畢赤酵母表達操作手冊(PDF精譯版)

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2、體試劑盒畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒用于在含多拷貝基因的畢赤酵母菌中表達并分離重組蛋白綜述：基本特征：作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點：如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。不僅如此，操作時與E.coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)等其它真核表達系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價，且表達水平更高。同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點，且它的外源蛋白表達水平是后者的十倍以至百倍。這些使得畢赤酵母 成為非常有用的蛋白表達系統(tǒng)。與釀酒酵母相似技術(shù)：許多技術(shù)可以通用:互補轉(zhuǎn)化基因置換基因破壞另外，在釀酒酵母中應(yīng)用的術(shù)語也可用于畢赤酵母。 例如：HIS4基因都

3、編碼 組氨酸脫氫酶；兩 者中基因產(chǎn)物有交叉互補；釀酒酵母中的一些野 生型基因與畢赤酵母 中的突變基因 相互補，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因 在畢赤酵母中都有各自相互補的突變基因。畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母：畢赤酵母是甲醇營 養(yǎng)型酵母，可利用甲醇 作為其唯一碳源。甲醇代謝 的第一步是：醇氧 化酶利用氧 分子將甲醇氧化 為甲醛，還有過氧化氫。為避免過氧化氫 的毒性，甲醛代謝主要 在一個特殊 的細胞器-過氧化 物酶體-里進行，使得有毒的副產(chǎn)物遠離細胞其余組分。由于 醇氧化酶與02的結(jié)合率較 低，因而畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶。而調(diào)控產(chǎn)生醇過氧化 物酶的啟動子也正是驅(qū)動外源

4、基因在 畢赤酵母中表達的啟動子。兩種醇氧化酶蛋白：畢赤酵母 中有兩個基因編碼醇氧化酶 A0X1及A0X2。細胞中大多數(shù)的醇氧化酶是 A0X1基因產(chǎn)物。甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導A0X1基因的高水平表達， 較典型的是占可溶性 蛋白的30%以上。A0X1基因已被分離，含A0X1啟動子的質(zhì)粒可用來促進編碼外源蛋白 的目的基因的表達。A0X2基因與A0X1基因有97%的同源性，但在甲醇中 帶A0X2基因 的菌株比帶AOX1基因菌株慢得多，通過這種甲醇利用 緩慢表型可分離Muts菌株。表達：AOX1基因的表達 在轉(zhuǎn)錄水平受調(diào)控。在甲醇中 生長的細胞大約有5%的polyA+ RNA 來自AOX1基因。AOX1基

5、因調(diào)控分兩步：抑制/去抑制機制加誘導機 制。簡單 來說，在含 葡萄糖的培養(yǎng)基中，即使加入誘導物甲醇轉(zhuǎn)錄仍受抑制。為此，用甲醇進行 優(yōu)化誘導時，推 薦在甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)。注意即使在甘油中生長(去抑制)時，仍不足以使AOX1基因達 到最低水平的表達，誘導物甲醇是AOX1基因可辨表達水平所必需的。AOX1突變表型：缺失AOX1基因，會喪失大部 分的醇氧化酶 活性，產(chǎn)生一種表型為Muts的突變株 (methanol utilization slow)，過去稱為Mut，而Muts可更精確地描述 突變子的表型。結(jié)果 細胞代謝甲醇 的能力下降，因而在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢。Mut+ ( methanol ut

6、ilization plus ) 指利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。這兩種表型用來檢測外源基因在 畢赤酵母 轉(zhuǎn)化子中的 整合方式。蛋白胞內(nèi)及分泌表達：外源蛋白可在畢赤酵母 胞內(nèi)表達或分泌至胞外。分泌表達需要蛋白上的信號肽序列，將 外源蛋白靶向分泌通路。幾種不同的分 泌信號序列已被 成功應(yīng)用，包括幾種外源蛋白本身分泌信號序列，利用釀酒酵母a因子前原肽信號序列 也獲得許多成功。分泌表達外源蛋白的最大優(yōu)點是：畢赤酵母 只分泌很少的自身蛋白，加 上畢赤酵母 最小生長培養(yǎng)基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要組成成 份，也可算作蛋白純化的第一步。注意，如果外源蛋白一級結(jié)構(gòu)中有可識

7、別的糖基化位點 （Asn-X-Ser/Thr）,則這些位點可能發(fā)生糖基化。翻譯后修飾：與釀酒酵母相比，畢赤酵母 在分泌蛋白的糖基化方面有優(yōu)勢，因為不會使其過糖基化。 釀酒酵母與畢赤酵母 大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型，然而畢赤酵母中蛋白轉(zhuǎn)錄后所增 加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14個甘露糖殘基）比釀酒酵母 中的（50-150個甘露糖殘 基）短得多。另外，釀酒酵母核 心寡糖有末端a-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母 則沒有。一般認為釀酒 酵母中糖基化蛋白的a1,3聚糖接頭與蛋白的 超抗原性有關(guān)，使得這些蛋白不適于治療應(yīng)用。 雖然未經(jīng)證明，但這對畢赤酵母 產(chǎn)生的糖蛋白不構(gòu)成問題，因為畢赤酵母表達蛋

