形態(tài)學(xué)研究及其方法進(jìn)展PPT課件

1、形態(tài)學(xué)研究及其形態(tài)學(xué)研究及其 方方 法法 進(jìn)進(jìn) 展展宋天保2006年10月形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展基于基于PCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法1.1 1.1 形態(tài)學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史形態(tài)學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史解剖學(xué)的發(fā)展解剖學(xué)的發(fā)展Galen(130 - 200) 論解剖過(guò)程論解剖過(guò)程, ,論身論身體各部器官的功能體各部器官的功能Vesalius(1514 - 1564) 人體的構(gòu)造人體的構(gòu)造(1543)(1543)光學(xué)顯微鏡的發(fā)明光學(xué)顯微鏡的發(fā)明Leeuwenhoek(1632-1723)Leeuwenhoek(16

2、32-1723)Hooke(1635-1702)Hooke(1635-1702)顯微圖譜顯微圖譜（16651665）1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立和完善細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立和完善Schleiden(1804-1881)Schleiden(1804-1881)“植物發(fā)生論植物發(fā)生論”（1838）Schwann(1810-1882)Schwann(1810-1882)“關(guān)于動(dòng)植物的結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)一致關(guān)于動(dòng)植物的結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)一致性的顯微研究性的顯微研究” (1839) Virchow(1821-1902)Virchow(1821-1902)細(xì)胞病理學(xué)細(xì)胞病理學(xué)(1858) “

3、omnis cellula e cellula” 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法電子顯微鏡的發(fā)明和超微結(jié)構(gòu)研究電子顯微鏡的發(fā)明和超微結(jié)構(gòu)研究KnollKnoll和和Ruska(1932)Ruska(1932)Nobelprize19861. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法現(xiàn)代形態(tài)學(xué)的發(fā)展現(xiàn)代形態(tài)學(xué)的發(fā)展細(xì)胞細(xì)胞( (組織組織) )化學(xué)化學(xué), ,免疫細(xì)胞化免疫細(xì)胞化學(xué)學(xué), ,原位分子雜交原位分子雜交, ,細(xì)胞培養(yǎng)等細(xì)胞培養(yǎng)等向定量化、自動(dòng)化和數(shù)字化向定量化、自動(dòng)化和數(shù)字化發(fā)展發(fā)展1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和

4、方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法1.2 1.2 形態(tài)學(xué)的作用和地位形態(tài)學(xué)的作用和地位(1)(1)探索生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)探索生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(2)(2)為某些學(xué)說(shuō)的建立提供形態(tài)基礎(chǔ)為某些學(xué)說(shuō)的建立提供形態(tài)基礎(chǔ) 如如: :神經(jīng)元學(xué)說(shuō)神經(jīng)元學(xué)說(shuō), ,肌絲滑動(dòng)學(xué)說(shuō)肌絲滑動(dòng)學(xué)說(shuō)(3)(3)在生命科學(xué)研究中的地位逐漸上升在生命科學(xué)研究中的地位逐漸上升(4)(4)與機(jī)能學(xué)研究相輔相成與機(jī)能學(xué)研究相輔相成Nobelprize 19061. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法1.3 1.3 形態(tài)學(xué)研究的思路形態(tài)學(xué)研究的思路(1) (1) 水平：水平： 大體觀測(cè)大體觀測(cè)( (器官器官) )立體顯微鏡立體顯微

5、鏡( (組織組織)-)-光鏡光鏡( (細(xì)細(xì) 胞胞) )電鏡電鏡( (亞細(xì)胞亞細(xì)胞)-)-掃描探針顯微鏡掃描探針顯微鏡( (分子和原分子和原 子子) )(2)(2)對(duì)象：對(duì)象：活體活體離體培養(yǎng)離體培養(yǎng) 固定組織固定組織(3)(3)方法方法: :1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法選用形態(tài)學(xué)方法時(shí)的基本思考：選用形態(tài)學(xué)方法時(shí)的基本思考：研究目的研究目的有無(wú)必要有無(wú)必要選用何種方法選用何種方法有無(wú)條件有無(wú)條件高質(zhì)量照片高質(zhì)量照片結(jié)合其他資料分析結(jié)合其他資料分析注意人工假象注意人工假象( (預(yù)成論預(yù)成論, ,鳳鳳漢小體漢小體) )1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法1.

