌脫色1h，過濾，濾液冷后加等體積甲醇，5結(jié)晶過夜結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，于80真空干燥得藥用lala。 （5）檢驗）檢驗 （6）作用與用途）作用與用途 l-asp有助于鳥氨酸循環(huán)，促進(jìn)氨和co2生成尿素，降低血中氨和co2,增強肝功能，消除疲勞，用于治療慢性肝炎、肝硬化及高血氨癥。同時l-asp和l-ala都是復(fù)合氨基酸輸液的原料。 2，酶拆分法制備，酶拆分法制備l-苯丙氨酸苯丙氨酸 （1）l-苯丙氨酸（苯丙氨酸（l-phenylalanine，l-phe）的結(jié)）的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)構(gòu)與性質(zhì) l-phe，存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體必需人體必需氨基酸之

48、一氨基酸之一，其分子式為c9h11no2，分子量為165.19，結(jié)構(gòu)為： l-phe自水中結(jié)晶成白色葉片狀晶體葉片狀晶體，無臭，微苦，pi為為5.48；分解點為分解點為283284。在25水中溶解度為2.96，在75水中為6.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。1%水溶液水溶液ph為為5.46.0。25d為-4.47（c0.52.0，在5moll hcl中），25d為-34.5（c0.52.0，在水中）。 （2）酶拆分）酶拆分dl-phe的原理：的原理：dl-phe與醋酸酐反應(yīng)醋酸酐反應(yīng)生成乙酰乙酰-dl-phe（ac-dl-phe），氨基?；缚蓪０被；缚蓪Ｒ恍运庖恍运鈇c-l-ph

49、e的酰胺鍵生成的酰胺鍵生成l-phe，而不水解不水解ac-d-phe酰胺鍵酰胺鍵，再利用利用l-phe與與ac-d-phe在水中溶在水中溶解度的差異進(jìn)行分離解度的差異進(jìn)行分離。 ac-d-phe又可經(jīng)消旋生成又可經(jīng)消旋生成ac-dl-phe，再行水解和分離，如此反復(fù)進(jìn)行，可將dl-phe全部轉(zhuǎn)化為l-phe。dl-phe拆分的基本反應(yīng)過程如下：（3）工藝路線）工藝路線 （4）工藝過程）工藝過程 固定化氨基?；傅闹苽涔潭ɑ被；傅闹苽?取deae-sephadex a-50（二乙氨基乙基葡聚糖,g后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，g-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克）于去離子水中充

50、分浸泡后，依次用10倍量0.5moll hcl和和0.5moll naoh溶液攪拌處理溶液攪拌處理30min，再用去離子水洗至中性，然后依次用0.1moll及及0.01moll的的ph7.0磷酸緩沖液處理磷酸緩沖液處理12h，濾干備用。 另取培養(yǎng)4050h的米曲擴大曲米曲擴大曲用6倍量去離子水分兩次抽提，濾去殘渣濾去殘渣。濾液用2moll naoh溶液調(diào)ph6.77.0，按100l酶液加1kg已處理的濕deae-sephadexa-50的比例混合比例混合，于04攪拌吸附45h，濾取deae-sephadex a-50，依次用去離子水、0.1moll醋酸鈉醋酸鈉、0.01moll的ph7.0磷酸

51、緩沖液洗滌34次，濾干得固定化氨基?；腹潭ɑ被；?，加1甲苯甲苯后于冷庫中貯存，備用。 ac-dl-phe的制備的制備 將dl-phe、冰醋酸及醋酸酐冰醋酸及醋酸酐按1 7 1（wvv）的比例加入反應(yīng)釜中，90反反應(yīng)應(yīng)45h，回收醋酸，濃縮液加一定量去離子水，再濃縮至一定體積，冷卻結(jié)晶冷卻結(jié)晶，濾取結(jié)晶于60真空干真空干燥得燥得acdlphe。 酶水解酶水解 在1000l反應(yīng)罐中加700l 0.1moll ac-dl-phe鈉鈉鹽溶液鹽溶液，攪拌下滴加6moll hcl至ph6.77.0，加1520kg固定化氨基?；腹潭ɑ被；?，50反應(yīng)反應(yīng)45h，過濾，濾液待分離lphe，固定化