8、白與高 級真 核生物糖蛋白結(jié)構(gòu)相似。選擇載體用于基因多拷貝整合：在某些情況下，畢赤酵母中重組基因多拷貝整合可增加所需蛋白的表達 量。該試劑盒中 的三個載體均可用于在 體內(nèi)（pPIC3.5K, pPIC9K）或體外（pAO815）產(chǎn)生并分離多拷貝插 入，同時可檢測增加重組基因的拷貝 數(shù)是否增加蛋白表達 量。體內(nèi)整合可通過 高遺傳霉素抗 性，篩選可能的多拷貝 插入；而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。PPIC3.5K, PAO815用于胞內(nèi)表達，而pPIC9K用于分泌表達，所有載體均利用AOX1啟動子來誘導高 水平表達。多拷貝插入頻率：畢赤酵母His+轉(zhuǎn)化子高拷貝整合事件自發(fā)發(fā)生的概率為1

9、 - 10%，體內(nèi)方法可篩選可能 插入多拷貝外源基因的His+轉(zhuǎn)化子，體外方法可通過連接構(gòu)建 多拷貝子。當選擇His+轉(zhuǎn)化子 時，它們中插入體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)多聚體的概率很高。體內(nèi)多拷貝插入的產(chǎn)生：Ppic3.5k及Ppic9k含有細菌kan基因，賦予畢赤酵母遺傳 霉素抗性，注意Kan并不賦 予畢赤酵母卡那霉素抗 性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kan基因的數(shù)目。單拷貝 Ppic3.5k或Ppic9k整合入畢赤酵母 基因組后，賦予畢赤酵母 約0.25mg/ml的遺傳霉素抗 性水 平。任何載體多拷貝 整合可增加遺傳 霉素抗性水平，從0.5mg/ml （1-2拷貝）到4mg/ml （7-12 拷貝）。

10、由于kan基因與表達盒（pAOX1及目的基因）之間有遺傳連鎖，可從遺傳霉素高抗 性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數(shù)。由于基因的劑量效益，蛋白的表達 可能會增加。因 此，kan基因可檢測轉(zhuǎn)化子是否含有多拷貝目的基因。下圖顯示多拷貝插入及kan基因與表 達盒的連鎖。遺傳霉素直接選擇：在酵母中對遺傳霉素抗 性進行直接選擇并 不十分有效，因為新轉(zhuǎn)化的細胞需要時間表達 足夠量的抗性因子。由于酵母生長比細菌慢得多，大部分重組酵母在積累足夠多的抗性因子 以抵抗平板上抗生素之前就已經(jīng)被殺死了。最有效的篩選遺傳霉素抗性及高抗性克隆的程序 需要先對HIS +轉(zhuǎn)化子進行選擇，再進行不同水平遺傳 霉素抗 性篩選。雖然

11、可以用電泳進行直接篩選，但用在遺傳霉素篩選之 后再進行電泳篩選，獲得含高拷 貝克隆的機會更大，大約可獲得5-9拷貝的克隆，而直接電泳選擇只能獲得平均為1-3拷貝 的克隆。原生質(zhì)轉(zhuǎn)化時不能用遺傳霉素直接選擇。體外多拷貝插入的產(chǎn)生：下圖顯示如何產(chǎn)生多表達盒 插入載體以轉(zhuǎn)化畢赤酵母。目的基因插入獨個EcoRI位點 后，產(chǎn)生的表達盒（pAOXI及目的基因）上下游側(cè)翼分別為獨個的BglII及BamHI位點。5TT =HIS4Wjclcr比注色"IJh.-rH I1 Express ioh Cas wtteli.Ro go mb i n antVocicir1 E xpiM il cn6靈盟咖E

12、xprflrssJcn JwateMIS4RucoinbinantVectorS'AOTff卻IGATC cL-HC I CTAG tt marr p如4斗2 EKpr«»iioriiCassettes含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分離表達盒，表達盒再插入BamHI 位點以產(chǎn)生串聯(lián)重復表達盒，重復該插入程序可產(chǎn)生一系列含單個HIS4基因及逐漸增加數(shù) 目表達盒的載體。用體外形成的多拷貝子 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 增加了多拷貝表達盒 重組子岀現(xiàn)的頻率，可設(shè)計包 含一特定數(shù)目多拷貝插入的畢赤酵母 重組子。轉(zhuǎn)化及整合：可產(chǎn)生兩個不同表型的His+重組菌株：質(zhì)

13、粒DNA線性化位置不同，轉(zhuǎn)化GS115后可 產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)化子His+Mut+及His+Muts。KM71只產(chǎn)生His+Muts，因為該菌株為Muts表型。 兩種重組子Mut +及Muts都是有用的，因為一個表型可能比另一個表型更有利于蛋白表達。 理想條件下，每一個表型應(yīng)該檢測6-10個重組子。沒有辦法預測哪個結(jié)構(gòu)或克隆更利于蛋 白表達。強烈推薦用PCR分析重組子來證實整合情況。成功將基因構(gòu)建至AOX1啟動子下游后，線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母時 激發(fā)重組。下圖 顯示用不同酶消化時產(chǎn)生何種重組子。限制酶插入事件GS115表型KM71表型SalI 或 StuI插入his4His+Mut+His+MutsS

14、acI插入5' AOX1His+Mut+His+MutsBglII取代AOX1His+MutsHis+Muts （不推存）表達及擴大培養(yǎng)：用PCR證實畢赤酵母重組后，可檢測His+Mut+及His+Muts的表達。小規(guī)模培養(yǎng)每個 重組子，用甲醇誘導，檢測時間點.如果是胞內(nèi)表達，每個時間點細胞沉淀用SDS-PAGE分 析;如果是分泌表達，分 析每個時間點的細胞及上清。如果有蛋白的抗體，推薦既用考馬斯 亮藍染色又 用western blot分析SDS-PAGE凝膠。如果可以,建議檢測蛋白活性。因為并不是 所有蛋白都能達到g/l的水平，所以建議進行western blot或活性分析，不要僅做