6、4 1.4 形態(tài)學(xué)研究的方法形態(tài)學(xué)研究的方法(1)(1)普通光鏡術(shù)：普通光鏡術(shù)：常規(guī)方法常規(guī)方法: :固定固定切片切片-染色染色(H-E)(H-E)特殊染色特殊染色: :1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(2)(2)特殊光鏡術(shù)：特殊光鏡術(shù)： 熒光顯微鏡熒光顯微鏡相差顯微鏡相差顯微鏡1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡 激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(3)(3)電鏡術(shù)：電鏡術(shù)： 透射電鏡術(shù)透射電鏡術(shù) 掃描電鏡術(shù)掃描電鏡術(shù) 冷凍蝕刻術(shù)冷凍蝕刻術(shù) 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法

7、形態(tài)學(xué)研究思路和方法(4)(4)組織組織( (細(xì)胞細(xì)胞) )化學(xué)術(shù)：化學(xué)術(shù)：糖糖, ,脂類(lèi)脂類(lèi). .蛋白蛋白, ,核酸核酸, ,酶等酶等 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(5)(5)放射自顯影術(shù)：放射自顯影術(shù)： 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(6)(6)免疫組織免疫組織( (細(xì)胞細(xì)胞) )化學(xué)術(shù)：化學(xué)術(shù)： PAP,ABC,SPPAP,ABC,SP1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(7)(7)原位雜交：原位雜交：探針探針:DNA,RNA,ODN:DNA,RNA,ODN標(biāo)記物標(biāo)記物: : 放射性核素放射性核素 非放射性非放射性顯示顯示:

8、:放射自顯影放射自顯影 免疫組化免疫組化 熒光熒光 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(8) (8) 細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)： 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(9) (9) 活體與活細(xì)胞染色：活體與活細(xì)胞染色： 1. 1. 形態(tài)學(xué)研究思路和方法形態(tài)學(xué)研究思路和方法(10) (10) 形態(tài)研究的定量術(shù)：形態(tài)研究的定量術(shù)： 形態(tài)計(jì)量術(shù)形態(tài)計(jì)量術(shù)( (體視學(xué)體視學(xué)) ) 顯微分光光度術(shù)顯微分光光度術(shù) 圖像分析術(shù)圖像分析術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展2.1 EPOS2.1 EPOS法法(enhanced polymer on

9、e step method)(enhanced polymer one step method)原理：原理：酶酶(HRP)(HRP)+ +惰性聚合物惰性聚合物( (葡聚糖葡聚糖) )酶標(biāo)聚合物酶標(biāo)聚合物 + AB1 + AB1 酶酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1方法：方法：酶酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1顯色。顯色。變法：變法：( (rapid microwave rapid microwave one step method, one step method,RAMOSRAMOS) ) 加酶加酶- -聚合物聚合物-AB1-AB1蓋玻片蓋玻片 微波爐微波爐顯色顯色2. 2. 免疫組化

10、方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展特點(diǎn)：特點(diǎn)：只有只有1 1步，特異性強(qiáng)；步，特異性強(qiáng)； 敏感性高敏感性高（70 mole70 mole酶酶/1 mole/1 mole聚合物）聚合物）； 簡(jiǎn)便、快速簡(jiǎn)便、快速; ; 適用于石蠟、冰凍切片，細(xì)胞涂適用于石蠟、冰凍切片，細(xì)胞涂 片等。片等。 RAMOSRAMOS法還有：法還有： 試劑用量少，成本低；試劑用量少，成本低； 無(wú)脫片現(xiàn)象；無(wú)脫片現(xiàn)象； 無(wú)邊緣現(xiàn)象，染色均勻。無(wú)邊緣現(xiàn)象，染色均勻。 2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展2.2 EnVision2.2 EnVision法法原理：原理：酶酶(HRP)(HRP)+ +惰性聚合物惰性聚合物( (葡聚糖

