一種快速微量化測定蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活性的方法及其初篩應用

1、一種快速微量化測定蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活性的方法及其初篩應用收稿日期： 2016-01-28基金項目：國家自然科學基金（編號：31170920）；大夏大學生科研基金項目（編號：2014DX-333）。通信作者：黃靜，博士，副教授，主要從事食品微生物研究。 E-mail ： jhuang。ZK）植物蛋白如大豆蛋白、小麥蛋白和玉米蛋白等在食品工業(yè)中應用非常廣泛。但由于大部分植物蛋白在弱酸性環(huán)境中（大多數(shù)食品系統(tǒng)的pH 范圍）存在溶解性差、穩(wěn)定性低的問題，造成其應用范圍受到了限制1 。采用蛋白質(zhì)脫酰胺法對植物蛋白進行改性，增強其相關(guān)功能特性，擴大其在食品領(lǐng)域的應用是目前熱門的研究方向1-3。蛋白質(zhì)谷氨酰

2、胺酶（ protein-glutaminase， PG）是一種能夠催化L- -谷氨酰胺殘基， 生成 L- 谷氨酸和氨的酶，并且對于天冬酰胺殘基以及游離的谷氨酰胺殘基的酰胺鍵沒有作用 4 ，相比較于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶以及肽谷氨酰胺酶具有無蛋白交聯(lián)、無副作用等優(yōu)點 5 。目前 PG已應用到小麥蛋白、米谷蛋白、麥麩蛋白等多種蛋白的改性試驗中，試驗結(jié)果證明其可明顯地增強蛋白質(zhì)脫酰胺程度 6 。2000 年 Yamaguchi 等從解朊金黃桿菌（ Chryseobacterium proteolyticum） 9670T中首次發(fā)現(xiàn)了PG7。由于產(chǎn)PG的菌株稀少，世界上對PG的研究主要為該酶的結(jié)構(gòu)和應用 8

3、。近年來，華東師范大學微生物實驗室致力于產(chǎn) PG菌種研究，從全國各地土壤中一共篩選到9株產(chǎn) PG的細菌，經(jīng)鑒定，其中 7 株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（ C.indologenes ），1 株為解朊金黃桿菌 （ C.proteolyticum），1 株為黏金黃桿菌（ C.gleum ），其酶活大小在 0.10 0.72U/mL 之間，其中 2013 年從四川省土樣中篩選分離到的1 株能夠產(chǎn)生PG的解朊金黃桿菌Y8-10-1 ，經(jīng)鑒定與已被批準可用于食品工業(yè)生產(chǎn)的菌株9670T 為同一來源菌株，兩者酶活均為 0.40 U/mL 左右 9 ，低酶活限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應用。筆者實驗室欲通過化學誘變、

4、紫外誘變等傳統(tǒng)育種方法，以 Y8-10-1 作為出發(fā)菌株得到高產(chǎn) PG菌株，但由于傳統(tǒng)誘變方法操作復雜、篩選樣本量大，并且由于國際通用的測定PG酶活的苯酚 - 次氯酸鹽方法 10-11試管用量大、 操作復雜、耗時長等缺點難以在初篩過程中大規(guī)模應用。因此，準確、快速微量化測定PG酶活方法的建立在高通量篩選高產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶過程中有著重要的意義。本試驗基于苯酚- 次氯酸鹽方法，借助酶標儀快速檢測功能，利用PG與底物反應過程中產(chǎn)生氨的顯色反應最大速率maxv 代替酶活，建立適合高通量篩選的96 孔微孔板反應體系， 30 min 可檢測 60 個以上的反應，完全達到高通量篩選的要求 12 ，并與苯酚

5、 - 次氯酸鹽方法進行比較以驗證該方法的可行性。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1菌種產(chǎn) PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1 ，由華東師范大學微生物實驗室保藏。1.1.2 培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（ 1 000 mL ）： 10 g 多聚蛋白胨，2 g 酵母提取物， 1 g MgSO4?7H2O，加 ddH2O至 1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 值至 7.0 。發(fā)酵培養(yǎng)基（ 1 000 mL）：5 g 乳糖， 10 g 多聚蛋白胨， 1.7 g NaH2PO4?H2O，0.25 g K2HPO4 ，0.25 g MgSO4?7H2O， 0.05 g FeSO4?7H2O ，加 ddH2O至 1 00