15、SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色 分析。如何選擇最佳的表達蛋白畢赤酵母 菌株及優(yōu)化誘導見P49-50。如表達 已達最優(yōu)，大規(guī) 模表達以產(chǎn)生更多蛋白。VClune feBeoTtnrflm intofurm appropriate >t rib (GSllfnr MbT,Scrats 11 ms km)cdatmtu 啤pPIC3.氣K or 卩PIC'4K ti>uitrE9cq ob warkrat voKeRUBi&om ofSekect trwfm in with fhc k 卜牡心E血 taG-41S,Caanria Mat pbeut>pi£

16、;by hah畔Hu-母鈾艸 比，4 jiMLhAMi uLukI ISHerl 4-10 Cnkwiw rf each Mut phew type d tatlorcipnaxioiL方法畢赤菌株表型：畢赤酵母菌GS115及KM71在組氨酸脫氫酶 位點（His4）有突變，因而不能合成組氨酸， 所有表達質(zhì)粒都有HIS4基因可與宿主進行互補，通過不含組氨酸的培養(yǎng)基來選擇轉(zhuǎn)化子。., 8GS115及KM71自發(fā)回復突變到His +原養(yǎng)生物機率小于1/10。KM71的親本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突變，在不含精氨酸的培養(yǎng)基中 不能生長。用野生型ARG4基因破壞 A0X1基因后，產(chǎn)生KM

17、71 MutsArg+His-菌株。GS115及KM71都可在 復合培養(yǎng)基如YPD （YEPD ）及含組氨酸的最小培養(yǎng)基中生長。 轉(zhuǎn)化之前，GS115及KM71都不能在最小培養(yǎng)基中生長，因為它們是His-。KM71結(jié)構(gòu)：ARG4基因（約2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI（A0X1基因15/16密碼 子）及SalI（AOX1基因227/228密碼子）位點。ARG4取代了 AOX1基因16-227密碼子。此 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化至KM71親本菌（arg4his4）中,分離Arg+轉(zhuǎn)化子并分析Muts表型。Arg+轉(zhuǎn)化子遺 傳分析顯示野生型AOX1被aox1:ARG4結(jié)構(gòu)所取代。重點：用KM71

18、的優(yōu)點是，不需要在甲醇 最小培養(yǎng)基中篩選Mut表型。所有轉(zhuǎn)化子都是Muts 表型。第二，AOX1位點沒有被完全缺失，理論上可用你的目的結(jié)構(gòu)通過基因取代方法替換 aox1:ARG4結(jié)構(gòu)，這樣重組菌株的表型是His+MutsArg-，這意味著重 組菌株生長時需精氨 酸。不幸的是，僅添加精氨酸并不能完全緩和arg4突變的影響，arg4菌株在含精氨酸的最 小培養(yǎng)基中不能很好地生長。因此不推薦在KM71中通過取代aox1:ARG4結(jié)構(gòu)來獲得His +轉(zhuǎn)化子。菌株表達對照：GS115/His+Muts 白蛋白：該菌株為篩選畢赤酵母分 泌表達轉(zhuǎn)化子與Muts表型時的對 照。血清白蛋白基因及其自身分泌信號被整

19、 合進畢赤酵母AOX1位點。該菌株可分泌白蛋 白（67kDa）到培養(yǎng)基中，分泌水平 1g/l。GS115/His+Mut+ B半乳糖苷酶：該菌株為篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)表達與Mut+表 型時的對照。B半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合進畢赤酵母his4位點，該菌株表達 阡半 乳糖苷酶（117 kDa），達到通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色 或ONPG分析可測水平。畢赤酵母菌株生長：畢赤酵母生 長溫度為28-30度（液體、平板、斜面）。在32度以上誘導生長時，對蛋白 表達有害，甚至會導致細胞死亡。另外注意點有：1在YPD中，處于對數(shù)期的Mut+、Muts畢赤酵母 倍增時間為2小時2除了在甲醇中生

20、長速度不同外，Mut+、Muts生長速度沒有差別3甲醇培養(yǎng)基（MM ）中，處于對數(shù)期的Mut+倍增時間為4-6小時4甲醇培養(yǎng)基（MM ）中，處于對數(shù)期的Muts倍增時間為18小時51OD600=5 X 107 細胞 /ml注意：生長特性依重組菌株不同而不同在甲醇中生長：當使用甲醇平板或培養(yǎng) 基培養(yǎng)時，建議每天添加甲醇以補 償甲醇揮發(fā)及消耗。1平板培養(yǎng)時，在倒置平板蓋中加入100ul 100%甲醇2液體培養(yǎng)時，加 入100%甲醇至終濃度為0.5%3部分研究者在進行液體培養(yǎng)時，對Muts菌株每天加甲醇至濃度為1%，對Mut+菌株 每天加甲醇至濃度為3%時，對液體培養(yǎng)沒有不良影響。貯存：貯存細胞幾周