11、葡聚糖) )酶標(biāo)聚合物酶標(biāo)聚合物 + AB2 + AB2 AB2- AB2-聚合物聚合物- -酶酶( (含含100100個(gè)酶、個(gè)酶、1515個(gè)個(gè)Ab2Ab2分子分子) )方法：方法：AB1AB1 AB2- AB2-聚合物聚合物- -酶酶顯色顯色2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展特點(diǎn)：特點(diǎn)： 敏感性高敏感性高; ; 背景低背景低（體內(nèi)無(wú)葡聚糖）（體內(nèi)無(wú)葡聚糖）; ; 孵育時(shí)間短孵育時(shí)間短（37, 1537, 15 min min）, ,適用于術(shù)中適用于術(shù)中 病理診斷病理診斷; ; Ab1 Ab1最好用單抗，濃最好用單抗，濃 度可大一點(diǎn)度可大一點(diǎn)2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)

12、展2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展2.3 CSA2.3 CSA法法(catalyzed signal amplification)(catalyzed signal amplification)原理：原理：基本方法為基本方法為SPSP法法 加用生物素標(biāo)記酪胺加用生物素標(biāo)記酪胺 HRPHRP催化酪胺使之沉積在催化酪胺使之沉積在Ag-AbAg-Ab結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)2. 2. 免疫組化方法進(jìn)展免疫組化方法進(jìn)展方法：方法： AB1 AB1 AB2-Bio AB2-Bio SA-HRP SA-HRP 酪胺酪胺-Bio -Bio SA-HRP SA-HRP 顯色顯色 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感性高敏感性

13、高; Ab1; Ab1稀釋度高，背景染色低稀釋度高，背景染色低; ; 省時(shí)省時(shí); ; 適用于信號(hào)弱的組織適用于信號(hào)弱的組織（戊二醛固定）（戊二醛固定）; ; 第第2 2次用的次用的SASA亦可用熒光素、膠體金、亦可用熒光素、膠體金、AKPAKP標(biāo)記標(biāo)記; ; 也可用于放大原位雜交信號(hào)也可用于放大原位雜交信號(hào). . 3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.1 3.1 原位原位PCRPCR 定義：定義：將將PCRPCR的高效擴(kuò)增與的高效擴(kuò)增與ISHISH的細(xì)胞定位相結(jié)合，在的細(xì)胞定位相結(jié)合，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷

14、貝或低拷貝的特定DNADNA或或RNARNA序序列，同時(shí)對(duì)含靶序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。列，同時(shí)對(duì)含靶序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。分類(lèi)：分類(lèi)：原位原位PCRPCR：以：以DNADNA為起始模板為起始模板PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。又分直接法和間接法物。又分直接法和間接法原位反轉(zhuǎn)錄原位反轉(zhuǎn)錄PCRPCR：以：以mRNAmRNA為起始物為起始物反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA以以cDANcDAN為模板行為模板行PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)：以原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)：以mRNAmRNA為模板直接擴(kuò)增為模板直接擴(kuò)增RNARNA靶序列。靶序

15、列。3.2 3.2 直接法原位直接法原位PCRPCR 特點(diǎn)：特點(diǎn)：PCRPCR擴(kuò)增時(shí)用標(biāo)記擴(kuò)增時(shí)用標(biāo)記dNTPdNTP或引物或引物, ,使擴(kuò)增產(chǎn)物直接使擴(kuò)增產(chǎn)物直接 標(biāo)記標(biāo)記標(biāo)記物：標(biāo)記物：常用同位素、生物素、地高辛常用同位素、生物素、地高辛操作程序：操作程序：組織細(xì)胞制備：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理固定、預(yù)處理原位擴(kuò)增：引物原位擴(kuò)增：引物, TaqDNA聚合酶聚合酶,標(biāo)記標(biāo)記dNTP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：放擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：放射自顯影，射自顯影，ICC3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)： 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、流程短、省時(shí)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、流程短、省

