抗生素微生物檢定法

1、抗生素微生物檢定法抗生素微生物檢定法hplc紫外分光光度法化學滴定法效價測定sh sl th tl前 言 抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價測定方法。自20世紀40年代建立至今，在各國藥典中被普遍采用。雖然伴隨著hplc等化學分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價測定已被化學方法所取代，但由于以下原因：前 言o 微生物檢定法可直觀、特異地反映出抗生素藥品的抗菌活性；o 多組分抗生素由于不同活性組分生物活性的差異，化學測定結(jié)果難以準確表征組分組成、含量和生物活性間的關(guān)系；o 許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當?shù)幕瘜W分析方法表征其活性。 所以抗生素微生物檢定法目前在各國藥典中仍占

2、有重要地位，且短期內(nèi)化學分析法不可能取代微生物檢定法。1定義抗生素微生物檢定法o 抗生素微生物檢定法是利用抗生素在低微濃度下有選擇地抑制或殺死微生物的特點，以抗生素的抗菌活性為指標，來衡量抗生素中的有效成分效力的方法。1定義抗生素青霉素 “抗生素是微生物在代謝中產(chǎn)生的具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅他種微生物的化學物質(zhì)”。“是在低微濃度即可對某些生物的生命活性有特異抑制作用的微生物次級代謝產(chǎn)物及其衍生物 ”“抗生素是生物（包括微生物、植物、動物在內(nèi)）在其生命活動中產(chǎn)生的（或并用化學、生物或生化方法衍生的），能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學物質(zhì)的總稱?！?由生物發(fā)酵改為化學

3、合成（氯霉素）、全新結(jié)構(gòu)的全合成抗生素（氨曲南）抗腫瘤、抗寄生蟲等抗生素的不斷發(fā)現(xiàn) 、化學改造推動半合成抗生素的迅速發(fā)展 定義為1942年，鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者waksman定義：1929 年flemming發(fā)現(xiàn)第一種抗生素（ ）1.定義抗菌活性o 抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。 o 抗生素的抗菌活性通常用效價單位來表示。o 在臨床應(yīng)用中，抗生素的抗菌活性可準確地反映抗生素的醫(yī)療價值。 硫酸鏈霉素 798單位/毫克青霉素g鈉 1670單位/毫克桿菌肽 74單位/毫克1.定義抗生素效價定義o “活性”重量單位o 重量折算單位o 特定單位1.定義抗生素效價定義l “活性”重量單位：以抗

4、生素中所含特定的抗菌（抗腫瘤細胞、抗病毒）活性部分的重量作為效價單位。o 如堿性抗生素，以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素，以純酸的量作為有效部分的量。1.定義抗生素效價定義o 在抗生素的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用等方面，均以抗生素活性成分的“活性”重量計量抗生素的效價單位，采用活性成分的“活性”重量1g1效價單位的方法表示。o 抗生素效價以“單位（u）”或“微克（g ）”表示。 1.定義抗生素效價定義例：硫酸鏈霉素o 抗菌活性是以鏈霉素效價單位表示的，其鏈霉素的效價單位是以具活性成分鏈霉素堿的“活性”重量表示的，即1鏈霉素效價單位1微克鏈霉素堿，這里是“活性微克”而不是“重量微克”。1.定義抗生素

5、效價定義o 在制成鹽類或其他衍生物后，其相應(yīng)的折算效價，可以從分子量折算而得。o 如：硫酸鏈霉素的折算效價為毫克單位/7984 5813)(1000242212739211273921sohonhconhc1.定義抗生素效價定義l 重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為1單位而加以折算。o 如：青霉素g鈉 以青霉素單位也稱牛津單位（oxford unit）表示其抗菌活性，最初的定義為“1個青霉素效價單位（u）為能在50毫升肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標準菌株發(fā)育的最小青霉素劑量”。1.定義抗生素效價定義o 例：青霉素國際標準品 第一批青霉素國際標準品，青

6、霉素g鈉稱重0.6微克為1單位，即1667單位/毫克。 第二批青霉素國際標準品，青霉素g鈉稱重0.5988微克為1單位，即1670單位/毫克。1.定義抗生素效價定義l 特定單位：這一類抗生素大都組成成分較復(fù)雜，或還不易得到純品，在開始生產(chǎn)及臨床使用時，只能以一特定量的標準品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。o 如：桿菌肽國際標準品 第一批桿菌肽國際標準品為55單位/毫克； 第二批桿菌肽國際標準品為74單位/毫克。1.定義抗生素微生物檢定法o 抗生素微生物檢定法可分為： （1）稀釋法 （2）比濁法 （3）瓊脂擴散法（管碟法和打孔法） 各國藥典通常采用后兩種方法測定抗生素的效價。1.定義稀釋法o 通過監(jiān)測等

7、量的試驗菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長情況，觀察含不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中有無細菌的生長，從而測定抗生素最低抑菌濃度（mic）的方法，常用于新藥研制及臨床藥敏試驗等方面。 1 2 3 4 5 6 7 8 一 一 一 一 一 一 一 一 不同濃度的 抗生素液體培養(yǎng)基 濃 稀等量的試驗菌菌液1.定義比濁法o 通過監(jiān)測等量的試驗菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長情況，利用分光光度法測定含不同濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基的濁度，從而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素藥物的含量（效價）測定。 1.定義（瓊脂）擴散法o 通過測定由不同濃度的抗生素溶液在含有試驗菌固體培養(yǎng)基中的擴散，