21、或幾月，用YPD培養(yǎng)基或YPD瓊脂斜面1挑取所需菌株單克隆在YPD平板上劃線生長2挑取單克隆轉(zhuǎn)移至YPD進行穿刺培養(yǎng)，30度2天3細胞在4度可放幾周幾月或幾年，存于80度1挑取所需菌株 單克隆在YPD中過夜培養(yǎng)2收集細胞，在含15%甘油的YPD中懸浮至終OD600為50-100 (大約2.5-5.0 X 109細 胞/ml)3細胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰凍再貯存于-80度。注意：在4度或80度長期保存后，用之前建議在MM、MD或MGY平板上劃線培養(yǎng) 以檢測His+轉(zhuǎn)化子的表 型是否正確及其活力。大腸桿菌菌株：大腸桿菌菌株表型：提供E.coli Top10F'以防沒有合適的E.coli

22、菌株。其它合適的菌株 為DH5 aF' JM109或其它重組缺失菌株(recA)，最好是endA,及帶有選擇性的F'附加體。 Top10F'適用于重組及單 鏈拯救。如果不需進行單鏈DNA拯救，也可用不含F(xiàn)'附加體的大腸桿菌菌株。建議：建議凍存Top10F'1在5ml含50 100mg/ml四環(huán)素的LB中培養(yǎng)Top10F '過夜2取0.85ml培養(yǎng)液加0.15ml滅菌甘油完全混勻3轉(zhuǎn)入凍存瓶中，凍在液氮或干冰/酒精浴中4存于-80度選擇畢赤酵母表達載體：選擇載體：如果目的蛋白是細胞溶質(zhì)型且是無糖基化蛋白，可選擇胞內(nèi)表達蛋白。如果 目的蛋白是正常分泌

23、、糖基化蛋白或直接分泌至胞內(nèi)細胞器內(nèi)，可嘗試分泌表達目的蛋白。建議用體內(nèi)及體外方法產(chǎn)生并分離外源基因多拷貝插入子。無法預測哪種方法適用于你的蛋白，每種方法的優(yōu)缺點如下:體外方法 pAO815優(yōu)點缺點可構(gòu)建特定數(shù)目的多拷貝子克隆特定數(shù)目多拷貝子需要更多工作大多數(shù)His +轉(zhuǎn)化子含有正確的特定數(shù) 目插入載體可能會很大，與基因大小及插入拷 貝數(shù)有關(guān)篩選多插入子很容易，因為大部分His +轉(zhuǎn)化子含有多拷貝目的基因在E.coli中可能會發(fā)生重排體外構(gòu)建可以分析拷貝數(shù)對蛋白表達的 影響多拷貝插入位于單一位點載體上無需另外的藥物抗性標記體外方法Ppic3.5k或Ppic9k優(yōu)點缺點開始頭驗比較谷易，轉(zhuǎn)化畢赤

24、酵母前載 體中只需克隆單拷貝基因定量篩選-遺傳霉素抗 性并不一定與基 因拷貝數(shù)相關(guān)1-10%的His +轉(zhuǎn)化子有自發(fā)的多拷貝 插 入篩選His +轉(zhuǎn)化子需要做很多工作，因為 要從成千上萬個His +轉(zhuǎn)化子中才能篩選到 足夠多的遺傳霉素抗性克隆進行檢測載體平均大小與其它畢赤酵母表達系統(tǒng) 相似多拷貝插入的數(shù)目不知（盡管可用 southern或dot blot分析方法進行檢測）多拷貝插入位于單一位點遺傳霉素篩選對 細胞密度敏感，可能會 分離到假陽性特點：下表顯示畢赤酵母多拷貝表達載體的 一般特點及優(yōu)點:特點描述優(yōu)點5 ' A0X1含AOX1啟動子的約1000bp片 段畢赤酵母中可實現(xiàn)甲醇誘導

25、的高 水平表達afactor信號序列編碼a因子信號序列 的269bp， 用于畢赤酵母分 泌表達（只能用于Ppic9k）分泌所需蛋白至培養(yǎng)基中MCS多克隆位點在表達載體中插入目的基因TTAOX1基因自帶的轉(zhuǎn)錄終止及polyA 信號（約 260bp）mRNA有效的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺 苷酸化HIS4畢赤酵母野生型基因編碼組氨 酸脫氫酶（約2.4kb），用于與畢赤酵 母his4菌株進行互補為選擇畢赤酵母 重組菌株提供選 擇標記3 ' AOX1AOX1基因序列，在TT3 '遠端序列（約650bp）質(zhì)粒靶向整 合進AOX1基因Amp pBR322 復制起點Amp抗性基因E.coli復制起始用

26、于選擇、復制及維護E.coliBamHIBglII NotISacISalIStuI單一酶切位點（StuI 在 Ppic3.5k 或 Ppic9k 中不是唯一的）可線性化載體，使有效插入畢赤 酵母基因組產(chǎn)生Mut+或Muts重組子Kan來自Tn903的卡那抗性基因，賦 予E.coli卡那基因抗性，賦予畢赤酵 母遺傳霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k）通過增加的抗遺傳霉素抗性，可 在體內(nèi)篩選多拷貝插入子在大腸桿菌中篩選Kan抗性菌株在該試劑盒中，任何畢赤酵母表達載體 都沒有酵母復制起始位點。只有當質(zhì)粒與畢赤酵 母基因組發(fā)生重組時，才能分離到HIS +轉(zhuǎn)化子。Ppic9k :含卡那基因，體內(nèi)

