生物化學(xué)分析的常規(guī)方法PPT課件

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的化學(xué)過(guò)程生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的物理過(guò)程實(shí)驗(yàn)方法的組合一、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程第1頁(yè)/共50頁(yè)1、實(shí)驗(yàn)的化學(xué)過(guò)程幾個(gè)要求分離試劑與目的物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或相互作用，不改變其屬性，保存分子的原獨(dú)立狀態(tài)。易使目的物發(fā)生存在狀態(tài)的變化（溶解度、分配系數(shù)等）。不易殘留，易回收處理，對(duì)人體和環(huán)境不易造成損害。鑒定試劑與目的物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)敏感，用量越少越好。與目的物結(jié)合專一性越強(qiáng)越好。第2頁(yè)/共50頁(yè)幾個(gè)要求配制提取液所需試劑明確目的物溶解性，確定溶劑。根據(jù)目的物用途確定溶劑類型（如用于食品以不含有毒有害成分為準(zhǔn)則，用于分析則要專一性好、靈敏度高）。根據(jù)所具有的條件及鑒定提取的需要進(jìn)行確定。提取溶劑的p

2、H 值利用目的物解離、沉淀物形成及穩(wěn)定。目的物解離或沉淀中僅有物理性狀變化。目的物可溶性好，鑒定時(shí)專一性好。對(duì)試劑選擇總的要求：1.滿足對(duì)目的物最大限度的溶解和分離要求，對(duì)于鑒定試劑要越純?cè)胶茫`敏度和轉(zhuǎn)移越高越好。2.用于起相同或相近作用的試劑要選擇成本低、用量少的試劑。3.所選擇的試劑只能促進(jìn)目的物向?qū)嶒?yàn)?zāi)康姆较蜣D(zhuǎn)移，而盡量不產(chǎn)生副反應(yīng)。第3頁(yè)/共50頁(yè)2、實(shí)驗(yàn)的物理過(guò)程（1）物理過(guò)程的特點(diǎn)目的物狀態(tài)的轉(zhuǎn)變只受物理因素（溫度、壓力、黏度、溶劑介電常數(shù)等）的制約制備性實(shí)驗(yàn)物質(zhì)狀態(tài)變化影響目的物狀態(tài)的因素：目的物分離量分離過(guò)程無(wú)目的物性質(zhì)改變鑒定性實(shí)驗(yàn)?zāi)康奈锔泄俚耐怀鲂阅康奈锕逃斜举|(zhì)的顯著性目

3、的物屬性的明朗化目的物應(yīng)用性的增強(qiáng)第4頁(yè)/共50頁(yè)（2）物理過(guò)程所需設(shè)備的選擇制備性實(shí)驗(yàn)分析鑒定類實(shí)驗(yàn)定性定量兼有類實(shí)驗(yàn)選擇原則：盡量選擇工作效率高、精確度大、分辨率好的設(shè)施和器具。綜合性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵：大量收集資料進(jìn)行方法上的分析、比較，全面了解各方法的優(yōu)缺點(diǎn)及使用條件等，形成自己的實(shí)驗(yàn)方案，然后再行選擇。依據(jù)實(shí)驗(yàn)性質(zhì)選擇依據(jù)方法的設(shè)計(jì)選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)器具和方法選擇的忌諱脫離客觀條件不根據(jù)所設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案選擇器具和設(shè)施所選儀器方法貪大求全實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與專業(yè)學(xué)科脫軌第5頁(yè)/共50頁(yè)3、實(shí)驗(yàn)方法的組合實(shí)驗(yàn)方法的組合的目的：構(gòu)成一個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的工作路線，避免盲目。要明確：做什么？用什么材料做？涉及的器具