8、而在其表面所產(chǎn)生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素藥物的含量（效價）測定?？股匚⑸餀z定方法比較： 1.定義管碟法 l 此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，比較標準品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。 th tl sh sl2.原理抑菌圈的形成o 兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴散作用；另一種是試驗菌的生長作用。o 當培養(yǎng)到一定時間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動作用達到動態(tài)平衡時，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗菌生長受到抑制，

9、此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。2.原理量反應(yīng)平行線原理o 量反應(yīng)平行線原理：“在屬量反應(yīng)的指標中，當對數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標準品的作用性質(zhì)相同時，供試品和標準品的兩條對數(shù)劑量和反應(yīng)關(guān)系直線相互平行”。2.原理量反應(yīng)平行線原理o 在抗生素微生物檢定法中，一定劑量范圍內(nèi)，抗生素對數(shù)劑量與其所致抑菌圈的大小呈直線關(guān)系。這就在理論上決定了，（活性）成分相同的標準品與供試品在一定劑量范圍內(nèi)產(chǎn)生的兩條劑量反應(yīng)直線相互平行，符合量反應(yīng)平行線原理的基本要求。2.原理量反應(yīng)直線o 兩位微生物學者hamphreylight和brown推導(dǎo)出的瓊脂球面擴散動

10、力學公式：o 該方程奠定了管碟法量反應(yīng)直線公式的基礎(chǔ)。dtchmdtr4lnln/ln42o 將上述公式簡化、移行，并將自然對數(shù)轉(zhuǎn)換為常用對數(shù)得：o 上述公式表明，抗生素總量的對數(shù)(lgm)與所形成的抑菌圈半徑的平方(r2)呈直線關(guān)系，即通過抑菌圈的大小來測定抗生素抗菌活性物質(zhì)的量。dthcrdtm4 lg21.91lg23.檢定方法o 分類 一劑量法（標準曲線法） 二劑量法（2 2法） 三劑量法（3 3法）o 二劑量法（2 2法）：用標準品、供試品各兩個劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗條件下，比較標準品和供試品二者對微生物產(chǎn)生的效力。二劑量法用于抗生素藥品效價的常規(guī)測定；3.1管碟法的

11、操作步驟3.1管碟法的操作步驟 預(yù)試驗試驗準備 雙碟底層的制備 供試品、標準品溶液的制備菌層的制備滴加抗生素溶液雙碟的培養(yǎng) 抑菌圈的測量結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定3.1管碟法的操作步驟o 預(yù)試驗：預(yù)試驗： 確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定：高劑量濃度溶液所致的抑高劑量濃度溶液所致的抑菌圈直徑在菌圈直徑在1822mm。高劑量與低劑量的抑菌圈直徑之差最好不小于2mm。 高低劑量之比為2:1（如高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用4:1的劑量比率）。3.1管碟法的操作步驟o 試驗準備：試驗準備： 雙碟、鋼管、毛細滴管、吸管的清洗及滅菌；容

12、量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等。3.1管碟法的操作步驟o 雙碟底層的制雙碟底層的制備：備： 每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，待用。3.1管碟法的操作步驟o 供試品、標準品溶液的制備：供試品、標準品溶液的制備： 估計供試品的效價，根據(jù)試驗要求設(shè)計供試品、標準品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液。3.1管碟法的操作步驟o 菌層的制備：菌層的制備： 菌層培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中添加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。 每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。 注意制備菌層的速度和菌層的速度和平整度。平整度

13、。3.1管碟法的操作步驟o 滴加抗生素溶液：滴加抗生素溶液：注意標準品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。每組雙碟至少為8個，一般為10個。在每個雙碟的4個鋼管中，對角的兩個鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標準品溶液，其余兩個對角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。按shthsltl順序，分別滴加標準品和供試品高、低劑量溶液。3.1管碟法的操作步驟o 雙碟的培養(yǎng)：雙碟的培養(yǎng)： 根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。3.1管碟法的操作步驟o 抑菌圈的測量：抑菌圈的測量： 將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入1：10

14、00新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去，切忌主觀挑選抑菌圈和雙碟，是結(jié)果造成偏離。 抑菌圈測量儀的使用：每組試驗雙碟應(yīng)在相同的測量參數(shù)下進行測量。 手工測量：游標卡尺3.1管碟法的操作步驟o 結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定：結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定： 抑菌圈測量儀提供計算結(jié)果或手工計算結(jié)果。3.1管碟法的操作步驟培養(yǎng)后的雙碟3.1結(jié)果計算及判斷o 可靠性檢驗 抗生素微生物檢定法前提條件是：標準品s和供試品t各對數(shù)劑量與反應(yīng)呈直線關(guān)系，且標準品s和供試品t的兩條直線平行。 可靠性測驗是利用生物統(tǒng)計方法驗證標準品和供試品的量反應(yīng)關(guān)系是否顯著偏離直線、偏離