27、篩選多拷貝子 插入，分泌重組蛋白至培養(yǎng)基中。在GS115 及KM71中有功能。1 9276bp融合載體2在afactor分泌信號閱讀框中含有用于克隆的4個單限制酶位點。Sn aBI、EcoRI、Avril、 Notl3 afactor分泌信號分泌表達目的蛋白。表達時，目的基因必須克隆進信號序列 起始密 碼的讀碼框中畢赤酵母HIS4篩選GS115或KM71 ,在AOX1基因處插入，用Sacl線性化（對于GS115產(chǎn)生His+Mut+ , 對于 KM71 產(chǎn)生 His+Muts ）在HIS4位點插入，用Sall線性化（對于GS115產(chǎn)生His+Mut+，對于KM71產(chǎn)生His+Muts ）在GS1

28、15菌株中，替換AOX1基因，用BglII線性化（產(chǎn)生His+Muts ）Vap of pPICOKTbe- fisr.ut beloTF stoiiV* 忙 ixap ofpPICCK. Lfetail-s of is ziult甲上 ckmng nhc and. ifae a-factor =:e2i3ticn 監(jiān)gjul cue19. The 沁qsnz? zuy be db*nnl?nd?d fromcqoc= Q O Sba =U Q a o©ur 4 eb 丸蔭 umw irntrcgfL oom)甘 rfqueswd ftom Teclmcar9)CommnrRfor

29、pPICJKS275 nuK；loldes5' AQX1 prornolBr frsgirerit bases ' Q4&5' AQXT primer 眺e: bases 8»-«/b u-F JLtui 紀ueUuriL'dStib421&a F jLlor prrrcr she: base昌 11S2 1172 Muill；|jlo Oonng Silo:肚那3 121$ 1241 3' AQX1 ccirrer site: bases 1327-1343- AQXf l僖直irgcm tormlnaitbn (T

30、T);阪m 1253-15B0HIS4 CfiF: baseE4514-1S80ireskstanoe Qen ibases 57<1283' fiCX 1 frdynenL bdiiii 6122-6S?9 pBR322!afiigm! ba&es 200Ami|MciilirT rflEishinco gane: Liloe SS6&8106克隆進畢赤酵母多拷貝表達載體：介紹：下面列岀用這些載體進行克隆策略時應(yīng)考慮的方針?？紤]位點，如用Ppic9k載 體，應(yīng)考慮將目的基因克隆進a-factor信號序列 讀碼框中。建議將3個超螺旋畢赤酵母表達載體 轉(zhuǎn)化E.col

31、i，以便長期保存。1用滅菌水或TE緩沖液稀釋1ul質(zhì)粒（1ug/ul）至10-100pg/ul2取1-2ul稀釋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli，在含50-100 ug/mlAmp的LB平板上選擇一般考慮：下面是應(yīng)用pAO815、 Ppic3.5k或Ppic9k時的一般考慮1畢赤酵母的 密碼偏愛與釀酒酵母相同，已證明許多釀酒酵母 中基因在 畢赤酵母 中有交叉功能2應(yīng)在含recA, endA突變的E.coli菌株如Top10F'中構(gòu)建質(zhì)粒3AOX1mRNA的5 '末端在各多克隆位點都已標注岀。如需分析RNA，可計算插入基 因mRNA的大小4插入基因的終止密碼子或3' AOX1序

32、列可使翻譯有效終止，3 ' AOX1序列終止密碼 已標注出5在畢赤酵母及其它真核系統(tǒng) 中均發(fā)現(xiàn)了 “AT富含區(qū)”導致的轉(zhuǎn)錄提前終止。如果表 達蛋白時岀現(xiàn)問題，應(yīng)檢查是否是提前終止及AT富含區(qū)。如要表達基因則需改變基因序列。6Ppic9k中預測的蛋白酶裂解位點如圖(p28)所示7插入成熟基因的開放閱讀框,應(yīng)克隆進a-factor信號序列 讀碼框的下游一般克隆策略：1連接適合的限制性片段A直接插入MCS上兩個不同位點B利用相同的限制性末端，將片段連入單個合適位點2PCR擴增插入基因以產(chǎn)生合適的用于連入合適載體的限制性末端3擴增含目的基因片段通過TA克隆盒進行直接克隆，再將合適的片段亞克隆進

33、所選擇 載體克隆程序：注意：如果你要插入pAO815上EcoRI位點，而基因中也含有EcoRI位點，我們建議: 1Bsal可識別以下的限制性識別位 點：5 ' GGTCTCN/3 'CCAGAGNNNNN/2將EcoRI位點改造成BsaI可識別位點5 ' GGTCTCG/AA TTC 3 ' CCAGAGCTTAA/G 3將該序列通過PCR整合進DNA片段中，或在體外制造其它限制性位點的適配子接頭4用BsaI消化PCR產(chǎn)物或適配連接產(chǎn)物，這樣不用EcoRI消化就可產(chǎn)生EcoRI的限制 性末端。信號序列加工：Ppic9k中a-factor成熟信號序列加工分兩步：1

34、KEX2基因產(chǎn) 物初步切割信號序列，在Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala 中星號位置即arg及 glu之間岀現(xiàn)Kex2斷裂2STE13基因產(chǎn)物接著切割Glu-Ala重復序列優(yōu)化信號切割：釀酒酵母中，Glu-Ala重復序列并不是Kex2切割時的必需序列，但 Glu-Ala重復序列可使該切割更有效。Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有許多氨基酸都可 替代Glu，如芳香族氨基酸，小 氨基酸及組氨酸。但脯氨酸會抑制Kex2的切割。許多情況下，Stel13切割Glu-Ala重復片段效率不高，Glu-Ala重復序列就留在了表達 的目的蛋白的N端，這一般與目的蛋白本身性質(zhì)有關(guān)

