核酸的分離純化

1、2021-11-161生物化學(xué)教研室 劉潔2021-11-162 核酸的分離與純化2021-11-164v核酸包括核酸包括DNA、RNA，在細胞中都與蛋白質(zhì)結(jié)合而，在細胞中都與蛋白質(zhì)結(jié)合而存在。存在。vDNA 主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNA。vRNA 主要存在于細胞質(zhì)中，如主要存在于細胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。等。v非細胞形式存在的病毒和噬菌體（或只含非細胞形式存在的病毒和噬菌體（或只含DNA，或，或只含有只含有RNA）。

2、）。2021-11-165v 分離純化核酸總的原則分離純化核酸總的原則 :1、保證一級結(jié)構(gòu)的完整性，完整的一級結(jié)構(gòu)是研、保證一級結(jié)構(gòu)的完整性，完整的一級結(jié)構(gòu)是研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)；究核酸結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)；減少化學(xué)、物理、生物因素對核酸的降解：減少化學(xué)、物理、生物因素對核酸的降解：避免過酸、過堿對磷酸二酯鍵的破壞；避免過酸、過堿對磷酸二酯鍵的破壞；避免機械剪切力以及高溫煮沸；避免機械剪切力以及高溫煮沸；抑制抑制DNase或或RNase的活性；的活性；2、排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等分子的污染，保證、排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等分子的污染，保證核酸樣品的純度。核酸樣品的純度。2021-11-166核酸

3、分離提取的基本步驟核酸分離提取的基本步驟Step 1Step 2Step 3Step 4細胞的破碎：物理方法溶脹和自溶化學(xué)方法生物酶降解核酸的純化核酸的濃縮和沉淀核酸的保存2021-11-167細胞的裂解細胞的裂解v物理法：煮沸、凍融、微波、超聲波、勻漿、液物理法：煮沸、凍融、微波、超聲波、勻漿、液氮研磨等，這些物理操作可能導(dǎo)致氮研磨等，這些物理操作可能導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。鏈的斷裂。v化學(xué)法：高鹽、表面活性劑化學(xué)法：高鹽、表面活性劑SDS、熱酚法等。、熱酚法等。v酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等，此方法等，此方法較為溫和，可獲得大分子量的較為溫和，可獲得大分子量

4、的DNA。2021-11-168核酸的純化核酸的純化v雜質(zhì)主要包括三部分：蛋白質(zhì)等大分子污染物；蛋白質(zhì)等大分子污染物；其它核酸分子；其它核酸分子；分離純化過程中加入的對后續(xù)實驗有影分離純化過程中加入的對后續(xù)實驗有影響的溶液和試劑。響的溶液和試劑。2021-11-169v分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。分開，同時避免核酸降解。v一般采用方法是：酚一般采用方法是：酚/氯仿抽提。氯仿抽提。 其原理：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)其原理：交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑，以增加去除蛋白質(zhì)的效果。因為酚雖然變性劑，以

5、增加去除蛋白質(zhì)的效果。因為酚雖然可有效地變性蛋白質(zhì)，但它不能完全抑制可有效地變性蛋白質(zhì)，但它不能完全抑制DNase的活性。氯仿能加速有機相與液相分層。在氯仿的活性。氯仿能加速有機相與液相分層。在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生氣泡。最后用氯仿抽提是為了去除作過程中產(chǎn)生氣泡。最后用氯仿抽提是為了去除核酸溶液中的痕量酚。核酸溶液中的痕量酚。2021-11-1610核酸的沉淀、濃縮核酸的沉淀、濃縮v沉淀是濃縮核酸最常用的方法沉淀是濃縮核酸最常用的方法v優(yōu)點優(yōu)點改變核酸的溶解緩沖液種類；改變核酸的溶解緩沖液種類；重新調(diào)整核酸的濃度；重

6、新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2021-11-1611沉淀核酸常用的鹽和有機溶劑沉淀核酸常用的鹽和有機溶劑v鹽類：NaAc、 KAc、 NH4AcNaCl 、 KCl、 MgCl2v有機溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇乙醇、異丙醇、聚乙二醇2021-11-1612核酸的保存核酸的保存vDNA DNA樣品溶于樣品溶于pH8.0的的TE緩沖液，緩沖液，-20 或或-70保存；保存；vRNA RNA樣品溶于三蒸滅菌水中，樣品溶于三蒸滅菌水中，-70 保存保存; 長期保存可溶于長期保存可溶于0.1%DEPC水中。水中。*TE緩沖液緩沖液(pH8.0)：Tris-