15、平行。對在一定概率水平下不顯著偏離直線、不顯著偏離平行的實驗結(jié)果，認為可靠，所得檢定結(jié)果有意義。 3.1結(jié)果計算及判斷o 以紅霉素眼膏為例，紅霉素標示量為0.5%，即每1g紅霉素眼膏中含5000u紅霉素。假設(shè)投料量為100%，那么估計效價為100%。試驗采用二劑量法；劑間比為2；濃度比為1；試驗菌為短小芽孢桿菌cmcc（b）63 202。 3.1結(jié)果計算及判斷可靠性測驗計算：可靠性測驗計算：p結(jié)論：回歸非常顯著f27.82（p0.01）(即不顯著偏離直線）；偏離平行不顯著f34.26（p0.05）；實驗結(jié)果成立。試品間 f1= 0.5326 p=0.05 f= 4.2600 回 歸 f2= 8

16、73.2370 p=0.01 f= 7.8200 偏離平行f3= 0.2537 p=0.05 f= 4.2600 p0.05 劑 間 f6= 291.3411 p=0.01 f= 4.7200 碟 間 f7= 2.1653 p=0.01 f= 3.6700 回歸（f2）表示測驗的量反應(yīng)值是否隨劑量而有規(guī)律的增加或降低?；貧w項變異（p0.05）不顯著，則平行關(guān)系是可靠的。3.1結(jié)果計算及判斷抑菌圈測量值：抑菌圈測量值： = 碟號 ds1 ds2 dt1 dt2 ym- no.1 18.13 19.24 18.09 19.63 75.09 no.2 17.85 19.41 17.96 19.60

17、74.82 no.3 18.14 19.55 18.09 19.89 75.67 no.4 18.05 19.83 18.10 19.75 75.73 no.5 18.07 19.98 18.21 19.70 75.96 no.6 18.15 19.37 17.88 19.52 74.92 no.7 18.19 19.46 17.97 19.63 75.25 no.8 17.93 19.85 18.06 19.94 75.78 no.9 18.09 20.04 18.35 19.67 76.15- yk 162.60 176.73 162.71 177.33 679.37-3.1結(jié)果計算及判斷

18、效價計算：碟數(shù) m= 9 圈數(shù) k= 4 估計效價 at=100%劑間比 r= 2.0000 濃度比 d= 1.0000 對數(shù)值 i= 0.3010t表 t= 2.0640 樣品方差 s2= 0.0263 自由度 f=24r的對數(shù) m= 0.0074 回歸系數(shù) g= 0.0049 標準誤差 sm= 0.0102對數(shù)比值 r= 1.0173 r上限 rh= 1.0680 r下限 rl= 0.9691測定效價 pt=101.7265% pt上限 ph=1067.9584 下限 pl= 969.1406平均可信限率pt的fl%=4.86%pt的可信限fl和平均可信限率fl% 可信限fl和平均可信限率

19、fl%是反映檢定結(jié)果精密度的統(tǒng)計量。pt的可信限是pt標準誤差sm和t值（在95%的概率水平下）的乘積?？尚畔薹秶╬t tsm）表示對該供試品進行100次檢驗，95次的結(jié)果在pttsm pttsm范圍里。pt平均可信限率fl%： fl%= (tsm)/pt 100% 中國藥典中，一般抗生素微生物檢定平均可信限率限定在5%范圍內(nèi)，個別品種放寬至7%。 3.1結(jié)果計算及判斷o 重試判定 抑菌圈大小的要求 可靠性檢驗： 符合可靠性檢驗各項規(guī)定后，才能認為試驗結(jié)果可靠，方可進行效價和可信限率計算。 可信限率： 供試品效價測定結(jié)果（pt）的可信限率除特殊規(guī)定外，不得大于5%。 實測效價與估計效價： 試

20、驗計算所得效價應(yīng)在估計效價的10%以內(nèi)，即：試驗所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計效價，予以重試。 效價測定結(jié)果不符合規(guī)定時，需換人加倍復(fù)試。 o 標準曲線法（一劑量法）： 將標準品一組劑量的對數(shù)與微生物的反應(yīng)繪制成直線圖，相同條件下，測得供試品對微生物的反應(yīng)值，在標準品的標準曲線上查出引起該反應(yīng)的抗生素的相對濃度及效力。 一劑量法一般用于制備標準曲線或測定血藥濃度。 3.2一劑量法操作步驟標準曲線法o 中心點濃度中心點濃度c0的選取的選取 中心點的抑菌圈直徑應(yīng)在1617.5mm。 劑距劑距 按等比級數(shù)選取。 一般采用1:0.8、1:0