4、和設(shè)施有哪些？工作量有多大？關(guān)鍵工作是什么？難點(diǎn)是什么等？制備性實(shí)驗(yàn)的流程：材料選擇材料選擇破碎勻漿破碎勻漿固液固液分離分離初步純化初步純化精制精制濃濃縮干燥縮干燥產(chǎn)物產(chǎn)物實(shí)質(zhì)：目的物的轉(zhuǎn)移過(guò)程。主線：保持目的物被獨(dú)立轉(zhuǎn)移的狀態(tài)（保持良好的活性）。條件控制和設(shè)施操作處于中心位置，要求各步驟銜接緊密，間歇短，一氣呵成。分析鑒定性實(shí)驗(yàn)的流程：目的物抽樣溶解目的物抽樣溶解溶液溶液樣品樣品顯色顯色成分測(cè)定成分測(cè)定換算換算分析分析數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)關(guān)鍵：顯色反應(yīng)。要求顯色反應(yīng)靈敏、精確、穩(wěn)定，重復(fù)性好。該類實(shí)驗(yàn)的多環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)組合越簡(jiǎn)化越好，時(shí)間越快越精確。第6頁(yè)/共50頁(yè)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的設(shè)計(jì)1、對(duì)分離制備性實(shí)驗(yàn)，

5、盡量做到目的物回收率、純度、活性均較高；2、整個(gè)過(guò)程參與環(huán)節(jié)的組合越緊湊越好，活性和目的物流失越少越好；3、設(shè)備和試劑的選擇要根據(jù)目的物的要求確定用量以減少消耗；4、整個(gè)流程要有可操作性，同一操作方法，盡量避免重復(fù)使用。第7頁(yè)/共50頁(yè)二、 生物化學(xué)分析方法重量法化學(xué)法分光光度法（比色分析法）酶法色譜法 生物化學(xué)分析的目的：測(cè)定一定供試樣本中某類或某種生化物質(zhì)的含量或活性。第8頁(yè)/共50頁(yè) 1.重量法 重量法：通過(guò)一定的方法和程序，從供試樣本中提取、純化出某一類或某一種成分，求出其在樣本中所占比例的分析法。 常用重量法分析的生物物質(zhì)：水分、灰分、粗脂肪、纖維素等。 例：油料作物種子粗脂肪的含量

6、的測(cè)定 選取具代表性的種子，去雜質(zhì)，按四分法縮減取樣。然后按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB）制樣、取樣、抽提、干燥、稱重、計(jì)算含量。第9頁(yè)/共50頁(yè) 2.化學(xué)法 化學(xué)法：根據(jù)物質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)，按照等物質(zhì)量規(guī)則建立的分析方法。如酸堿滴定法、氧化還原滴定法、絡(luò)合滴定法等。 常用化學(xué)法分析的生物質(zhì)：蛋白質(zhì)（粗蛋白）含量、維生素C含量和某些酶活性測(cè)定等。 例：植物樣品中總蛋白（粗蛋白）含量的測(cè)定原理: 加熱植物樣品+H2SO4 催化劑 (NH4)2SO4+H3PO4+CO2 +SO2 +SO3 (NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH3 +4H3BO3 NH4HB4O7+5H2O NH4

7、HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3第10頁(yè)/共50頁(yè) 3. 分光光度法 分光光度法：是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來(lái)測(cè)定其含量的一項(xiàng)技術(shù)，其基本依據(jù)是朗伯-比爾定律。 分光光度法是生化分析中最常采用的技術(shù)（靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、精確、快速，對(duì)于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，不需分離即可檢測(cè)出其中所含的微量組分），涉及各種生物物質(zhì)的分析及酶活性的測(cè)定。 紫外 可見吸收光譜法是根據(jù)溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光譜區(qū)輻射能的吸收來(lái)研究物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)的方法。 第11頁(yè)/共50頁(yè) 4. 酶法 酶法分析的優(yōu)點(diǎn)：選擇性強(qiáng)，不受體系中共存物質(zhì)的干擾；靈敏度高，可測(cè)10-10g的微量物質(zhì)。酶 法化學(xué)法儀

8、器法直接測(cè)定法（產(chǎn)物的生成或反應(yīng)物的減少）間接測(cè)定法（利用偶聯(lián)反應(yīng)體系進(jìn)行）第12頁(yè)/共50頁(yè) 5. 色譜法 色譜法的主要作用：是實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的有效分離，完成定性、定量分析。 紙色譜、薄層色譜、薄膜色譜等通常用于定性分析；而高效液相、氣相等色譜則可做到短時(shí)間準(zhǔn)確完成生化物質(zhì)的分離和定量分析。第13頁(yè)/共50頁(yè)三、 主要生物物質(zhì)分析水分測(cè)定碳水化合物分析脂類物質(zhì)分析蛋白質(zhì)分析核酸分析礦物質(zhì)分析維生素分析第14頁(yè)/共50頁(yè) 1. 水分測(cè)定（生化分析的基礎(chǔ)） 常用水分測(cè)定方法：加熱干燥法加熱干燥法真空干燥加熱法常壓加熱干燥法各種研究中不同物質(zhì)分析結(jié)果的比較，利用實(shí)驗(yàn)材料的長(zhǎng)期保存。適用于受高溫