16、時(shí) 缺點(diǎn)：特異性差，假陽(yáng)性率高缺點(diǎn)：特異性差，假陽(yáng)性率高（固定、包埋、制片等使（固定、包埋、制片等使 標(biāo)本內(nèi)標(biāo)本內(nèi)DNADNA受損，受損， DNADNA修復(fù)時(shí)，標(biāo)記修復(fù)時(shí)，標(biāo)記dNTPdNTP進(jìn)入非靶進(jìn)入非靶 序列；引物與模板的錯(cuò)配）序列；引物與模板的錯(cuò)配） 擴(kuò)增效率低擴(kuò)增效率低 不適用于切片標(biāo)本不適用于切片標(biāo)本（切片比細(xì)胞標(biāo)本（切片比細(xì)胞標(biāo)本DNADNA受損重）受損重）3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.3 3.3 間接法原位間接法原位PCRPCR 特點(diǎn)：特點(diǎn)：PCRPCR體系中體系中dNTPdNTP和引物均不標(biāo)記和引物均不標(biāo)記 PCRP

17、CR擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記探針行原位雜交擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記探針行原位雜交標(biāo)記物：標(biāo)記物：以生物素、地高辛較為常用以生物素、地高辛較為常用操作程序：操作程序：組織細(xì)胞制備：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理固定、預(yù)處理滲入和原位擴(kuò)增：滲入和原位擴(kuò)增：dNTP，引物，引物, Taq DNA聚合酶聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：ICC原位雜交：原位雜交： 用特異性標(biāo)記用特異性標(biāo)記探針探針3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)：目前最常用目前最常用 優(yōu)點(diǎn)：擴(kuò)增效率高優(yōu)點(diǎn)：擴(kuò)增效率高 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)（雜交探針特異性結(jié)合靶序列，不與擴(kuò)增（雜交探針特異性結(jié)合靶序

18、列，不與擴(kuò)增 產(chǎn)物中的非靶序列結(jié)合）產(chǎn)物中的非靶序列結(jié)合） 可用于細(xì)胞制備和石蠟切片標(biāo)本可用于細(xì)胞制備和石蠟切片標(biāo)本 缺點(diǎn)：操作復(fù)雜缺點(diǎn)：操作復(fù)雜3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR舉例：舉例：石蠟切片，石蠟切片，DigDig標(biāo)記標(biāo)記標(biāo)本制備：標(biāo)本制備：10%福馬林固定，石福馬林固定，石蠟切片蠟切片5 m。預(yù)處理：預(yù)處理：脫蠟至水脫蠟至水;0.2mol/L HCl，10; 5 g/ml 蛋白酶蛋白酶K 37 10; RNase消化消化37 30; Alc脫水干燥。脫水干燥。原位擴(kuò)增：原位擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增反應(yīng)液擴(kuò)增反應(yīng)液30 l，加蓋片，加蓋片封

19、邊封邊; PCR熱循環(huán)：熱循環(huán)：94 1，55 1， 72 1.5， 25-30個(gè)循環(huán)，個(gè)循環(huán)， 72延延伸伸 10； 去蓋片，去蓋片，4%4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定1010； Alc脫水干燥。脫水干燥。原位雜交：原位雜交： Dig標(biāo)記探針，標(biāo)記探針，98 變性變性10，-20 退火退火5，42 雜交過(guò)夜；雜交過(guò)夜；洗滌：洗滌：2SSC 10 3，1SSC 10 3，緩沖液洗，緩沖液洗10 3；AKP-Dig-Ab，37 ，2h;BCIP/NBT顯色；顯色；脫水、透明、封固。脫水、透明、封固。3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.4 3

20、.4 原位原位RT-PCRRT-PCR 原理：原理： 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 mRNAmRNA為模板為模板 cDNAcDNA Taq Taq聚合酶聚合酶 cDNAcDNA為模板為模板 擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物 直接直接（直接法）（直接法）或原位雜交或原位雜交（間接法）（間接法）檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 注意：注意：標(biāo)本先以標(biāo)本先以DNase處理過(guò)夜，破壞處理過(guò)夜，破壞DNA反轉(zhuǎn)錄條件反轉(zhuǎn)錄條件42,30-6042,30-60反轉(zhuǎn)錄后加熱反轉(zhuǎn)錄后加熱9090以上滅活逆轉(zhuǎn)錄酶以上滅活逆轉(zhuǎn)錄酶3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR程序：程序：組織細(xì)胞制備：組織細(xì)胞制