21、.88、1:0.85。c0c0c0ccc操作步驟標準曲線法o 分組分組 按選取的c0及劑距，一般分為8個組，即溶液濃度為c1、c2c8。 每組雙碟數(shù)應(yīng)不少于3個，一般可用5個，個別情況可增至10個。c0c0c0ccc操作步驟標準曲線法o 點樣點樣 每個雙碟安置6枚鋼管。 在各組每個雙碟6枚鋼管相間隔的三個鋼管內(nèi)，均滴加c0標準液。 在第一組每個雙碟的其余三個鋼管內(nèi)滴加c1的溶液，在第二組每個雙碟的其余三個鋼管內(nèi)滴加c2的溶液 滴加藥液的順序，可從中心濃度組開始向高、低兩端交叉滴加。如8個稀釋度的雙碟，滴加次序可為c4、c5、c3、c6、c2、c7、c1及c8。c0c0c0ccc操作步驟標準曲線

22、法o 抑菌圈的測量抑菌圈的測量 雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時間后，采用抑菌圈測量儀測量每組試驗雙碟抑菌圈的直徑。o 結(jié)果計算及可靠性檢驗結(jié)果計算及可靠性檢驗 以抑菌圈直徑為橫坐標，以濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線。 經(jīng)計算得到回歸直線方程 相關(guān)系數(shù)：1r0.993.3檢定方法o 三劑量法（3 3法）：用標準品、供試品各三個劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗條件下，比較標準品和供試品二者對微生物產(chǎn)生的效力。 三劑量法用于抗生素藥品的仲裁或標準品的標定 。操作步驟三劑量法o基本要點基本要點中劑量點的抑菌圈直徑應(yīng)在1518mm。三個劑量之比為1:0.8（1.25:1）。o點樣點樣每組雙碟至少為9

23、個，一般為15個。在每個雙碟的6個鋼管中，互相間隔的3個鋼管分別滴加高、中、低濃度的標準品溶液，其余3個鋼管內(nèi)分別滴加相應(yīng)的高、中、低濃度的供試品溶液。按shthsmtmsltl或thshtmsmtlsl順序，分別滴加標準品和供試品高、中、低劑量溶液。操作步驟三劑量法o 三劑量法雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖s3：標準品高劑量 s2：標準品中劑量 s1：標準品低劑量t3：供試品高劑量 t2：供試品中劑量 t1：供試品低劑量操作步驟三劑量法o 抑菌圈的測量抑菌圈的測量 雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時間后，采用抑菌圈測量儀測量每組試驗雙碟抑菌圈的直徑。o 結(jié)果計算及可靠性檢驗結(jié)果計算及可靠性檢驗4.實例及操

24、作要點o 硫酸慶大霉素中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基i（ph7.88.0）o 試驗菌：短小芽孢桿菌cmcc(b)63 202中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 緩沖液：ph7.8磷酸鹽緩沖液取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過，在115滅菌30分鐘。 k2hpo43h2o5.59/174.18（174.18+3 18）=7.32中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法實驗條件o 雙碟的制備：將雙碟置于水平面上，加底層培養(yǎng)基20ml，待凝固后，加菌層培養(yǎng)基5ml，凝固后備用。菌層培養(yǎng)基中菌懸液的量約為培養(yǎng)基量的2%。加菌懸液的量可視抑菌圈大小及

25、清晰程度進行調(diào)節(jié)。稱樣量的計算o 按標準品的標識效價、供試品的標識量或估計效價計算稱樣量：(ml)(u/ml)u/ml溶解時用容量瓶體積量標準品或供試品濃溶液的濃度稱取標準品或供試品的量=標準品純度或供試品估計效價()中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 標準品溶液的制備：標準品溶液的制備：o 假設(shè)：硫酸慶大霉素標準品的效價為636單位/mg，理論計算應(yīng)精密稱取78.62mg，置 5 0 m l 量 瓶 （ 6 3 6 單 位/mg78.62mg50000單位）中，恰好為1000單位，但實際操作中一般稱量數(shù)接近即可，如精密稱取標準品80.10mg。中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o

26、80.10mg 水 50ml 制成1018.87單位/mlo 精密量取5ml buffer 50ml 制成101.887單位/mlo 精密量取5ml buffer 50ml 制成10.189單位/mlo 精密量取5ml buffer 100ml 制成5.094單位/ml慶大霉素 212單位/ml中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：p 供試品溶液的制備（原料）：供試品溶液的制備（原料）： 根據(jù)硫酸慶大霉素原料的估計效價計算供試品的稱樣量。 假設(shè)：供試品的估計效價為590單位/mg，則稱樣量為50000/590=84.74mg，但實際取樣量為84.24mg，第一步稱樣置50ml量瓶中，實際估計效

27、價為80.10mg636u/mg/84.24mg604.7436單位/mg。 中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 84.24mg 水 50ml o 精密量取5ml buffer 50ml o 精密量取5ml buffer 50ml o 精密量取5ml buffer 100ml中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 供試品溶液的制備（制劑）供試品溶液的制備（制劑）o 片劑：取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量（根據(jù)平均片重及標示量折算，約相當于慶大霉素0.1g）,如為糖衣片，取5片，全部研細，加滅菌水振搖使硫酸慶大霉素溶解，并稀釋成每1ml中約含1000單位的懸浮液，搖勻，靜置，取