9、易變化的材料。條件：真空干燥箱（5-100mmHg、40-100）適用于相對(duì)耐高溫材料。條件：普通干燥箱。干燥一般過(guò)程：新鮮材料殺青（105 20min），然后80 烘至恒重（每次2h）。快速水分測(cè)定儀第15頁(yè)/共50頁(yè) 含水量的表示方法 含水量（占鮮重%）=（鮮重-干重）/鮮重100鮮重法最常用的方法水分測(cè)定注意事項(xiàng)： 測(cè)定樣品少量，但需具有代表性必須考慮所測(cè)材料的熱穩(wěn)定性，如油料種子只能在40-70 下烘干。每次烘干后需加蓋放入干燥器中冷卻（一般需30min）后才能稱重。烘箱內(nèi)一次放入的樣品不能過(guò)多，箱體邊角和下層不能放置樣品。干燥器下層放置未失效的干燥劑，干燥劑應(yīng)占底部容積的1/3-1/

10、2。第16頁(yè)/共50頁(yè) 2. 碳水化合物分析 碳水化合物（糖類物質(zhì)）碳水化合物單糖雙糖多糖有效碳水化合物：?jiǎn)翁恰⒌途厶?、糊精、淀粉、糖原等。無(wú)效碳水化合物：果膠、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等。總碳水化合物=100-（水分+粗蛋白+粗脂肪+粗灰分）%可溶性糖:還原性單糖、雙糖和非還原性雙糖、寡糖。不溶性糖：淀粉、果膠、半纖維素、纖維素、多縮戊糖等。第17頁(yè)/共50頁(yè) 碳水化合物的定性定量分析方法最常用的方法，并以還原糖測(cè)定方法為主。非還原糖和多糖等的測(cè)定是將其水解轉(zhuǎn)化成還原糖進(jìn)行測(cè)定，并以還原糖來(lái)表示其含量的。測(cè)定方法物理法化學(xué)法碳水化合物測(cè)定可溶性糖測(cè)定還原糖糖測(cè)定可溶性總糖測(cè)定淀粉的測(cè)定纖維素

11、測(cè)定定性定量的依據(jù)：糖分子中的四種結(jié)構(gòu)特征。含有的自由醛基和酮基的還原性；分子中醇醛縮水成糠醛或甲基糠醛與萘的成色反應(yīng)；：鄰位的醛、醇成脎后做熔點(diǎn)分析和結(jié)晶體分析；糖醇羥基的甲基酯化后進(jìn)行氣相色譜分析（組分分析）。第18頁(yè)/共50頁(yè) 可溶性糖定量測(cè)定的常用方法（1）可溶性糖的提取水提醇提適用于水果、蔬菜等樣品。樣品為糊狀或粉狀。提取條件:70-80水浴加熱1h.適用于含淀粉和葡聚糖較多的樣品。樣品用80%乙醇回流提取3次，每次30min，提取液合并，蒸去乙醇，蒸餾水定容。第19頁(yè)/共50頁(yè)（2）還原糖的測(cè)定3.5-二硝基水楊酸比色法（DNS比色法） 該法屬半微量定糖法，所測(cè)結(jié)果反應(yīng)的是樣品中各

12、種還原糖的總量。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、雜質(zhì)干擾少，尤其適合批量測(cè)定。 測(cè)定濃度范圍：大于50ng/ml,小于3.0mg/ml（樣品光吸收值不能超過(guò)0.8）;比色波長(zhǎng)540nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線（需過(guò)原點(diǎn)）所得結(jié)果一元回歸后其方程中的相關(guān)系數(shù)0.960.96，每次（每批）測(cè)定均制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項(xiàng)：第20頁(yè)/共50頁(yè)Somogyi-Nelson比色法（砷鉬酸比色法）優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性較好、產(chǎn)物穩(wěn)定，測(cè)定范圍：10-180g/ml；測(cè)定波長(zhǎng)560nm蘭-埃農(nóng)法（lan -Eynon）姆松-華爾格法（Munson-Walker）國(guó)際食糖分析方法統(tǒng)一委員會(huì)于1964年確定的還原糖標(biāo)準(zhǔn)分析方法。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)