7、EDTA buffer(100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0)*DEPC水：水：焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的水。處理的水。2021-11-1613注意事項注意事項v材料新鮮。盡量簡化操作步驟，縮短提取時間，減少有材料新鮮。盡量簡化操作步驟，縮短提取時間，減少有害因素對核酸的破壞；害因素對核酸的破壞；v減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸，過堿對磷酸減少化學(xué)因素對核酸的降解，為避免過酸，過堿對磷酸二酯鍵的破壞，操作多在二酯鍵的破壞，操作多在pH410條件下進行；條件下進行；v減少物理因素對

8、核酸的降解，主要是機械剪切力和高溫。減少物理因素對核酸的降解，主要是機械剪切力和高溫。04的溫度環(huán)境降低核酸酶的活性與反應(yīng)速率，減少的溫度環(huán)境降低核酸酶的活性與反應(yīng)速率，減少對核酸的生物降解；對核酸的生物降解；v防止核酸的生物降解，主要是指細胞內(nèi)、外的各種核酸防止核酸的生物降解，主要是指細胞內(nèi)、外的各種核酸酶。如酶。如DNase需要金屬二價離子需要金屬二價離子Mg+，Ca+的激活，的激活，使用金屬二價離子螯合劑使用金屬二價離子螯合劑EDTA檸檬酸鹽，基本可以抑檸檬酸鹽，基本可以抑制制DNase活性。活性。2021-11-1614核酸的鑒定核酸的鑒定紫外分光光度法紫外分光光度法v原理：核酸分子中

9、的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，可原理：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外線，最大吸收波長為以吸收紫外線，最大吸收波長為260nm，利用這，利用這一特性可定量溶液中的核酸濃度。一特性可定量溶液中的核酸濃度。v結(jié)論：結(jié)論：1.000A 260nm = 50g/ml ds-DNA1.000A 260nm = 40g/ml ss-RNA1.000A 260nm = 33g/ml ss-DNA2021-11-1615紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟1.吸取一定量的吸取一定量的DNA樣品或樣品或RNA樣品，加水至特定體積后樣品，加水至特定體積后（3ml），轉(zhuǎn)入

10、分光光度計的石英比色杯中。），轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。2.分光光度計先用一定量的水校正零點。分光光度計先用一定量的水校正零點。3.測定待測樣品在測定待測樣品在260nm和和280nm的吸光度值。的吸光度值。4.計算濃度。計算濃度。 ds-DNA (g/l) = A260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù)50/1000 ss-RNA (g/l) = A260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù)40/10005.分析純度。分析純度。2021-11-1616測定結(jié)果分析測定結(jié)果分析1、測、測DNA：純的純的DNA樣品樣品A260/A280應(yīng)為應(yīng)為1.81) A260/A280大于大于1.9時，表明有時，表明有RNA

11、污染。污染。2) 小于小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；注：注： 可能可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的的DNA溶液比溶液比值為值為1.8的情況。的情況。2021-11-16172、測、測RNA：純的純的RNA樣品其樣品其A260A280應(yīng)介應(yīng)介于于1.82.0之間之間1）若）若RNA樣品樣品A260/A280比值太小，說明有蛋比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染；白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；時，可能被異硫氰酸胍等污染；2021-11-1618溴乙錠熒光法溴乙錠熒光法v原理：原理：DNA、RNA在

12、熒光染料溴乙錠在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿嵌入堿基平面之間后，基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，溶液作標準對照，可比較出被測可比較出被測DNA溶液濃度。該法靈敏度可達溶液濃度。該法靈敏度可達15ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。，適合低濃度核酸溶液的定量分析。v注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。2021-11-16191. 溶脹：雙蒸水低滲溶脹紅細胞及白細

13、胞膜，釋溶脹：雙蒸水低滲溶脹紅細胞及白細胞膜，釋放出血紅蛋白及細胞核。放出血紅蛋白及細胞核。2. 破核膜：破核膜：STE裂解液、裂解液、SDS、蛋白酶、蛋白酶K等破壞等破壞核膜，使蛋白質(zhì)變性并降解，核蛋白體被破壞。核膜，使蛋白質(zhì)變性并降解，核蛋白體被破壞。 3. 抽提：酚抽提：酚/氯仿作用使蛋白質(zhì)與氯仿作用使蛋白質(zhì)與DNA分離。分離。4. 離心后離心后DNA存在于上層水相中。在高鹽環(huán)境下，存在于上層水相中。在高鹽環(huán)境下，用乙醇沉淀收集用乙醇沉淀收集DNA。外周血白細胞外周血白細胞DNA的提取的提取2021-11-1620操作步驟操作步驟 1.取新鮮抗凝血取新鮮抗凝血3ml， 離心離心3000