28、上清液適量，照硫酸慶大霉素項下測定方法測定。中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 平均片重為0.1357go 規(guī)格為40mg(4萬單位)o 暫估計其標示量為95%o 第一步需制成1000單位/ml溶液，擬取供試品10萬單位為：1000000.1357g/(4000095%)=0.3618g，實際稱取0.3702g，則實際估計標示量為：80.106361000.135750100%93.3691%0.370240000中國藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：o 用鋼管放置器或適宜方法等距離均勻放置不銹鋼小管，并靜置510分鐘，使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再滴加抗生素溶液。 o 每次以5個雙碟為

29、一“小分隊”滴加藥液。o 滴加溶液：按shthsltl順序，分別滴加標準品和供試品高、低劑量溶液?？梢允垢叩蛣┝康囊志χ睆讲町愶@著，從而提高檢定靈敏度。o 培養(yǎng)溫度和時間：培養(yǎng)溫度為3537，培養(yǎng)時間為1416h。o 結(jié)果計算：測定抑菌圈，進行可靠性檢驗，計算效價，可靠性檢查若能通過，且可信限率不超過7%，則試驗數(shù)據(jù)有效。如果所測得的效價結(jié)果低于估計效價的90%或高于110%時，則檢驗結(jié)果只作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計效價，重新試驗。o 平均可信限率不大于7%的品種 紅霉素、琥乙紅霉素、依托紅霉素 克拉霉素 硫酸西索米星 硫酸奈替米星 硫酸依替米星 硫酸慶大霉素 硫酸小諾霉素操作要點o 第一步

30、一般應(yīng)制成500或1000單位/毫升的溶液，以后逐步稀釋至供試濃度的溶液，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟應(yīng)少于3步。o 溶解：對于需用乙醇溶解的樣品，由于溶解樣品時所用乙醇量較大，加滅菌水后溶液放熱，因此需充分搖勻后加滅菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室溫后再稀釋至刻度。操作要點o 培養(yǎng)基的ph值，對試驗結(jié)果影響很大，使用時培養(yǎng)基的ph值應(yīng)調(diào)節(jié)到適合該品種試驗的最佳范圍。通常滅菌后的ph值范圍為7.88.0或6.56.6。對堿性抗生素而言，在偏堿性條件下它的抗菌活力強，如氨基糖苷類的鏈霉素在ph值7.8以上時活力強，抑菌圈清晰，當抑菌圈偏小時，可考慮把培養(yǎng)基的ph值適當調(diào)高至8.0或

31、更高些。對酸性或兩性抗生素，在酸性條件下它的抗菌作用強，使用ph值6.56.6培養(yǎng)基為合適。通常滅菌后ph值會下降0.2左右，因此ph值應(yīng)略高0.20.4。調(diào)節(jié)時要注意逐漸加堿，防止過量，否則再加鹽酸矯正，將會增加培養(yǎng)基的含鹽量，從而降低培養(yǎng)基的使用效果。 操作要點 o 試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應(yīng)保持菌種及菌液的新鮮。o 一般菌種一月轉(zhuǎn)種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。o 試驗菌傳代最好不超過5次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后，應(yīng)在65加熱30分鐘，使菌體的菌齡一致，用革蘭氏染色，應(yīng)有芽孢

32、85%以上。操作要點o 加入菌懸液的體積，一般不少于0.3ml，并且不大于上層培養(yǎng)基體積的2%。如果加入菌懸液的體積過小，則在同樣實驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大，造成實驗誤差；如果加入菌懸液的體積過大，則會使上層培養(yǎng)基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養(yǎng)基中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊，影響測定結(jié)果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實現(xiàn)。操作要點o 在制備菌層培養(yǎng)基時，將菌液加入菌層培養(yǎng)基后，立即充分搖勻，但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。o 加入芽孢懸液時，菌層培養(yǎng)基的溫度為65，對非芽孢懸液時，菌層培養(yǎng)基的溫度一般為4850。o 放置孵箱培養(yǎng)時排放應(yīng)不得超過三層，避免因培養(yǎng)溫度不均勻而導(dǎo)

33、致各雙碟中抑菌圈大小不一。5.檢定的影響因素o 標準品與供試品的同質(zhì)性o 抑菌圈質(zhì)量的控制o 直線斜率的控制o 直線截距的控制dthcrdtm4 lg21.91lg25. 影響因素標準品與供試品同質(zhì)o 抗生素效價測定方法依據(jù)的原理是量反應(yīng)平行線原理，即標準品與供試品劑量的反應(yīng)直標準品與供試品劑量的反應(yīng)直線是相互平行的線是相互平行的。如不平行，則斜率不等，計算結(jié)果將產(chǎn)生較大的誤差。5. 影響因素標準品與供試品同質(zhì)o多組分抗生素標準品所含的抗菌活性物質(zhì)或影響抗菌活性（增強或拮抗）物質(zhì)的量與供試品有所不同，則可使量反應(yīng)直線不平行。o用于標準品、供試品溶液制備的緩沖溶液ph、鹽濃度不相同。 o供試品中