13、性好。常量法；為斐林式滴定法的改進(jìn)方法第21頁(yè)/共50頁(yè)（3）可溶性總糖的經(jīng)典測(cè)定方法 原理：可溶性糖（單糖、寡糖、多糖）與強(qiáng)酸共熱生成糠醛衍生物，后者與顯色劑縮合成有色絡(luò)合物，便可進(jìn)行比色測(cè)定。方法苯酚-硫酸法蒽酮-硫酸法地衣酚-硫酸法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速、靈敏，顏色持久缺點(diǎn)：所用試劑腐蝕性強(qiáng)，有色樣品結(jié)果偏高，不理想。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速、靈敏。缺點(diǎn)：蒽酮試劑需當(dāng)日配用；色氨酸含量高的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有干擾；實(shí)驗(yàn)操作要求較高。該法操作簡(jiǎn)單，主要用于糖蛋白中總糖的測(cè)定。缺點(diǎn)：氨基糖的存在可導(dǎo)致顏色降低、色氨酸也可導(dǎo)致誤差 。組分分析： 薄層層析法、高效液相色譜法。第22頁(yè)/共50頁(yè)淀粉的測(cè)定方法酸堿

14、洗滌法（傳統(tǒng)方法）Van Soest酸洗滌劑法（ADF）粗纖維的測(cè)定方法CaCl2-HAcO浸提-旋光法淀粉糖化酶-酸水解法目前廣泛采用的方法（粗纖維測(cè)定儀）第23頁(yè)/共50頁(yè)脂類脂類 3. 脂類物質(zhì)分析第24頁(yè)/共50頁(yè)脂質(zhì)的提取有機(jī)溶劑萃取法機(jī)械壓榨法溶解度法皂化法最常用的方法，一般采用非最常用的方法，一般采用非極性溶劑（乙醚、氯仿、苯極性溶劑（乙醚、氯仿、苯等）提取非極性疏水結(jié)合的等）提取非極性疏水結(jié)合的脂質(zhì)。脂質(zhì)。根據(jù)溶解度差異進(jìn)行的分離提取。如卵磷脂易溶于乙醇而不溶于丙酮，腦磷脂易溶于乙醚而不溶于乙醇和丙酮主要用于可進(jìn)行皂化的甘油三脂和高級(jí)脂肪酸的提取主要用于從油料種子，采用105-

15、106Pa的壓力，將流動(dòng)性較大的油擠壓出來(lái)（毛油）第25頁(yè)/共50頁(yè) 組分分離、 分析方法薄層層析色譜法（TLC）分析方法氣相色譜法（GLC）分離方法：層析法高效液相色譜法（HPLC）分離混合脂最有效的方法。常用吸附層析、離子交換層析等。簡(jiǎn)單、快速、靈敏的方法，是分離復(fù)雜脂質(zhì)的好方法。常用于甘油三脂組分、磷脂組分、生育酚組分、脂肪酸組分、甾醇組分等的分析。脂質(zhì)分析研究中廣泛應(yīng)用的技術(shù)。主要用于脂肪酸、甘油三脂、生育酚、甾醇等的分析與質(zhì)譜連用鑒定組成成分第26頁(yè)/共50頁(yè) 粗脂肪的測(cè)定索氏提取法（粗脂肪提?。┲亓糠ǎù种径浚┑?7頁(yè)/共50頁(yè) 4. 蛋白質(zhì)分析 總蛋白（粗蛋白）分析：凱氏定氮