6、0 mL ，調(diào)節(jié) pH 值至 7.2 。1.1.3試劑與儀器主要試劑：176 mmol/L PBS（ pH值為 6.5 ）（： 1）0.2 mol/LNa2HPO4溶液：稱取71.6g Na2HPO4?12H2O，用 ddH2O定容到 1 000 mL ；（ 2） 0.2 mol/L NaH2PO4 溶液：稱取 31.2 g NaH2PO4?2H2O，用 ddH2O定容到 1 000 mL。取 31.5 mL（ 1）溶液、 68.5 mL（ 2）溶液，以及 11364 mL ddH2O，混合均勻。底物溶液（反應液） ：稱取 0.337 g 二肽 Cbz-Gln-Gly ，用 176 mmol/

7、L PBS（ pH 值 6.5 ）定容至 100 mL。 400 mmol/LCCl3COOH溶液（終止液）：稱取 6.536 g CCl3COOH，用 ddH2O定容至 100 mL。顯色劑 A：稱取 40.46g 苯酚和 0.15 g Na2Fe（ CN） 5NO2?H2O，用 ddH2O定容至 1 000 mL。顯色劑 B：稱取 49.94 g KOH ，用 ddH2O定容至 1 000 mL 。顯色劑 C：稱取 200.40 g K2CO3，加適量 ddH2O溶解，待冷卻后加 8.33 mL NaClO溶液， ddH2O定容至 1 000 mL 。醋酸 - 醋酸鈉緩沖液（ pH 值為

8、4.5 ）：取 18 g 醋酸鈉，加 9.8 mL 冰醋酸，再加水定容至 1 000 mL。 NIT 母液：稱取 0.1 g NIT ，溶于 20 mL醋酸 - 醋酸鈉緩沖液（ pH 值為 45）。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：配制具有 12%的分離膠和 5%的濃縮膠，插 10 孔樣品梳，膠厚 1.5 mm。標準 PG樣品（ 50 U/g ），購自 Amano 公司；底物 Cbz-Gln-Gly ，購自 Sigama 公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物，購自安琪酵母股份有限公司；苯酚、硝普鈉、亞硝酸鈉（NIT）等常規(guī)試劑分析純，購自上海潤捷化學試

9、劑公司。 恒溫調(diào)速回旋式搖床DKY-，購自上海杜科自動化設(shè)備有限公司；Synergy HT多功能酶標儀， 購自 BioTek公司， Labofuge 400R 水平離心機，購自Thermo Scientific公司。1.2 試驗方法1.2.1苯酚 - 次氯酸鹽法測定PG酶活試管法參照國際通用的測定氨含量的苯酚次氯酸法10-11進行 PG酶活測定。試驗組：取 100 L酶樣品溶液加入試管中，向其中加入 1 000 L已在 37 水浴中預熱 10 min 的底物 Cbz-Gln-Gly 溶液，混合液在 37 恒溫培養(yǎng)箱中溫育 30 min。然后加入 1 000 L的 400 mmol/L CCl3

10、COOH 溶液，終止反應。對照組：取100 L酶樣品溶液加入試管中，向其中加入 1 000 L已在 37 水浴中預熱10 min 的 400 mmol/LCCl3COOH溶液，混合液在37 恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min 。然后加入1 000 L 的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合均勻。從每支試管中吸取120 L溶液加入到新試管中，再加入 480 L蒸餾水，混合均勻，然后向試管中依次加入900 L顯色劑 A、450 L顯色劑 B 和 900 L顯色劑 C?；旌暇鶆蚝笾糜?37 恒溫培養(yǎng)箱中溫育20 min ，在酶標儀630 nm下測定吸光度。1 個酶活單位定義為1 min 催化底物生成1 m

11、ol 氨需要的酶量，根據(jù)以下公式計算蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力。JZ （ HT9. ， 8. 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力=SX（ （試驗組氨含量 - 對照組氨含量）× SX（ 2.10.1SX ）17.03 ×30×aSX） HT 。JZ ） 式中：蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力單位為U/mL；SX（ 2.10.1SX ） 為反應液與酶液的體積比； 17.03 為氨的相對分子質(zhì)量； 30 為反應時間， min；a 為氨標準曲線的斜率。 1.2.2 基于苯酚 - 次氯酸法測定 PG maxv 96 孔板體系96孔板體系測定PGmaxv試驗組：取10 L酶樣品溶液加入孔中，向