21、備：10%10%福馬林固福馬林固定。定。預(yù)處理：預(yù)處理：DNaseDNase消化過(guò)夜；蛋消化過(guò)夜；蛋白酶白酶K K消化消化（54,2054,20）；95,395,3滅活蛋白酶滅活蛋白酶K K。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)液含逆轉(zhuǎn)反應(yīng)液含逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、錄酶、引物、dNTPsdNTPs，并有，并有RNaseRNase抑制劑抑制劑,42,30-,42,30-6060。 95109510滅活逆轉(zhuǎn)錄滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。酶。PCRPCR擴(kuò)增：擴(kuò)增：加加TaqTaq聚合酶、聚合酶、引物、引物、dNTPsdNTPs擴(kuò)增；擴(kuò)增后擴(kuò)增；擴(kuò)增后烤烤80, 15-3080, 15-30。原位雜交：原位雜交：原位雜交后或原

22、位雜交后或直接用直接用ICCICC檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.5 3.5 原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)( (原位原位3SR3SR反應(yīng)反應(yīng)) ) 原理：原理：直接進(jìn)行直接進(jìn)行RNARNA擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低拷貝擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低拷貝mRNAmRNA特點(diǎn)：特點(diǎn)：3 3種工具酶：種工具酶：AMVAMV逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNaseRNase H H、T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶 引物引物55端有端有T7RNAT7RNA聚合酶啟動(dòng)子聚合酶啟動(dòng)子 擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)4242，2h2h，不需熱循環(huán)，不

23、需熱循環(huán)程序：程序：細(xì)胞固定、脫水干燥；細(xì)胞固定、脫水干燥； 制備制備55端含端含T7T7啟動(dòng)子的引物；啟動(dòng)子的引物； PCRPCR制備標(biāo)記探針（制備標(biāo)記探針（Dig-11-dUTPDig-11-dUTP）；）； 原位擴(kuò)增（反應(yīng)液含引物、原位擴(kuò)增（反應(yīng)液含引物、dNTPsdNTPs、3 3種酶等）；種酶等）； 原位雜交（加探針原位雜交（加探針9595變性變性1010， 4040雜交過(guò)夜，顯色雜交過(guò)夜，顯色 ）3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.6 3.6 原位原位PCRPCR的對(duì)照試驗(yàn)的對(duì)照試驗(yàn) 已知陽(yáng)性、陰性對(duì)照試驗(yàn)已知陽(yáng)性、陰性對(duì)照試驗(yàn)

24、 省去或用無(wú)關(guān)引物替代特異性引物省去或用無(wú)關(guān)引物替代特異性引物 標(biāo)本用標(biāo)本用DNaseDNase或或RNaseRNase預(yù)處理預(yù)處理 直接、間接原位直接、間接原位PCRPCR中省去中省去DNADNA聚合酶聚合酶 原位原位RT-PCRRT-PCR和原位和原位3SR3SR反應(yīng)中省去逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中省去逆轉(zhuǎn)錄酶3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.7 3.7 原位原位PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用 檢測(cè)內(nèi)源性基因檢測(cè)內(nèi)源性基因 固有基因定位固有基因定位-最敏感，低拷貝最敏感，低拷貝 異常及變異基因異常及變異基因-與遺傳性疾病的研究與遺傳性疾病的研究檢測(cè)外源

25、性基因檢測(cè)外源性基因 感染（病毒、細(xì)菌）基因感染（病毒、細(xì)菌）基因-診斷診斷 轉(zhuǎn)基因，基因治療轉(zhuǎn)基因，基因治療-基因定位、有無(wú)突變基因定位、有無(wú)突變3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR3.8 3.8 原位原位PCRPCR存在問(wèn)題及對(duì)策存在問(wèn)題及對(duì)策 敏感性：敏感性：在細(xì)胞制備高在細(xì)胞制備高( (單拷貝單拷貝) )；在切片標(biāo)本低，擴(kuò)增效率低；在切片標(biāo)本低，擴(kuò)增效率低特異性：特異性：間接法高，直接法低（假陽(yáng)性）間接法高，直接法低（假陽(yáng)性） 原位擴(kuò)增時(shí)采用熱啟動(dòng)原位擴(kuò)增時(shí)采用熱啟動(dòng)PCRPCR或套式或套式PCRPCR可提高特異性可提高特異性 引物延伸