52、酶再用于轉(zhuǎn)化。 分離純化分離純化 上述濾液用6moll hcl調(diào)至ph4.85.1，減壓濃縮濃縮至35l左右，濃縮液于0結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶并用10l冷乙醇洗滌三次，抽干,于80烘烘34h，得lphe粗品。濾液和洗滌液合并后減壓濃縮至20l左右，得ac-d-phe溶液，待消旋和再轉(zhuǎn)化。 精制精制 取50l去離子水于100l反應(yīng)罐中，加熱至95100，投入5kg lphe粗品粗品，攪拌溶解溶解，加藥用活性炭活性炭0.25kg，攪拌脫色3min。趁熱過濾趁熱過濾，濾液轉(zhuǎn)移至200l結(jié)晶罐中，冷卻至40，加50 l 40 95乙醇，用乙醇，用6moll hcl調(diào)調(diào)ph5.5，于0結(jié)晶結(jié)晶過夜，濾取

53、結(jié)晶，用10l冷乙醇洗滌冷乙醇洗滌34次次，抽干，于80干燥34h。母液濃縮回收l-phe結(jié)晶，所得結(jié)晶如上法重結(jié)晶一次，得藥用lphe。結(jié)晶母液及洗滌液合并,減壓濃縮后轉(zhuǎn)入粗品母液，待消旋待消旋。 acdphe的消旋的消旋 上述粗品及精品粗品及精品l-phe母液母液及洗滌液合并后濃縮至60l,于100l反應(yīng)罐中在攪拌下緩緩加入醋酸酐醋酸酐18.5l，在2545攪拌反應(yīng)30min，冷卻至室溫，放置6h，用濃鹽酸調(diào)調(diào)ph l.52.0，5結(jié)晶過夜，濾取結(jié)晶，用去離子水洗滌35次，每次20l，抽干，于40真空干燥得真空干燥得acdlphe。 （5）檢驗）檢驗 應(yīng)為白色葉片狀結(jié)晶，其含量應(yīng)在98.5

54、101.5之間，25d為-32.3+34.3，1水溶液ph為5.46.0，干燥失重應(yīng)不超過0.3，熾灼殘渣應(yīng)不超過0.4，氯化物、硫酸鹽及重金屬均與異亮氨酸規(guī)定相同，砷鹽應(yīng)不超過1.5ppm，鐵鹽應(yīng)不超過0.003%。 含量測定含量測定：（6）作用與用途）作用與用途 l-苯丙氨酸為復(fù)合氨基注射液復(fù)合氨基注射液的重要原料之一，也是合成苯丙氨酸 氮芥及對氟苯丙氨酸等抗癌藥的原料。 四、化學(xué)合成法四、化學(xué)合成法 （一）基本原理與過程（一）基本原理與過程 以-鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、鹵代羧酸、醛類、甘氨酸衍生物、異氰酸鹽、乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、乙酰氨基丙二酸二乙酯、鹵代烴、-酮

55、酸及某些氨基酮酸及某些氨基酸酸為原料，經(jīng)氨解、水解、縮合、取代及氫化還原氨解、水解、縮合、取代及氫化還原等化學(xué)反應(yīng)合成-氨基酸的方法稱為化學(xué)合成法化學(xué)合成法。一般合成法一般合成法和不對稱合成法不對稱合成法兩大類。 一般合成法一般合成法包括鹵代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法、異氰酸酯（鹽）合成法及醛縮合法等；產(chǎn)物皆為dl-型氨基酸混合物型氨基酸混合物。 不對稱合成法不對稱合成法包括直接合成、-酮酸反應(yīng)及不對稱不對稱催化加氫等方法催化加氫等方法。產(chǎn)物為l-型氨基酸型氨基酸。（二）化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝（二）化學(xué)合成法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝 理論上理論上所有氨基酸皆可由化學(xué)合

56、成法制造，但在目前，只有當(dāng)采用其它方法生產(chǎn)很不經(jīng)濟經(jīng)濟時才采用化學(xué)合成法生產(chǎn)，如甘氨酸、dl-蛋氨酸及dl-丙氨酸等 現(xiàn)僅介紹l-脯氨酸及脯氨酸及l(fā)-蘇氨酸蘇氨酸的化學(xué)合成及其分離純化工藝。1、l-脯氨酸（脯氨酸（l-proline，l-pro）的制備）的制備 （1）l-脯氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)脯氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l-脯氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，雞毛中含量較豐富。其化學(xué)名稱為吡咯啶-甲酸或吡啶烷環(huán)-2-羧酸，分子式為c5h9no2，分子量為115.13。 l-pro自乙醇-乙醚中得白色粉末狀結(jié)晶，pi為為6.3，熔點220222。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。極易溶于水，不溶于乙醇及乙醚。有旋光。（2