12、其中加入100 L已在37水浴中預熱10 min 的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 恒溫培養(yǎng)箱中溫育15 min。對照組：在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，PG在 80 下溫育10 min后可完全失活 13 。故對照組取10 L 80 高溫失活的酶樣品溶液加入孔中，向其中加入100 L已在 37 水浴中預熱 10 min 的底物 Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 恒 ?嘏嘌?箱中溫育15 min。每孔中加入 60 L顯色劑 A、30 L顯色劑 B 和 60 L 顯色劑 C 顯色，在酶標儀 630 nm 下測定顯色反應吸光度 10min，記錄試驗組、對照組顯色反應最大速度（maxv 在酶

13、標儀中直接讀取）的差值maxv。標準 PG樣品的maxv 曲線用 176 mmol/L PBS （ pH 值為 6.5 ）稀釋標準 PG樣品至不同的濃度，使其酶活分別為0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、 1.4 U/mL，按照“”節(jié)中的方法測定所有樣品顯色反應的maxv。maxv 在 96 孔板中變異系數(shù)的測定將 10 L標準 PG樣品與發(fā)酵液上清分別加入96 孔板的所有孔中，按照“ ”節(jié)中的方法測定所有孔中顯色反應的maxv，計算標準PG樣品與發(fā)酵液上清在96 孔板中 maxv 的變異系數(shù)。變異系數(shù)（ CV）=

14、標準差 / 平均值× 100%。同一菌株不同發(fā)酵時間發(fā)酵液的maxv與酶活相關(guān)性分析將產(chǎn) PG的 Y8-10-1 菌株活化后接種2%進行發(fā)酵，每隔2 h 取樣，苯酚次氯酸法測定酶活并讀取發(fā)酵上清液顯色反應的maxv 值，計算其與酶活的對應關(guān)系。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：取不同時間發(fā)酵液，10 000r/min離心 5 min，取上清液，添加適量5×Loading buffer ，沸水浴 5 min 后離心吸取上清液，采用5%濃縮膠以及12%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。1.2.3NIT誘變隨機誘變庫的建立pH 值為 4.5 的醋酸 - 醋酸鈉緩沖液稀釋NIT

15、母液至 NIT濃度為 0.4 、0.5 、0.6 、1.0 mg/mL。900 L不同濃度的 NIT 溶液與 100 L Y8-10-1 菌液（ 109 CFU/mL）充分反應 20 min 后涂板。致死率 =（未誘變平板菌落數(shù) - 誘變后平板菌落數(shù)）/ 未誘變平板菌落數(shù)× 100%；正突變率 =酶活發(fā)生正突變的菌株數(shù) / 發(fā)生突變的總菌株數(shù)× 100%。1.2.4 誘變菌株maxv 值與酶活相關(guān)性分析將 NIT 誘變得到的菌株，測其發(fā)酵液上清的酶活及顯色反應的maxv，并從中隨機選取菌株計算酶活與maxv 之間的相關(guān)系數(shù)。2 結(jié)果與分析2.1 不同濃度 PG標準品的酶活與

16、maxv 的關(guān)系將 PG標準品（ 1.5 U/mL ）稀釋不同倍數(shù)，結(jié)果如表1、圖 1 所示，可知，用 PBS稀釋標準 PG樣品不同的倍數(shù)，其不同的濃度對應的酶活分別為0、0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0 、1.2 、 1.4 U/mL ，將不同濃度的標準酶樣品進行顯色反應maxv 測定。結(jié)果顯示，隨著標準酶樣品酶活的增加，maxv值也在不斷增加，并在酶活01.0 U/mL 范圍內(nèi)，兩者呈高度正相關(guān)， 相關(guān)系數(shù)達到0.999 ，說明maxv 表征酶活的線性適用范圍為0 1.0 U/mL ，若超過 1.0 U/mL ，可稀釋樣品再進行測量。2.2 在96 孔板中顯色反應maxv 變