35、。細菌轉(zhuǎn)化：一旦確定克隆策略，在進行連接反應(yīng)前應(yīng)制備好E.coli感受態(tài)，可參考電感 受態(tài)或化學感受態(tài)E.coli方法或使用本實驗室實驗程序。Ppic9k 的 pAOX1 及 MCS:特殊考慮：1目的片段必須克隆進分泌信號序列 開放閱讀框 中2信號序列中含ATG,翻譯 從離mRNA5 '端最近的一個ATG開始3如果插入片段中有BglII位點，畢赤酵母 轉(zhuǎn)化時，可選取其它限制性位點來線性化質(zhì) 粒(P30)轉(zhuǎn)化 E.coli :介紹：連接反應(yīng)之后，要通過化 學或電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞仃oplOF'或相似 菌株）轉(zhuǎn)化分析：1轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化混合物涂在含50-100ug/u

36、l Amp的LB平板上，選擇Amp抗性克隆2挑取10個Amp抗性轉(zhuǎn)化子，接種含50-100ug/ul Amp的培養(yǎng)基，37度振蕩培養(yǎng)過夜3小量制備分離質(zhì)粒DNA用于分析及測序。pAO815或pPIC3.5k測序時，用5 'AOX1 及3' AOX1測序引物；pPIC9k測序時，用afactor引物及3'AOX1測序引物。將引物重懸 于20ul滅菌水中，制成0.1ug/ul溶液。4在0.85ml過夜培養(yǎng)菌液中加入0.15ml滅菌甘油，以便保存所需克隆，渦旋混勻轉(zhuǎn)入 標記好的儲存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷凍后移入-70度保存。5測序證實結(jié)構(gòu)正確后，可準備轉(zhuǎn)化DNA重組克

37、隆測序：強烈建議轉(zhuǎn)化畢赤酵母前進行測序1正確讀碼框（分泌表達）2真核翻譯起始所需的ATG正確的上下文Muhiple CloningSiteof pPIC9KThebel&WdjeCAil fbfr nultipte cJduin. dee mdseqiwnces Porenlial stop codoai& are 叮bown imderhned."AACTAATTA理rmrend 24)TTATCATCATrTTTAA：TtA-CTTTCATAATTTTT AA:MA C TT AA GA Tc AAA AAAaFactoc Sijfikal SequenceCUA

38、AACG ATG- AGA T TT CC T TCA ATT賊* T； AriJ Phe Pxr&11 flITTACT左TT1 ATTC占匸AGUATCCTCC CA.TTAGCTGCTFhwTh FA 1 AVA1L«u葉科JU AAl aSer百erAl .LahjAL AAla100CAGTCAACACTA.AAC AWGAAACGGCACAAATT.：.：-.TFroVaiA s nThrThrThrGlu仰-GluThrAlalieFro105GCT；zAAGL!TGTCA.TCGETTACTCAGATTTAGAAGWGATTTCAlaGluAl rlVai1

39、1-RGlyTyrSerAspLeuGlu -1 yAspi h-10 5；tATGTTGLTUTTGATTTT : rA ACASZAC AAATAAC: TAspVaiA 1 AVaiL*UF FOPh呂；：4 kAa-n:：»ThrAs nAs n1 V越 卜丄","far11311Aj 1 ："T T "PAl AAA1iACTAC1'ATTG czcAvCATTGCT GCTAAALeuLe uPh sI leA snI FifThrlieAlaSerHeAl a Al aLysVKck> sickil 亡 1 合AT箏

40、SiuiB111；tAAGAAGGQ.riAj JCTCAAJkA<lfcTGA占GCTGAA GCTTAC.-bi -1 '1Gly -a 1SerL9UGLuLy sArgCluAl a丄G1 U A1丑*TyrEcu KI1-db r 01 l|斗件1Sic l I 遼曰崗1 dtikvsgt121GT AGAATTCCC'lA.GGL；CGGCCGCGAATTA ATTCC5CC：TTA£；VaiGluFroA rgAlaAlaAlaAsn* * *125刃幾L “t ： ：l J. . I L 4/.A j j /.片汀.GCTA-GATTCTA AT

41、t ： A AGA 時益 A TL； T £：A LiAA TL J I I1 j：135AGCTTCATTI TTA1A：TI TTT1 ATTTiiT AAC2CTA1ATAGTA1 ACATTJmRA r end 4 MIS)140 TTTTTi UTCASpecialConidergtiQnsTh*contaliiiQg the gen« of inierest 空皿t be doned in frame with th«secretion signal open readui 旨祖建An iniTialiEi ATG is provided by die

42、 signal seqiipence Translation vrill initiate a: the ATG closest to the 5' end of the diRNjlIf your insen has a Bgl 11 site, please 5ee pa：e 30 for akeimre retnction sites to Ihleanze yclur plnsmid for Pith仙 trailfbrniatioii.克隆基因后：克隆進pAO815后，需在體外構(gòu)建多插入子如果克隆進Ppic3.5k或Ppic9k，可準備將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母。轉(zhuǎn)p28準備轉(zhuǎn)