14、rpm5 min，棄上清，留沉淀。，棄上清，留沉淀。2.加加5倍體積倍體積ddH2O ，充分振蕩，室溫靜置，充分振蕩，室溫靜置5min，離心，離心6000rpm7 min，留，留沉淀。（重復(fù)兩次）沉淀。（重復(fù)兩次）3.生理鹽水生理鹽水3ml，平衡沉淀物，室溫靜置，平衡沉淀物，室溫靜置5min，離心，離心6 000rpm7 min，洗滌，洗滌沉淀兩次。轉(zhuǎn)移入沉淀兩次。轉(zhuǎn)移入1.5ml EP管中。管中。4.加入加入450l STE裂解液裂解液和和50l10%SDS，充分混勻，再加入，充分混勻，再加入10mg/ml蛋白酶蛋白酶K 10l，混勻，混勻，55水浴水浴1h。5.加入加入Tris-飽和酚飽和

15、酚500l，顛倒混勻，顛倒混勻10min。6.離心離心10 000rpm6 min ，轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移上層水相上層水相于一新于一新EP管中。管中。 7.加入等體積（加入等體積（1:1）酚和氯仿酚和氯仿各各500 l， 緩慢顛倒混勻緩慢顛倒混勻10min ，離心，離心4 000 rpm5min，取上清。，取上清。8.加入加入1/10體積體積3mol/LNaAc（pH5.2），2-3倍體積倍體積無水乙醇無水乙醇，充分混勻，充分混勻，DNA呈絮狀沉淀呈絮狀沉淀。9.離心離心12 000 rpm10 min，棄上清，加，棄上清，加1ml75%乙醇乙醇，振蕩，振蕩1min洗滌洗滌DNA。10.離心離心12 0

16、00 rpm5 min，棄上清，室溫干燥。，棄上清，室溫干燥。11.加入加入50l TE緩沖液緩沖液溶解溶解DNA。溶溶脹脹細細胞胞酚酚仿仿抽抽提提乙乙醇醇沉沉淀淀保存保存破核膜破核膜變性蛋白變性蛋白2021-11-1621Water phase (DNA)Water phase(DNA)proteins precipitatechloroform /isoamyl alcohol (lipids)STEP 62021-11-1622核酸的鑒定與分析核酸的鑒定與分析核酸的定性、定量分析1核酸凝膠電泳2核酸雜交技術(shù)3多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)4DNA測序52021-11-1623DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊

17、脂糖凝膠電泳 vDNA分子帶負電荷，在電場中受到分子帶負電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)、分分子篩效應(yīng)子篩效應(yīng)向向正極正極移動過程中移動過程中, 因因DNA分子的大小分子的大小及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異。及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異。v對于線形對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。量的對數(shù)值成反比。v電泳時加溴化乙錠（電泳時加溴化乙錠（EB），其與），其與DNA結(jié)合形成結(jié)合形成一種熒光絡(luò)合物，在一種熒光絡(luò)合物，在254365 nm紫外線照射下紫外線照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢測可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢測DNA。 202

18、1-11-1624v質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) 是染色體外小型（是染色體外小型（1-200kb1-200kb）的）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子，能自主復(fù)分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)v質(zhì)粒作為攜帶外源基因質(zhì)粒作為攜帶外源基因在細菌中克隆或表

19、達的在細菌中克隆或表達的重要載體，在基因工程重要載體，在基因工程中具有極其廣泛的應(yīng)用中具有極其廣泛的應(yīng)用價值。價值。2021-11-1625v質(zhì)粒的提純方法較多：質(zhì)粒的提純方法較多： 堿裂解法：堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS最常用的提取質(zhì)粒的方法最常用的提取質(zhì)粒的方法 煮沸法煮沸法: 沸水煮沸沸水煮沸40秒秒只用于小于只用于小于15kb的小質(zhì)粒的小質(zhì)粒DNA制備制備 SDS法：法：10%SDS適用于大于適用于大于15kb的大質(zhì)粒的大質(zhì)粒DNA制備制備 試劑盒：簡便、快速、抽提效率高試劑盒：簡便、快速、抽提效率高2021-11-1626質(zhì)粒抽提試劑盒質(zhì)粒抽提試劑盒 v采用了一種新型的