16、法（微量、半微量、常量法）總蛋白（粗蛋白分析）可溶性蛋白分析過(guò)程：消化、蒸餾、滴定、含量計(jì)算（蛋白質(zhì)系數(shù)：6.26）蛋白質(zhì)組成分析（氨基酸自動(dòng)分析儀） 加熱植物樣品+H2SO4 催化劑 (NH4)2SO4+H3PO4+CO2 +SO2 +SO3 (NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH3 +4H3BO3 NH4HB4O7+5H2O NH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3消化蒸餾滴定第28頁(yè)/共50頁(yè)消化爐及消化過(guò)程半自動(dòng)定氮儀：蒸餾過(guò)程手控自動(dòng)進(jìn)行全自動(dòng)定氮儀：蒸餾、滴定、計(jì)算同時(shí)自動(dòng)完成。第29頁(yè)/共50頁(yè) 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法含量測(cè)

17、定方法雙縮脲法考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法Folin-酚（Lowry）法二喹啉甲酸（BCA）法紫外吸收法氨基酸分析法靈敏度范圍：0.5-10mg/ml?？焖?、蛋白質(zhì)特異性影響??；準(zhǔn)確度較差。靈敏度范圍：0.005-0.1mg/ml。靈敏度和準(zhǔn)確度均高；繁瑣、專一性差、干擾物質(zhì)多。靈敏度范圍：0.01-1.2mg/ml。靈敏度和準(zhǔn)確度高，干擾物質(zhì)少；環(huán)境影響大、操作要求高。靈敏度范圍：0.025-0.2mg/ml?？焖?、簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好、干擾物質(zhì)少；不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大偏差。靈敏度范圍：0.2-2mg/ml。簡(jiǎn)便、快速、靈敏、不消耗樣品；準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多。最接近真實(shí)蛋白質(zhì)含量

18、的測(cè)定方法。準(zhǔn)確度最高；操作和設(shè)備要求較高，測(cè)得的蛋白質(zhì)含量較真實(shí)值略偏低。第30頁(yè)/共50頁(yè) 5. 核酸分析（核酸含量測(cè)定） 核酸含量的測(cè)定紫外吸收法二苯胺法（DNA）地衣酚法（RNA）定磷法 植物材料中DNA的提?。篊TAB法 動(dòng)物材料中DNA的提?。郝确庐愇齑挤ǖ?1頁(yè)/共50頁(yè)灰分測(cè)定：重量法 6. 礦物質(zhì)分析灰分測(cè)定礦質(zhì)元素測(cè)定主要步驟：樣品稱重碳化灰化恒重含量計(jì)算第32頁(yè)/共50頁(yè) 礦質(zhì)元素測(cè)定（定性定量分析）主要過(guò)程：樣品消化酸化測(cè)定測(cè)定儀器原子吸收分光光度計(jì)等離子發(fā)射光譜8種元素（Ca、Fe、K、Mg、Mn、P、Zn、B）可實(shí)現(xiàn)定量，18種元素實(shí)現(xiàn)半定量。第33頁(yè)/共50頁(yè)酶的

19、提取及活性測(cè)定：酶在提取時(shí)通常使用緩沖液提取并需加入保護(hù)劑和穩(wěn)定劑。酶活性測(cè)定方法：多種，常用比色法（試劑盒的應(yīng)用）。維生素測(cè)定方法：比色法、滴定法、儀器法等第34頁(yè)/共50頁(yè)生物大分子活性物質(zhì)的存在方式和存在特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料的選擇和要求材料的預(yù)處理生物組織與細(xì)胞的破碎四、實(shí)驗(yàn)材料的選擇及預(yù)處理第35頁(yè)/共50頁(yè)1、 生物大分子活性物質(zhì)的存在方式及存在特點(diǎn)（1）存在部位和分布方式：存在部位一般與生物學(xué)功能相關(guān)，分布方式則一般被分為“胞內(nèi)”和“胞外”。（2）存在的特點(diǎn)： 生物活性物質(zhì)在生物材料中含量較低，且生理活性越高的成分，含量往往越低。 生物材料中的生化組成數(shù)量大、種類多，目的物與眾多雜質(zhì)理化性