43、化DNA :你應(yīng)該已經(jīng)獲得正確插入目的基因的畢赤酵母表達載體 質(zhì)粒，以用于 表達。下表列出下階段應(yīng)做的實驗。步驟實驗頁數(shù)1準備轉(zhuǎn)化用DNA28-302GS115或KM71用于制備去壁細胞31-343DNA 轉(zhuǎn)化 GS115 或 KM7135-364選擇His+轉(zhuǎn)化子355如果將基因克隆進Ppic3.5k或Ppic9k，篩選His+轉(zhuǎn) 化子的遺傳霉素抗性37-406證實重組菌的Mut+Muts表型41-437PCR鑒定基因是否存在70-718檢測基因表達44-48建議同時分離His+Mut+及His+Muts畢赤酵母 轉(zhuǎn)化子,因為很難預測哪種結(jié)構(gòu)更利于蛋 白表達。通過線性化DNA 5'

44、AOX1區(qū)或HIS4基因及使用GS115(Mut+)或KM71(Muts) 菌株，可方便地分離到Mut+及Muts重組子。每次轉(zhuǎn)化時使用約10ug線性化DNA。質(zhì)粒DNA準備：用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA起碼純到可以做酶切，DNA越純，轉(zhuǎn) 化效率越高。建議用S.N.A.P MiniPrep Kit來準備質(zhì)粒DNA用于常規(guī)畢赤酵母轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒 DNA也可通過 堿裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀來獲得。線性化質(zhì)粒DNA :建議使用下列方法線性化載體以獲得Mut+及Muts重組子，可能其 中一個會比另一個更利于表達多拷貝 重組子。如果只想得到Muts重組子，使用KM71菌株。 單個十字交換事件可比雙重十字

45、交換更容易、更有效地獲得Muts重組菌(例如：插入AOX1 或his4而不是取代AOX1 )。如果插入片段含有下列任何限制性位點，見P29-30以替換位點。1如果克隆進Ppic3.5k，線性化時，插入 AOX1 用 Sacl(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts)插入 HIS4 用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts)2如果克隆進pAO815，線性化時，插入 HIS4 用 SalI 或 StuI (GS115, Mut+ 或 KM71, Muts )注意如果用pAO815載體，插入2個或更多拷貝子 會產(chǎn)生SacI酶切位點3如果克隆進Ppic9k，線性化時，插

46、入 AOX1 用 SacI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts)插入 HIS4 用 SalI(GS115, Mut+ 或 KM71, Muts)程序：1酶切新構(gòu)建載體及親本載體。將親本載體轉(zhuǎn)入GS115或KM71用作表達的背景對照2凝膠分析酶切產(chǎn)物以確定是否酶切完全。如酶切不完全，轉(zhuǎn)化數(shù)及靶向效率都會降低3用酚：氯仿：異戊醇(25: 24： 1)抽提酶切產(chǎn)物，乙醇沉淀DNA，用10-20ulTE緩 沖液重懸。不需要將目的基因片段從線性化質(zhì)粒中分離純化出來。4貯存于-20度直至轉(zhuǎn)化替換酶切位點：下表列出線性化載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母時的 可替換酶切位點。注意Ppic9k中Kan基因中含St

47、uI位點，而HIS4上的StuI位點則被去 除。pPI<$IC Xaie an addidoLii 3加 I sue 訓貼 added, with The lEcludoEoftlie 皿 ga史一 亡;nugxmg die ouiquc 気 I ziti in HIS4.RestrictionEnnuis言 AQX13r A 0X1Vector ba ckb-oneHJW gene尿209Pme I414Bpti 102IArm I購陽T2fr875*-Drat414心 S046. S0<55t <757WI*-M7S彌E*3845豐Ktaze mwl (o ztncrat

48、e gene 氏卩be enieu恬 旅 HQX】ui G 511 ? only.對照：建議轉(zhuǎn)化畢赤酵母時 用以下對照：1親代載體與重組載體以相同方式進行酶切，可在用PCR證實整合時作對照，還有表 達分析及定量dot blot或southern分析時作為 背景對照。2含有單拷貝目的表達盒的pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k。以與多拷貝子同樣 方式線性 化pAO815載體。大多數(shù)通過轉(zhuǎn)化 重組Ppic3.5k或Ppic9k而得到的His+重組子只含有單拷貝 插入。確保 你挑取的轉(zhuǎn)化子只能抗0.25mg/ml遺傳霉素。pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k單拷貝對照應(yīng)與 正檢測的假

49、定多拷貝重組子具有相同的 Mut表型。這些單拷貝重組子可作為與多拷貝子 進 行表達比較的參照，也可作為定量dot blot及southern分析時的參照。這是非常 重要的參數(shù), 因為目的基因拷貝數(shù)的增加并不一定會增加重組蛋白的表達 量。培養(yǎng)畢赤酵母用于制作原生質(zhì)細胞：介紹：一般，對大多數(shù)的研究者來說，原生質(zhì)細胞及電轉(zhuǎn)是效率最高的轉(zhuǎn)化方法(103-104 轉(zhuǎn)化子/ugDNA )。畢赤酵母同樣 可用PEG1000( P68)或LiCl ( P69)進行轉(zhuǎn)化。這兩種方 法，特別是LiCl方法不如原生質(zhì)法及電轉(zhuǎn)化方法。如果沒有電轉(zhuǎn)化裝置，建議使用原生質(zhì) 細胞法或PEG1000法。畢赤酵母的 轉(zhuǎn)化效率不