17、異系數(shù)的測定96 孔板在高通量菌株篩選中有著重要的地位，通過標準PG樣品與發(fā)酵液在96 孔板中的顯色反應maxv 測定，結(jié)果如圖 2、圖 3、圖 4 所示。標準PG樣品在 96 孔板上的顯色反應maxv 變異系數(shù)為32%（圖 2），并且邊緣孔對應的數(shù)值均發(fā)生較大變異，說明該方法在使用過程中，96 孔板在溫育時受熱不均勻，容易產(chǎn)生邊孔效應14 。使用96 孔板內(nèi)部60 孔測定相同30 組標準PG樣品顯色反應maxv，變異系數(shù)為 10%（圖 3），測定相同30 組發(fā)酵液上清，其顯色反應 maxv 的變異系數(shù)為 18%（圖 4），根據(jù)圖 1 中標準 PG樣品的曲線，當maxv 變化18%時，酶活變化

18、幅度為20%以上，說明不同樣品的maxv變異系數(shù)均在合理的范圍內(nèi)15 ，此方法每輪可篩選中酶活高于出發(fā)菌株20%的誘變株。結(jié)果表明，利用96JP3 孔板 ?炔 ?60 孔進行顯色反應maxv 測定，可大大提高篩選通量。2.3 不同發(fā)酵時間對maxv 測定的影響由表2 以及圖5 可知，產(chǎn)PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1隨 CM（25 著發(fā)酵時間的增長，其酶活、蛋白量與均在增長，在 CM） 12 h 時均達到最大值，這與前人研究中的試驗結(jié)果maxv9一致。在發(fā)酵初期，該菌產(chǎn)酶活性很低，從SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果說明， PG在發(fā)酵 6 h 時已有明顯的目的蛋白條帶出現(xiàn)， maxv 測得數(shù)值為

19、0.004 ，比 4 h 時有著明顯的提高，而苯酚 - 次氯酸法無法對 6 h 的發(fā)酵液進行準確的酶活測定，說明 maxv 測定與苯酚 - 次氯酸法相比有著很高的靈敏性，并由圖6 可知 2 種方法相關(guān)性很高，r=0.991 。2.3maxv 測定在 NIT 隨機誘變庫中的檢驗將該方法應用于NIT 誘變篩選中驗證其準確性，不同 NIT濃度條件下的誘變結(jié)果如表3 所示。由表 3 可知，隨著NIT 濃度從 0.4 mg/mL 增加至 1.0mg/mL時，致死率不斷增加，當NIT 濃度為 1.0 mg/mL 時，致死率為99.99%，而正突變率的變化呈現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。當 NIT 濃度為 0.6

20、 mg/mL時，正突變率最大， 為 30.4%，此結(jié)果與前期試驗中對產(chǎn)PG的金黃桿菌誘變基本相同。綜合考慮選擇NIT濃度為0.6 mg/mL的JP2條件進行NIT化學誘變，并在建立條件過程中隨機選取酶活于0 1.0 U/mLJP范圍內(nèi)的30 株菌株進行酶活與maxv 相關(guān)性分析，結(jié)果如圖7 所示。將 30 株酶活 01.0 U/mL 范圍內(nèi)的菌株發(fā)酵液測定maxv，測得的maxv 與苯酚次氯酸鹽反應測定酶活結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.890 ，兩者呈高度正相關(guān)。 此方法得到驗證，可以應用于誘變初篩的階段，大大減小了工作量。FK（ W11TPHC7.tifFK） 2.4maxv測定在NIT第1 輪誘變

21、中的放大應用以Y8-10-1作為出發(fā)菌株，利用測定maxv 方法進行NIT第1 輪誘變初篩，結(jié)果如圖8 所示。FK（ W11TPHC8.tifFK） 誘變選取400 株菌株進行maxv 值測定，對于maxv大于出發(fā)菌株maxv（ 0.038 ）的菌株進行苯酚- 次氯酸鹽法復篩，其中得到酶活大于0.6 U/mL的菌株有 3 株，1505120312號菌株酶活為0.81 U/mL ，增加幅度最大。將這3 株菌進行4 次傳代并搖瓶發(fā)酵測定酶活，結(jié)果如表4 所示， 3 株突變菌體較原始菌株產(chǎn)酶能力均有明顯的提高，其中編號1505120312 的酶活提高最大，為0.73 U/mL ，是親本酶活0.40 U/mL的 1.825 倍，因此可通過本研究中建立的初篩方法在誘