20、質(zhì)十分接近，所以分離、純化比較困難。 生物大分子活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，所以分離純化方法不同，不可能有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法。第36頁(yè)/共50頁(yè)生物大分子分離純化的一般步驟沉淀技術(shù)離心技術(shù)膜分離技術(shù)等前處理前處理粗分級(jí)粗分級(jí) 細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí) 濃縮干燥濃縮干燥材料選擇與處理細(xì)胞破碎及目的物的提?。C(jī)械破碎、溶賬和自溶、酶解、化學(xué)處理）原料的選擇和預(yù)處理原料的選擇和預(yù)處理生物組織與細(xì)胞的破碎生物組織與細(xì)胞的破碎從生從生物材料中物材料中提取有效的活性物質(zhì)提取有效的活性物質(zhì)有效成分的分離純化有效成分的分離純化后處理及制劑后處理及制劑離心技術(shù)電泳技術(shù)層析技術(shù)等化學(xué)法物理法第37頁(yè)/共50頁(yè)2、 生物材料的選

21、擇和預(yù)處理生物材料的選擇主要考慮：來(lái)源，價(jià)格，目的物含量，雜質(zhì)的種類、數(shù)量和性質(zhì)等。 一般選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生一般選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工產(chǎn)上注意選擇含量高、來(lái)源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？扑嚭?jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無(wú)需考慮上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康难羞x材則無(wú)需考慮上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯伞＜纯伞?材料選擇基本原則：有效成分含量高，來(lái)源豐材料選擇基本原則：有效成分含量高，來(lái)源豐富易得，材料新鮮，目的物易與非目的物分離，所取富易得，材料新鮮，目的物易與非

22、目的物分離，所取樣品具有均勻性和代表性。樣品具有均勻性和代表性。（1）材料的選擇）材料的選擇第38頁(yè)/共50頁(yè)（2）材料采集、保存和預(yù)處理 材料采集：要求新鮮、快速、完整、盡量不帶入材料采集：要求新鮮、快速、完整、盡量不帶入其他組織，符合衛(wèi)生條件，無(wú)微生物污染和有害物其他組織，符合衛(wèi)生條件，無(wú)微生物污染和有害物質(zhì)等。質(zhì)等。 材料保存方法：速凍、凍干、有機(jī)溶劑脫水、制材料保存方法：速凍、凍干、有機(jī)溶劑脫水、制成成“丙酮粉丙酮粉”、快速干燥等。、快速干燥等。 預(yù)處理預(yù)處理動(dòng)物材料動(dòng)物材料:去結(jié)締組織、脂肪組織等。去結(jié)締組織、脂肪組織等。植物材料植物材料:清洗、去殼、殺青等。清洗、去殼、殺青等。微生

23、物材料微生物材料:固液分離等固液分離等第39頁(yè)/共50頁(yè)u 動(dòng)物樣品預(yù)處理：動(dòng)物樣品預(yù)處理：清洗清洗去結(jié)締組織、脂肪組織等去結(jié)締組織、脂肪組織等絞絞碎、勻漿碎、勻漿脫脂脫脂冷凍處理（液氮或超低溫保存）。冷凍處理（液氮或超低溫保存）。u 植物樣品預(yù)處理：植物樣品預(yù)處理：制備“丙酮粉”l種子樣品的處理：去雜質(zhì)種子樣品的處理：去雜質(zhì)研磨或粉碎過(guò)篩（80-100目）混 勻保存（長(zhǎng)期保存需蠟封并放入少量樟腦或二氯甲苯等）。l根、莖、葉、果實(shí)樣品的處理：根、莖、葉、果實(shí)樣品的處理： 干樣制備：凈化干樣制備：凈化殺青（105，15-20min）烘干（70-80 ，8-12h）或鳳干粉碎過(guò)篩混勻保存。 鮮樣：

24、用于酶活性測(cè)定，某些化學(xué)成分含量測(cè)定的等。及時(shí)測(cè)定；液氮或超低溫保存；冷凍干燥后于0-4 保存；勻漿后樣品可加防腐劑（甲苯、苯甲酸等）于0-4 保存或超低溫保存。第40頁(yè)/共50頁(yè)u 微生物樣品預(yù)處理：主要是固液分離。最常采用的微生物樣品預(yù)處理：主要是固液分離。最常采用的方法為離心和過(guò)濾。液體部分可在低溫下短時(shí)間保方法為離心和過(guò)濾。液體部分可在低溫下短時(shí)間保存，固體則可制成凍干粉存，固體則可制成凍干粉于于0-4 0-4 長(zhǎng)期保存。長(zhǎng)期保存。3、生物組織與細(xì)胞的破碎、生物組織與細(xì)胞的破碎破碎方法物理法化學(xué)法：稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑、 表面活性劑等。生物法磨切法壓力法振蕩法凍融法組織自溶法酶解法噬菌