20、離子交換柱。在特定條件下，采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱使質(zhì)粒能在離心過柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，沉淀，1212個樣品只需不足個樣品只需不足3030分鐘即可完成。分鐘即可完成。2021-11-1627RNA的分離與純化的分離與純化vRNA是分子生物學(xué)的主要研究對象。其分離純化是分子生物學(xué)的主要研究對象。其分離純化主要包括總主要包括總RNA與與mRNA的分離與純化。的分離

21、與純化。vRNA分離與純化的關(guān)鍵是：分離與純化的關(guān)鍵是：防止防止RNase對對 RNA的降解。的降解。去除外源性去除外源性RNase的影響，的影響， 創(chuàng)造一個無創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境；的環(huán)境；抑制內(nèi)源性抑制內(nèi)源性RNase的活性；的活性；18s28s5s、5.8s等等2021-11-1628總總RNA的分離的分離Trizol試劑試劑v Trizol是一種用于細胞或組織總是一種用于細胞或組織總RNA抽提的試劑。抽提的試劑。v Trizol可以保持樣品中可以保持樣品中RNA的完整性，即可以有效抑制的完整性，即可以有效抑制RNA的的降解。降解。 抽提所得抽提所得RNA無無DNA和蛋白污染。一般所

22、得和蛋白污染。一般所得RNA溶于溶于DEPC水后的水后的A260/280值為值為1.6-1.8。v 抽提兩個樣品約需一小時。每一百萬細胞用抽提兩個樣品約需一小時。每一百萬細胞用Trizol抽提可得抽提可得5-15g RNA；每毫克組織用；每毫克組織用Trizol抽提可得抽提可得1-10g RNA。產(chǎn)。產(chǎn)量因細胞和組織不同而異。量因細胞和組織不同而異。v Trizol抽提所得抽提所得RNA可直接用于可直接用于Northern，點雜交，純化，點雜交，純化mRNA，cDNA克隆，克隆，RT-PCR等；也可以用于基因表達芯片分等；也可以用于基因表達芯片分析、高通量測序析、高通量測序(deep sequ

23、encing)等對等對RNA質(zhì)量要求較高的質(zhì)量要求較高的情況。情況。2021-11-1629操作步驟操作步驟1. 組織勻漿：先將組織剪切成小塊，放入普通玻璃勻漿器內(nèi)。每50mg-80mg組織加入1ml Trizol，勻漿。對于RNA完整性要求比較高的情況，推薦先液氮冷凍組織塊，然后在低溫下用研缽研碎組織，隨后再加入Trizol進行總RNA抽提。2. 室溫放置5分鐘，使樣品充分裂解。3. 每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混勻或猛烈晃動15秒，室溫放置2-3分鐘。4. 12,000g 4離心15分鐘，然后吸取含總RNA的上層無色水相至一新的離心管中，每毫升Trizol約可吸取0

24、.5-0.55ml。5. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀10分鐘。6. 12,000g 4離心10分鐘，在管底可見RNA沉淀，棄上清。7. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)，vortex或顛倒混勻。8. 7,500g 4離心5分鐘，棄上清。再用離心機甩一下（5,000rpm, 離心1秒），小心吸盡液體。9. 待RNA略干后，加入20l DEPC水溶解，-70凍存。2021-11-1630基因克隆技術(shù)2021-11-1632基本概念v克?。寺。╟lone）：）：來自同一始祖的相同副本或拷來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。

25、貝的集合。v克隆化（克隆化（cloning）：）：獲取同一拷貝過程。即無獲取同一拷貝過程。即無性繁殖。性繁殖。v基因克?。ɑ蚩寺。╣ene cloning）：）：按照人的意愿，在按照人的意愿，在體外將目的基因和載體體外將目的基因和載體DNA連接成重組連接成重組DNA，然后通過一定的手段倒入宿主細胞，使其在細胞然后通過一定的手段倒入宿主細胞，使其在細胞內(nèi)復(fù)制、擴增，獲得該目的基因的大量拷貝。又內(nèi)復(fù)制、擴增，獲得該目的基因的大量拷貝。又稱為稱為DNA克隆、分子克隆。克隆、分子克隆。v基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)2021-11-1634基本技術(shù)路線基本技術(shù)路

26、線1. 目的基因的獲取目的基因的獲取2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建克隆載體的選擇與構(gòu)建3. 外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接4. 重組重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌5. 重組體的篩選重組體的篩選6. 克隆基因的表達克隆基因的表達2021-11-16352021-11-1636化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因2021-11-1637從基因組從基因組DNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因genomic DNA library簡稱簡稱G-文庫，指存在于文庫，指存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆 體所體所攜帶的所有基因組攜帶的所有基因組DNA的集合的集合限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因