26、時(shí)摻入引物延伸時(shí)摻入Bio-dNTPsBio-dNTPs合成的新鏈體積大合成的新鏈體積大不不 易擴(kuò)散易擴(kuò)散 用針對(duì)同一靶序列不同片段的多對(duì)引物擴(kuò)增用針對(duì)同一靶序列不同片段的多對(duì)引物擴(kuò)增多個(gè)不多個(gè)不 同長(zhǎng)度擴(kuò)增產(chǎn)物重疊交織同長(zhǎng)度擴(kuò)增產(chǎn)物重疊交織不易擴(kuò)散，且敏感性提高不易擴(kuò)散，且敏感性提高復(fù)雜性：復(fù)雜性：需規(guī)范操作，需對(duì)照試驗(yàn)，需簡(jiǎn)化操作需規(guī)范操作，需對(duì)照試驗(yàn)，需簡(jiǎn)化操作定量分析：定量分析：尚不成熟尚不成熟 3. 3. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位原位PCRPCR4.1 4.1 免疫免疫PCRPCR概述概述：利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)，將利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)，將

27、Ag-AbAg-Ab反反 應(yīng)的特異性與應(yīng)的特異性與PCRPCR的敏感性結(jié)合，用以檢測(cè)的敏感性結(jié)合，用以檢測(cè)AgAg分子。分子。原理：原理：用一用一中介分子中介分子同時(shí)結(jié)合同時(shí)結(jié)合DNADNA和和AbAb，AbAb與與AgAg特異性特異性 結(jié)合，結(jié)合，DNADNA用特異引物行用特異引物行PCRPCR擴(kuò)增，通過(guò)顯示擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增，通過(guò)顯示擴(kuò)增產(chǎn) 物對(duì)物對(duì)AgAg進(jìn)行定性和定量。進(jìn)行定性和定量。與與ELISAELISA比較：比較：本質(zhì)為本質(zhì)為ELISAELISA，但，但 作用于底物的酶被結(jié)合于作用于底物的酶被結(jié)合于AbAb的標(biāo)記的標(biāo)記DNADNA分子取代；分子取代； 酶標(biāo)顯色被酶標(biāo)顯色被PCRPCR擴(kuò)增

28、取代。擴(kuò)增取代。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感性提高近敏感性提高近1 1萬(wàn)倍，可檢測(cè)含量極低的萬(wàn)倍，可檢測(cè)含量極低的AgAg。4. 4. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位免疫原位免疫PCRPCR4.2 4.2 中介分子的種類(lèi)中介分子的種類(lèi) 蛋白蛋白A(PA)A(PA)與鏈霉親和素與鏈霉親和素(SA)(SA)嵌合分子：嵌合分子： 利用基因工程表達(dá)的嵌合分子利用基因工程表達(dá)的嵌合分子 PAPA可結(jié)合可結(jié)合IgG FcIgG Fc段，段，SASA可結(jié)合生物素化可結(jié)合生物素化DNA;DNA; 假陽(yáng)性假陽(yáng)性: :PAPA可能與標(biāo)本和血清中殘留可能與標(biāo)本和血清中殘留IgIg結(jié)合結(jié)合 抗體只能是

29、抗體只能是IgGIgG分子分子(Ab(Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA)-Bio)-SA-(Bio-DNA)： 將抗體和一段核苷酸分別生物素化，再以將抗體和一段核苷酸分別生物素化，再以SASA連接二者連接二者 抗體結(jié)合抗體結(jié)合AgAg，核酸用引物，核酸用引物PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增單鏈抗體單鏈抗體-SA-SA融合蛋白：融合蛋白： 利用基因工程將利用基因工程將McAbMcAb的重鏈和輕鏈連接成單鏈，再與的重鏈和輕鏈連接成單鏈，再與SASA連接連接 單鏈抗體單鏈抗體-SA-SA4. 4. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位免疫原位免疫PCRPCR4.3 4.3 原位免疫原