34、所含有的如維生素、氨基酸、無機鹽或其他生長物質(zhì)，而標準品中沒有，在營養(yǎng)條件低的培養(yǎng)基上即會產(chǎn)生影響。o某些對光敏感的多烯類抗生素在標準品、供試品溶液配制，及試驗過程中應(yīng)注意避免光線直射。o有差向異構(gòu)特性的抗生素在測定時，尤其注意ph、鹽濃度、溫度和光照對抗生素差向化的影響，保證標準品與供試品在相同條件下進行測定，以消除影響。（如四環(huán)素在1mol/l磷酸鹽或枸櫞酸鹽緩沖液中，ph3.2（23）時可形成55%差向四環(huán)素異構(gòu)體，它的活性相當于四環(huán)素的5%，造成二者反應(yīng)直線不平行）5. 影響因素標準品與供試品同質(zhì)o “乙酰吉他霉素”是以“吉他霉素”來表征其抗菌活性的，日抗基有收載，效價測定時以“吉他霉

35、素”為標準品，將“乙酰吉他霉素”水解24小時后再進行測定。在測定時曾發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果的誤差較大，重現(xiàn)性差。采用hplc法對乙酰吉他霉素水解后的組分進行測定，以考察其是否水解為吉他霉素。乙酰吉他霉素乙酰吉他霉素水解24小時吉他霉素組分o 結(jié)果顯示，乙酰吉他霉素經(jīng)24小時水解后并未轉(zhuǎn)變?yōu)榧顾?，并與乙酰吉他霉素的成分也不同，提示采用吉他霉素為標準品測定乙酰吉他霉素效價時，吉他霉素標準品與乙酰吉他霉素水解后的樣品的成分不同，易引起實驗誤差。o 根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，標準品與供試品的同質(zhì)性，改用乙酰吉他霉素為標準品，將標準品與供試品同時水解后測定，減小了誤差。水解條件的修訂o 琥乙紅霉素水解條件由： （

36、cp2000） （cp2005）p 依托紅霉素（cp2000） （cp2005） （cp2010）室溫2h室溫16h或406h室溫2h376h604h5.影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制o抑菌圈的形狀o抑菌圈大小的控制o抑菌圈邊緣清晰度的控制5.影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制o 抑菌圈的形狀：實驗中抑菌圈常多有破裂、不圓、甚至無圈的現(xiàn)象，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液時藥液濺出、毛細滴管碰到鋼管壁使抗生素溶液漏出，抑菌圈出現(xiàn)不圓；雙碟、鋼管、鋼管放置器內(nèi)有殘留抗生素污染（如慶大霉素、平陽霉素等容易吸附在鋼管、玻璃儀器的表面），出現(xiàn)細菌不生長，或者有多余的抑菌圈產(chǎn)生，或者抑菌圈非正常的變大；試驗菌菌齡過老

37、、菌層培養(yǎng)基加菌液時培養(yǎng)基溫度過高，將檢定菌燙死等，會導(dǎo)致細菌不生長；稀釋抗生素溶液所用緩沖液的ph值和鹽濃度也可影響抑菌圈的圓整，如氨基糖苷類抗生素，當緩沖液的ph值偏低、鹽濃度偏高時，會出現(xiàn)無抑菌圈或呈向心形、橢圓形抑菌圈。 5.影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制o 抑菌圈大小的控制 m=c0v 當抗生素濃度c0不變時，體積v（即加樣量）的對數(shù)與抑菌圈直徑或面積呈直線關(guān)系，故鋼管中滴加抗生素的體積應(yīng)一致。鋼管（截面積a，高度l）的大?。ㄖ亓?、直徑、高度）應(yīng)嚴格控制。 21lglg49.21mrcdthdt5.影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制o 抑菌圈大小的控制 抑菌圈大小受t值（抗生素擴散時間，即細菌剛生長

38、到顯示抑菌圈所需的時間）增減的影響，故預(yù)先延長抗生素的擴散時間可使抑菌圈變大。 21lglg49.21mrcdthdt20r9.21dt(lgc allgc 4 dth)o 操作中若各鋼管中加液時間不同，差值為t，則t變成t t，此時可影響抑菌圈的大小不均一，所以一組雙碟加樣時，應(yīng)盡量縮短加樣間隔時間，并保持加樣速度的均勻性，以減少誤差。 o 抑菌圈的大小還受抗生素擴散系數(shù)d的影響，若在緩沖液中加入0.3%的氯化鈉或在培養(yǎng)基中加一定量的鹽或吐溫，可增加抗生素的擴散能力，使抑菌圈增大。 20r9.21dt(lgc allgc 4 dth)5.影響因素抑菌圈質(zhì)量的控制o 抑菌圈邊緣清晰度的控制 抑

39、菌圈邊緣清晰度是影響測定結(jié)果的重要因素之一，導(dǎo)致抑菌圈邊緣不清晰的原因有多種：在抑菌圈形成過程中抗生素的擴散系數(shù)紊亂、不均一，不符合動力學公式中各項之間的關(guān)系或各擴散系統(tǒng)交叉所致。如試驗菌種放置時間過長，菌群中個體的生長周期不同，對抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成雙圈或多圈，使邊緣模糊不清。 培養(yǎng)基原材料的成分及質(zhì)量、ph值、鹽濃度及培養(yǎng)時間均可影響抑菌圈邊緣的清晰度。多組分抗生素中，各組分抗菌活性的不同，擴散系數(shù)也不同，其交叉作用影響抑菌圈邊緣的清晰度。 5.影響因素斜率的控制o 由公式中斜率（ ） 來推算： 反應(yīng)直線的斜率愈小愈好反應(yīng)直線的斜率愈小愈好，因為斜率越小，直線越平穩(wěn)，抗生素