57、）合成路線）合成路線 : l-pro可采用化學(xué)合成法、發(fā)酵法及蛋白質(zhì)原料水解分離法生產(chǎn)，合成法也有不同的原料和工藝。以濃硫酸為脫水劑，使以濃硫酸為脫水劑，使l-谷氨酸與乙醇谷氨酸與乙醇縮合成縮合成l-谷氨酸谷氨酸-乙酯，后者經(jīng)硼氫化鉀還原即成乙酯，后者經(jīng)硼氫化鉀還原即成l-pro。反應(yīng)過程反應(yīng)過程（3）工藝路線）工藝路線五氯酚乙醇溶液得復(fù)鹽沉淀。五氯酚乙醇溶液得復(fù)鹽沉淀。3%氨水解析氨水解析 乙醚去雜質(zhì)。乙醚去雜質(zhì)。含量測定含量測定： 2、l-蘇氨酸（蘇氨酸（l-threonine，l-thr）的制備）的制備 （1）l-蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)蘇氨酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) l-蘇氨酸存在于所有蛋白質(zhì)中，為人體

58、必需氨基酸之一人體必需氨基酸之一。其分子式為c4h9no3，分子量為119.12， l-thr純品為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，微甜，等電點為等電點為6.16,熔點為255257，溶于水，不溶于溶于水，不溶于乙醇、乙醚及氯仿乙醇、乙醚及氯仿。在堿液中不穩(wěn)定，受熱易分解為甘氨酸和乙醛。 l-thr分子中有兩個不對稱碳原子，故有l(wèi)dthr和ld別蘇氨酸四種異構(gòu)體四種異構(gòu)體，唯l-thr具有生理活性。（2）合成路線）合成路線: l-thr的合成原料為甘氨酸和乙醛。甘氨酸先與堿式硫酸銅反應(yīng)生成甘氨酸銅，后者在堿性條件下與乙醛縮合成dl-thr銅，并以播種結(jié)晶法（優(yōu)先結(jié)晶法）拆分得l-thr和d-thr

59、。反應(yīng)過程為：（3）工藝路線）工藝路線 拆分拆分 取72l去離子水、20kg dl-thr精品及2.25kg d-thr于200l反應(yīng)罐中，攪拌下迅速升溫到95至全溶，再迅速降溫至40，投入投入225g d-thr結(jié)晶，結(jié)晶，緩緩降溫至2930，迅速過濾，濾餅于80，烘干得d-thr粗品。濾液再投入與已分出的d-thr等量的dl-thr，余操作與拆分d-thr相同，投入225g l-thr結(jié)晶，最后得l-蘇氨酸粗品。母液再投入適量d-thr、dl-thr及水，令三者比例為令三者比例為1:0.9 3.2。第三節(jié)第三節(jié) 氨基酸輸液氨基酸輸液 多種結(jié)晶l-氨基酸依特定比例混合制成的靜脈內(nèi)輸靜脈內(nèi)輸注

60、液注液謂之氨基酸輸液氨基酸輸液。氨基酸輸液可直接注入進(jìn)食不足者的血液中，促進(jìn)蛋白質(zhì)、酶及肽類激素的合成，提高血漿蛋白濃度與組織蛋白含量，維持氮平衡，調(diào)氮平衡，調(diào)節(jié)肌體正常代謝。節(jié)肌體正常代謝。 現(xiàn)已有含氨基酸數(shù)目為11、14、18及20種等多種輸液類型，氨基酸濃度分別有3、5、9、10及12等多種規(guī)格。 有些氨基酸輸液還加入山梨醇、木糖、維生素、山梨醇、木糖、維生素、na、k、ca2+或mg2+等成分，以補充能量，提高氨氨基酸基酸的利用率及其營養(yǎng)價值營養(yǎng)價值，也有些氨基酸輸液與右氨基酸輸液與右旋糖酐配伍旋糖酐配伍制成較理想的代血漿代血漿。一、氨基酸輸液的組成與要求一、氨基酸輸液的組成與要求 輸