27、組DNA基因重組基因重組轉(zhuǎn)化細菌轉(zhuǎn)化細菌體外包裝體外包裝2021-11-1638從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因v cDNA文庫文庫（cDNA libraries ） 簡稱簡稱c文庫，指用細胞文庫，指用細胞總總mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄方式經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄方式制備全套雙鏈制備全套雙鏈cDNA后，后，建立的基因文庫。建立的基因文庫?；蛑亟M基因重組反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAmRNAcDNAcDNAdsDNAdsDNA2021-11-1639從基因文庫釣取目的基因從基因文庫釣取目的基因DNA librariesDNA libraries2021-11-1641v 載體（載體（vector）指能攜帶目的基因

28、進入宿主細胞，并）指能攜帶目的基因進入宿主細胞，并能進行自我復(fù)制的完整能進行自我復(fù)制的完整DNA分子。又稱克隆載體。其分子。又稱克隆載體。其中為表達出蛋白質(zhì)設(shè)計的載體又稱表達載體。中為表達出蛋白質(zhì)設(shè)計的載體又稱表達載體。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNAv 克隆載體克隆載體 噬菌體噬菌體DNA 病毒病毒DNA 2021-11-1642載體的選擇標準：載體的選擇標準：v能自主復(fù)制；能自主復(fù)制；v具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；的篩選和鑒定；v有克隆位點（外源有克隆位點（外源DNA插入點），常具插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；有多個單一酶切位點

29、，稱為多克隆位點；v分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNA。2021-11-1643質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)質(zhì)粒載體的一般結(jié)構(gòu)2021-11-1644普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)2021-11-1645載體pUC19的結(jié)構(gòu)圖pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI

30、 (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)2021-11-1646噬菌體（phage）DNAv可通過轉(zhuǎn)染方式將其可通過轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細菌體內(nèi)進行增殖。送入細菌體內(nèi)進行增殖。常用的為人工構(gòu)建的常用的為人工構(gòu)建的噬菌噬菌體載體。體載體。v依重組方式不同分為兩類：依重組方式不同分為兩類： gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克?。┛寺。?EMBL系列（置換型，系列（置換型，適用基因組克?。┻m用基因組克?。?021-11-1647其他l 柯斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒（cosmidcosmid）l 酵母人工染色體載

31、體酵母人工染色體載體（yeast artificial chromosome, YACyeast artificial chromosome, YAC）l 細菌人工染色體細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC）l 動物病毒動物病毒DNADNA改造的載體改造的載體（如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）2021-11-1648酵母人工染色體（YAC）2021-11-1649v限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction en

32、zymes，RE） 從細菌中分離提純的核酸內(nèi)切從細菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別并切開核酸序列酶，可以識別并切開核酸序列特定位點特定位點分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀vT4 DNAT4 DNA連接酶連接酶(T4 DNA ligase)分子膠水分子膠水2021-11-1650識別位點識別位點5 protruding ends3 protruding endsCohesive/sticky ends5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC-OH3-GGG- pp -GGG-3OH-CCC-5+SmaIblunt ends2021-11-1651連接策略連接策略v1. 粘端粘端DNA間的連接間的

33、連接 (1) 同一限制性內(nèi)切酶切割位點連接同一限制性內(nèi)切酶切割位點連接 (2) 不同限制性內(nèi)切酶切割位點連接不同限制性內(nèi)切酶切割位點連接v2. 平端平端DNA間的連接間的連接v3. 同聚物加尾同聚物加尾連接連接v4. 人工接頭人工接頭連接連接2021-11-16522021-11-1653宿主菌或受體細胞宿主菌或受體細胞大腸桿菌大腸桿菌 昆蟲細胞昆蟲細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞（competent cell）方式方式: : 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（ transfection ）感染（感染（ infection ）酵母酵母哺乳動物細胞哺乳動物細胞2021-11-1654l導(dǎo)入大腸桿菌導(dǎo)入大腸桿菌1. 氯化鈣轉(zhuǎn)化法氯化鈣轉(zhuǎn)化法2. 電擊法電擊法3. 體外包裝感染體外包裝感染法法l導(dǎo)入哺乳動物細胞導(dǎo)入哺乳動物細胞1. 顯微注射法顯微注射法2. 電穿孔法電穿孔法3. DNA-磷酸鈣共沉淀磷酸鈣共沉淀4. DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法5. 病毒感染法病毒感染法6. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體介導(dǎo)法7. 細胞融合法細胞融合法8. 原生質(zhì)體融合法原生質(zhì)體融合法9. 微細胞介導(dǎo)法微細胞介導(dǎo)法2021-11-16