40、效價的微弱差別，可導(dǎo)致抑菌圈大小的差別較大，使測定結(jié)果更精確。如擴散快，即擴散系數(shù)d值大，則斜率?。蝗缂毦L慢，時間長，t值大，則斜率小。如擴散系數(shù)d值不變，t值變小，則試驗菌生長快，時間短，斜率就大，這樣生物反應(yīng)的靈敏度低，重現(xiàn)性差。為使t值增大，可在滴加藥液后，在室溫放置約1小時，再置孵箱培養(yǎng)。 dt21. 91dthcrdtm4 lg21.91lg25.影響因素直線截距的影響o 相同濃度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效價測定的靈敏度高。 截距的大小取決于 數(shù)值，除溫度、擴散系數(shù)和抗生素最低抑菌濃度對截距有影響外，培養(yǎng)基厚度h也是影響因素之一。培養(yǎng)基厚度越薄，截距減小，抑菌圈增大，所以在制

41、備雙碟時，應(yīng)保持在相同的試驗組內(nèi)，每只雙碟中底層和菌層培養(yǎng)基的厚度應(yīng)保持一致性和均勻性。 dthc4 lgdthcrdtm4 lg21.91lg2管碟法特點 o優(yōu)點： 基本操作和設(shè)計適用于各種抗生素，試驗結(jié)果較穩(wěn)定； 樣品用量少，靈敏度高； 適合于大批樣品的測定。管碟法特點o缺點: 凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會干擾測定結(jié)果； 試驗過程長，需第二天才有結(jié)果； 操作手工化，需熟練人員才能得到較正確的結(jié)果； 受擴散因素的影響，如培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴散速度及效價強度。0個（cp2000) 1個（cp2005）22個（cp2010)比濁法比濁法1. 定義2. 基本原理3. 應(yīng)用舉例

42、4. 操作步驟5. 注意事項6. 檢定的影響因素7. 比濁法的特點和儀器1.比濁法的定義o 中國藥典2005年版的定義： 本法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對 試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。2.檢定原理o 基本原理：細菌接種于澄清的營養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一段時間，變渾濁，其渾濁程度與細菌數(shù)的增加、細菌群體質(zhì)量的增加和細菌群體細胞容積的增大之間存在著直接的關(guān)系。當一定的光束照射其已經(jīng)渾濁的液體培養(yǎng)基時，通過測定其透過率就知道細菌生長情況，在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，劑量響應(yīng)為一直線。因此，

43、在劑量響應(yīng)曲線的直線范圍內(nèi)，可設(shè)計比濁法測定抗生素含量。2.檢定原理o細菌的群體生長期的選擇： 細菌的群體生長的整個變化過程大致可劃分為如下階段或時期：（a）誘導(dǎo)期（延滯期）（b）對數(shù)生長期（c）穩(wěn)定期（d）死亡期2.檢定原理o (a)誘導(dǎo)期（延滯期）： 本階段為增殖準備期，細胞處于適應(yīng)時期，本階 段時間的長短受多種因素的影響。當培養(yǎng)基營養(yǎng) 豐富，新鮮，培養(yǎng)條件適宜，接種的培養(yǎng)物又具 有很強的活力時，時間將會縮短，反之，則時間延長。本階段內(nèi)各種酶合成旺盛，體積增大。o (b)對數(shù)生長期： 在誘導(dǎo)期后，細胞經(jīng)過適應(yīng)、恢復(fù)，在提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)條件下，細胞數(shù)呈對數(shù)生長速率，此時，細菌細胞數(shù)的增長率

44、是細胞數(shù)、基質(zhì)的濃度與抑菌物質(zhì)濃度三者的函數(shù)。在對數(shù)生長期中細胞數(shù)的增長率一般是一個常數(shù)。2.檢定原理o （c）穩(wěn)定期： 本階段細胞增長率逐步下降到零，一部分 細胞繁殖、生長，另一部分細胞死亡，趨 于平衡。 o （d）死亡期： 細菌細胞的死亡率超過增長率，細胞總數(shù)開始減少，主要是營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏、代謝產(chǎn)物的毒性、自溶酶的產(chǎn)生而導(dǎo)致細菌細胞溶解或死亡。2.檢定原理o測定時間的選擇劑量反應(yīng)平穩(wěn)生長時間段： 一定抗生素濃度范圍內(nèi)，檢定菌在單位時間內(nèi)的生長速度相同，即生長速率相同，也就是在一段時間內(nèi)反應(yīng)培養(yǎng)時間(a-t)呈顯著的直線關(guān)系，且在不同抗生素濃度下的生長速率也相同。3.應(yīng)用舉例中國藥典2005