25、體法細(xì)胞破碎率測(cè)定方法:1.直接測(cè)定破碎前后細(xì)胞數(shù)。2.測(cè)定電導(dǎo)率。3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力。第41頁(yè)/共50頁(yè) 一般一般動(dòng)物組織和細(xì)胞動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎?？捎秒妱?dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。 植物組織和細(xì)胞植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。目的。 細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是

26、一借共價(jià)鍵連的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。第42頁(yè)/共50頁(yè)五、目的物的提取與分離1、目的物的提取、目的物的提取提?。ǔ樘峄蜉腿。豪靡环N溶劑對(duì)不同物質(zhì)溶解度的差提?。ǔ樘峄蜉腿。豪靡环N溶劑對(duì)不同物質(zhì)溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過(guò)程。異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過(guò)程。 物質(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇物質(zhì)的性質(zhì)與提

27、取方法的選擇一般規(guī)律：相似相溶；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性易溶于一般規(guī)律：相似相溶；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性易溶于堿性溶劑；溫度高，溶解度大；大分子蛋白質(zhì)、酶、活性肽堿性溶劑；溫度高，溶解度大；大分子蛋白質(zhì)、酶、活性肽等遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)等遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)PH時(shí)，溶解度增加。時(shí)，溶解度增加。操作時(shí)為盡量多的獲得目的物一般采取操作時(shí)為盡量多的獲得目的物一般采取多次提取多次提取，溶劑用量常，溶劑用量常為材料的為材料的25倍倍。第43頁(yè)/共50頁(yè)活性物質(zhì)的保護(hù)措施活性物質(zhì)的保護(hù)措施 采用緩沖系統(tǒng)：磷酸鹽、檸檬酸鹽、采用緩沖系統(tǒng)：磷酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、醋酸、醋酸、硼酸等緩沖液，一般要求濃度較低，以增

28、加目的硼酸等緩沖液，一般要求濃度較低，以增加目的物的溶解性能。物的溶解性能。 添加保護(hù)劑：半胱氨酸、巰基乙醇、金屬螯合劑添加保護(hù)劑：半胱氨酸、巰基乙醇、金屬螯合劑等。等。 抑制水解酶的作用：抑制水解酶的作用：EDTA、SDS、DFP(二異丙二異丙基氟磷酸基氟磷酸)、蛋白酶、蛋白酶K等。等。 其他保護(hù)措施：防紫外線、劇烈攪拌、過(guò)酸過(guò)堿、其他保護(hù)措施：防紫外線、劇烈攪拌、過(guò)酸過(guò)堿、高瀕振蕩等。高瀕振蕩等。第44頁(yè)/共50頁(yè) 溫度：溫度：對(duì)耐熱生化成分如多糖類，可用浸煮法對(duì)耐熱生化成分如多糖類，可用浸煮法（5090）；不耐熱生物活性物質(zhì)一般在）；不耐熱生物活性物質(zhì)一般在010 提取。提取。溶劑為有機(jī)試劑時(shí)必須在較低溫度下進(jìn)行提取。溶劑為有機(jī)試劑時(shí)必須在較低溫度下進(jìn)行提取。 酸堿度：酸堿度：pH值一般控制在值一般控制在49范圍內(nèi)，同時(shí)避免在目的范圍內(nèi)，同時(shí)避免在目的物等電點(diǎn)附近進(jìn)行提取。多糖類物質(zhì)因在堿中穩(wěn)定，多用物等電點(diǎn)附近進(jìn)行提取。多糖類物質(zhì)因在堿中穩(wěn)定，多用堿性溶劑系統(tǒng)提取。堿性溶劑系統(tǒng)提取。 提取液濃度：提取液濃度：2、影響提取的因素、影響提取的因素常用提取液氯化鈉溶液（氯化鈉溶液（0.10.15mol/L）磷酸鹽緩沖溶液（磷酸鹽緩沖溶液（0.020.05mol/L）焦磷酸鈉緩沖溶液（焦磷酸鈉緩沖溶液（0.020.