50、如釀酒酵母的 轉(zhuǎn)化效率高。原生質(zhì)細胞的解釋：畢赤酵母 細胞壁阻止攝入DNA，有必要去除部分細胞壁以吸收 DNA。藤黃節(jié)桿菌酶是一種葡聚糖酶，可在細胞壁水解葡聚糖的B- 1,3接頭，還可部分地 消化細胞壁。該方法的關(guān)鍵在于不能過度消化細胞壁，否則會導致細胞死亡。藤黃節(jié)桿菌酶 消化能力受細胞對SDS敏感性的影響。等量細胞加入SDS,以產(chǎn)生原生質(zhì)細胞，該步的結(jié) 果是溶液變澄清，其澄清度可由800nm處的吸光值獲得。一般經(jīng)驗，獲得70%原生質(zhì)細胞時，消化程度較好。用等滲溶液清洗細胞除去酶并與 DNA共孵育。將細胞重懸于山梨醇溶液中，細胞壁再生后再鋪板。準備：制備下列溶液，存于4度。YPD (Yeast

51、 Extract Peptone Dextrose)培養(yǎng)基 1LYPD平板1LRDB (Regeneration Dextrose Base) 平板 1LRDHB ( Regeneration Dextrose Histidine Base ) 平板 1L轉(zhuǎn)化當天，配制下列試劑：存于4度5% SDS溶液RD （ Regeneration Dextrose）融化瓊脂 100ml溶液：細胞去壁及轉(zhuǎn)化試劑1M山梨醇SE:1M 山梨醇，25mM EDTA pH8.0DTT:用水配制成1M濃度SCE：1M 山梨醇，1mM EDTA , 10mM 檸檬酸鈉緩沖液 pH5.8CaS:1M 山梨醇,10mM

52、Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCI2藤黃節(jié)桿菌酶：用水配制成3mg/ml的濃度40%PEG :用水配制 40%（ w/v）PEG3350（試劑純）CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2SOS: 1M 山梨醇,0.3 X YPD, 10mM CaCl2每次轉(zhuǎn)化時配制：SED: 19mlSE 力廿 1ml 1M DTTPEG/CaT: 1:1 混合 40%PEG 及 CaT程序：1在YPD平板上劃線培養(yǎng)GS115或KM71,28 30度培養(yǎng)2天，以得到分散的單克隆。2在50ml離心管或100ml搖瓶中，從GS115或KM71平板上挑取單個克隆接種10ml

53、YPD , 28 30度劇烈振蕩（250-300rpm）過夜。該培養(yǎng)基可在4度保存數(shù)天。3在3個500ml培養(yǎng)瓶中加入200mlYPD，分別取5、10及20ul第2步中的細胞，于 28-30度劇烈振蕩（250-300rpm ）過夜4第二天早上，將試劑盒中的轉(zhuǎn)化溶液（SE，SCE，滅菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨 醇），RDB平板（用于轉(zhuǎn)化）、RDHB平板（活力對照），放置于室溫下。5測每個培養(yǎng)瓶中的0D600值6收集0D600值為0.2-0.3瓶中的細胞，室溫，1500g離心5-10min。去除上清，接下去 準備細胞去壁注意：如果培養(yǎng)基都超過0.3，選擇一個培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基以1：

54、4稀釋，28-30度 孵育直至0D600值至0.2-0.3 （2-4小時）。收集細胞如第6步準備細胞去壁：取得上述第6步細胞1取100ml融化的RD瓊脂糖，存于45度2解凍1管1M DTT3為該次去壁細胞試驗準備新鮮的SED無菌條件下，將19mlSE轉(zhuǎn)入合適的滅菌容器中（如50ml離心管），加1ml 1M DTT 混合均勻，為得到最好的效果，SED現(xiàn)配現(xiàn)用注意：DTT的質(zhì)量及新鮮度是成功制備去壁細胞的關(guān)鍵，1M DTT分析純，-20度保 存。洗滌細胞：1用20ml滅菌水懸浮洗滌細胞，轉(zhuǎn)入滅菌的50ml的離心管中2室溫1500g離心5min，收集細胞3將細胞 重懸于20ml新鮮的SED中洗滌，如

55、2離心4用20ml 1M山梨醇洗滌，離心如25用20ml SCE緩沖液重懸細胞，將懸液分至兩個50 ml離心管中（10ml/管）6取1管藤黃節(jié)桿菌酶置于冰上，輕彈管壁以混勻，藤黃節(jié)桿菌酶以漿液的形式存在， 無需配成溶液，將它混勻以確保每次的量是相等的。加入藤黃節(jié)桿 菌酶：可先取一管細胞來確定用藤黃節(jié)桿菌酶消化細胞的最佳時間，一旦 確定時間，取另一管細胞進行裂解。藤黃節(jié)桿菌酶消化細胞壁，使細胞變 脆，拿樣品時要輕 柔些，加入藤黃節(jié)桿菌酶后，即開始消化細胞壁。*準備至少20ml 5%SDS溶液*將分光光度計調(diào)至800nm處，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白*準備 10 個滅菌離心管，編號 0, 2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40, 45，501取5步中一管細胞，取岀200ul加入標0的管中，置于冰上，此即0點2加7.5ul藤黃節(jié)桿菌酶到該管剩余細胞中，輕輕顛倒混勻，30度孵育，不要晃動樣品。 該