45、版比濁法品種：硫酸慶大霉素的效價測定 抗生素試驗菌培養(yǎng)基滅菌緩沖液ph值抗生素濃度范圍單位/ml培養(yǎng)類別條件編號ph值溫度/慶 大 霉素金黃色葡萄球cmcc(b)26003iii7.07.27.80.151.03537中國藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價測定：o （1）試驗菌液的配制：取金黃色葡萄球菌cmcc(b)26003的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時后，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下菌苔，并用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋，使其在650nm波長處的吸收值為1.0。o （2）含試驗菌的液體培養(yǎng)基配制：取試驗菌液1.5ml置100mlph7.07.2培養(yǎng)基i

46、ii中，搖勻，備用。臨用前，取規(guī)定的試驗菌懸液適量（ 3537培養(yǎng)34小時后測定的吸光度在0.3 0.7之間，且劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1），加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中，混合。使在實驗條件下能得到滿意的劑量-反應(yīng)關(guān)系和適宜的測定濁度。已接試驗菌的液體培養(yǎng)基應(yīng)立即使用。中國藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價測定：o （3）緩沖液：ph7.8磷酸鹽緩沖液中國藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價測定： 陽性對照：取1支試管，加入滅菌水1.0ml，再加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml。 陰性對照（空白對照）：取1支試管，加入滅菌水1.0ml，再加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即加

47、入甲醛溶液0.5ml，混勻，作為吸光度測定的空白液。中國藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價測定：o（4）效價測定：o供試品溶液的配制：取慶大霉素制劑適量，精密稱定，按標示量用滅菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液適量，用ph7.8磷酸鹽緩沖液稀釋成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。o標準品溶液的配制：取慶大霉素標準品適量，精密稱定，用滅菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液適量，用ph7.8磷酸鹽緩沖液稀釋成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。o分別精密量取高低劑量的供試品溶液和對照品溶液各1.0ml，置滅菌試管中，每個濃度6管，分別加入實驗培養(yǎng)基9.0ml，立即搖勻，

48、置37水浴培養(yǎng)34小時，取出，立即加入甲醛溶液，搖勻，照分光光度法，在530nm波長處測定吸收值，照生物檢定統(tǒng)計法（附錄xiv）中的2.2法計算，同時與管碟法進行了比較，結(jié)果如下： 測定結(jié)果的比較4.比濁法的操作步驟： 預(yù)試驗試驗準備供試品、標準品溶液的制備 菌液培養(yǎng)基的制備加抗生素溶液 比色管的培養(yǎng)菌濃度的測量 結(jié)果的可靠性檢驗及效價測定4.比濁法的操作步驟o 預(yù)試驗： 確定最佳的試驗條件：調(diào)整試驗菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使高、低劑量濃度標準品溶液所致的菌液濃度的吸收值在0.30.7范圍；高、低劑量濃度標準品溶液所致的菌液濃度的吸收值的差值大于0.1為佳。4.比濁法的操作步

49、驟o 試驗準備： 比色管、攪拌轉(zhuǎn)子、塞子的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準備、半無菌間的紫外消毒等。 4.比濁法的操作步驟o 供試品、標準品溶液的制備： 估計供試品的效價，根據(jù)試驗要求設(shè)計供試品、標準品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標準品相關(guān)劑量的溶液。4.比濁法的操作步驟o 菌液培養(yǎng)基的制備： 根據(jù)預(yù)試驗確定加入液體培養(yǎng)基的菌液量，注意制備菌液與培養(yǎng)基充分混勻。4.比濁法的操作步驟o 加抗生素溶液： 在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培養(yǎng)基，混勻后，在規(guī)定溫度培養(yǎng)。4.比濁法的操作步驟o 菌濃度的測量： 在530nm或其他波長(580nm)處測定各比色管的菌

50、液濃度，注意測定時間的一致性。o 結(jié)果的可靠性檢驗及效價結(jié)果5.注意事項：o 加菌量的影響：加菌量的多少（0.25%、0.5%、1.0%），影響培養(yǎng)至適宜的菌液測定濃度所用的時間，加菌量過少，則測定時可利用的濃度范圍窄。o 各抗生素各濃度之間的吸收度的差值在0.1以上為佳，此時菌液對不同濃度的抗生素敏感，測定誤差較低。5.注意事項：o 比色池的清潔： 測定用的比色管需用硝酸硫酸（5：95）浸泡并用蒸餾水沖洗干凈，不要有污漬和劃痕，與分光光度計的試管要匹配，要清除抗生素殘留和清洗液的痕跡，除去纖維等雜質(zhì)。5.注意事項o 時間的一致性：主要是使每管的培養(yǎng)時間相等，實驗時在試管中加入含試驗菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標準品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時可先將培養(yǎng)基冷卻至24左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養(yǎng)基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養(yǎng)終止時將各管同時放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗管的培養(yǎng)時間一致。 5.注意事項o 測定時氣泡的影響：在測定比濁法讀數(shù)前必須將培養(yǎng)基充分搖勻才能準確測定細菌的濃度，但振搖產(chǎn)生的氣泡嚴重干擾了測定結(jié)果。如在充分搖勻后放置一段時間，待氣泡消失后再進行測定，雖然仍可逐漸下沉，但其誤差較小。6. 影響因素o 培養(yǎng)溫度控制：u 溫度的均勻性直接影響試驗菌的生長