30、位免疫PCRPCR原理：原理：將將PCRPCR與免疫組化結(jié)合，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)抗原與免疫組化結(jié)合，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)抗原: : 中介分子連接中介分子連接Ag-AbAg-Ab復(fù)合物和標(biāo)記復(fù)合物和標(biāo)記DNADNAAg-Ab-DNAAg-Ab-DNA復(fù)合物復(fù)合物 PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNADNA檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物間接證明間接證明AgAg存在存在4. 4. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位免疫原位免疫PCRPCR方法：方法：石蠟切片脫蠟至水；石蠟切片脫蠟至水；0.3%0.3%雙氧水雙氧水- -甲醇甲醇2020；3 mol/L3 mol/L尿素尿素3030；10%10%

31、小牛血清小牛血清3737 3030; ;Ab1 37Ab1 37 1-2h 1-2h; PBS; PBS洗洗; ;生物素化生物素化Ab2 Ab2 37371h; PBS1h; PBS洗洗; ;SA 1:100, 1h;SA 1:100, 1h;生物素化生物素化DNADNA（20ng/20ng/片）片）37371h; 1h; PBSPBS洗后行原位洗后行原位PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增(25(25 l反應(yīng)反應(yīng)液加引物液加引物, dNTPs, Bio-dUTP, Taq酶等酶等) )；ABCABC法呈色，法呈色，復(fù)染、封片。復(fù)染、封片。4. 4. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位

32、免疫原位免疫PCRPCR增加敏感性：增加敏感性： 用放射性同位素、熒光素、酶標(biāo)記物摻入用放射性同位素、熒光素、酶標(biāo)記物摻入PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 改變改變AbAb和中介連接物濃度和中介連接物濃度 控制控制PCRPCR循環(huán)周期數(shù)、改進(jìn)循環(huán)周期數(shù)、改進(jìn)PCRPCR產(chǎn)物檢測(cè)方法產(chǎn)物檢測(cè)方法注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 防止非特異性：外源性防止非特異性：外源性DNADNA和引物應(yīng)與被檢材料固有及外來(lái)基和引物應(yīng)與被檢材料固有及外來(lái)基 因無(wú)互補(bǔ)序列因無(wú)互補(bǔ)序列 用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止殘存酶對(duì)用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止殘存酶對(duì)TaqTaq酶的降解酶的降解 充分洗滌：去除非特異結(jié)合充分洗滌：去除非特異結(jié)

33、合 設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照4. 4. 基于基于PCRPCR的原位檢測(cè)技術(shù)的原位檢測(cè)技術(shù)- -原位免疫原位免疫PCRPCR5. 5. 引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)5.15.1 原理原理(primed in situ labelling(primed in situ labelling, , PRINSPRINS) )寡核苷酸引物或變性寡核苷酸引物或變性DNADNA片段與標(biāo)本上靶片段與標(biāo)本上靶DNADNA互補(bǔ)復(fù)性互補(bǔ)復(fù)性在聚合酶作用下單次延伸（用標(biāo)記在聚合酶作用下單次延伸（用標(biāo)記dUTPdUTP），），新合成新合成DNADNA即帶有標(biāo)記物，檢測(cè)。即帶有標(biāo)記物，檢測(cè)。組織細(xì)胞制備：組織細(xì)胞制備：固定、預(yù)處理固定、預(yù)處理復(fù)性與延伸：引物復(fù)性與延伸：引物, dNTP(含標(biāo)記含標(biāo)記dUTP)，Taq DNA聚合酶聚合酶檢測(cè)：熒光顯檢測(cè)：熒光顯微鏡或微鏡或ICC5. 5. 引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)5.25.2 方法方法5.2.15.2.1 染色體標(biāo)本染色體標(biāo)本 新鮮組織塊胰酶消化成單細(xì)新鮮組織塊胰酶消化成單細(xì) 胞，制備間期核或染色體胞，制備間期核或染色體; Alc脫水，空氣干燥；脫水，空氣干燥； 94加熱，并加上加熱，并加上50 l PCR 反應(yīng)液反應(yīng)液 (含引物含引物