科研常用生物學小常識PPT課件

1、OD (optical density，吸光度) OD260/OD280來判斷分子純度 當OD260/OD280 2.0，表示RNA含量較高 當OD260/OD280=1.82.0，表示DNA較純 OD260/OD230 的比值來判斷所得到的核酸中的鹽和小分子雜質(zhì)的殘留程度 對于核酸純制品，OD260/OD230應大于2； OD260/OD2302說明去鹽不充分 用于細胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒大提濃度最好能達到300ng/L以上第1頁/共23頁 堿基平均分子量324.5。 合成公司交給你的引物成品一般是會注明有幾個OD，正常情況下1個OD相當于33g 。第2頁/共23頁Tm值的簡單計算第3頁/共23頁蛋白

2、分子量估算 N(氨基酸數(shù)量) 110 Da第4頁/共23頁增加PCR特異性 鎂離子濃度 鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，引物退火，影響PCR產(chǎn)量和特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200M dNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM（注意：對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定； 促進PCR的添加劑 退火溫度，引物設(shè)計和鎂離子濃度

3、的優(yōu)化足以對大多數(shù)模板進行高特異性的擴增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。為獲得最好的結(jié)果需要模板的完全變性。PCR添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRx Enhancer Solution，可以增強擴增。它們可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。為獲得最佳結(jié)果，應優(yōu)化添加劑的濃度，尤其是會抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。第5頁/共23頁RNA提取與驗證 RNA完美提出來的話應該是三條帶：28s，18s，5.8s； 28s和18

4、s比較亮，而且28s是18s的2倍量，5.8s基本很模糊，可有可無； 28s是5.0kb，18s是1.9kb，5.8s 要小于200kb（人）第6頁/共23頁質(zhì)粒電泳圖解第7頁/共23頁細胞培養(yǎng)瓶（板）生長面積容量與細胞數(shù) 24孔板長滿了細胞大約有3X105個細胞。如果一天后要長到70（2.1x105），建議放1.2-1.4X105個細胞。 因為細胞剛放進去的前幾個小時需要粘在生長表面及適應新的生長條件， 不會達到24小時翻一倍的速度。 大約數(shù)目 96孔板 45X104 35mm培養(yǎng)皿 1X106 48 孔板 1.3X105 60mm培養(yǎng)皿 2.6X106 24孔板 2.5X105 100mm

5、培養(yǎng)皿 7X106 12孔板 5X 105 150mm培養(yǎng)皿 1.8X107 6孔板 1.2X106 細胞瓶面積 容量 工作體積 細胞數(shù)目 12.5cm2 25ml 2ml 5X10 5 25cm2 50ml 5ml 1X10 6 35cm2 75ml 10ml 2X10 6 75 cm2 250ml 15ml 4X 10 6 150cm2 700ml 40ml 1.1X10 7第8頁/共23頁Kozak sequence Kozak規(guī)則，即第一個ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計規(guī)律，若將第一個ATG中的堿基A，T，G分別標為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下： (1)第4位的偏好堿

6、基為G； (2)ATG的5端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基； (4)除-3，-6和-9位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。 需要指出的是，Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，并不絕對，而且對于不同的物種有所差別。第9頁/共23頁真核引物設(shè)計需在AUG前加上GCCACC加Kozark sequence(GCCACC)是用來增強真核基因的翻譯效率的。是最優(yōu)化的AUG環(huán)境，避免ribosome（核糖體）出現(xiàn)leaky scan第10頁/共23頁蛋白標簽蛋白標簽（protein tag）是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽

7、或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員相繼開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標簽。目前，這些蛋白標簽已在基礎(chǔ)研究和商業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)等方面得到了廣泛的應用。第11頁/共23頁標簽 純化促進溶解度抗體效價細胞標記His6+/-+/-Flag+/-+GST+MBP+His-MBP+HA+eGFP/CFP/YFP+Myc+His-Myc+His-AviTag+Sumo+His-Sumo+SNAP-Tag+HaloTag+第12頁/共23頁 TrxHIS His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于

8、純化和檢測；二是構(gòu)成獨特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。 使用His-tag有下面優(yōu)點： 標簽的分子量小，只有0.84KD，而GST和蛋白A分別為26KD和30KD，一般不影響目標蛋白的功能； His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強的蛋白得到應用，后者在純化包涵體蛋白時特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復性； His標簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA

9、相互作用研究； His標簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體。 可應用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和； 可以和其它的親和標簽一起構(gòu)建雙親和標簽。第13頁/共23頁 Flag標簽蛋白 Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。 FLAG作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白后具有以下優(yōu)點： FLAG作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FL

10、AG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高 FLAG作為標簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。 融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。第14頁/共23頁 HA HA標簽蛋白，標簽序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇，9個氨基酸，對外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 容易構(gòu)建成標簽蛋白融合到N端或者C端。易于用An

11、ti-HA抗體檢測和ELISA檢測。 c-Myc C-Myc 標簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標簽，標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質(zhì)框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細胞計量術(shù)中, 可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達。第15頁/共23頁 Avi Tag AviTag標簽蛋白是一個15個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后，可被生物素連接酶生

12、物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。Avi Tag標簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點: 無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個獨特的Avi Tag位點輕易且有效地被生物素化； 生物素化是通過酶和底物的反應來實現(xiàn)，反應條件相當溫和而且標記的專一性極高； 生物素Avi Tag只有15個氨基酸，對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小。第16頁/共23頁 MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白） MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白

13、。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。 純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達1M，但不能使用變性劑。如果要去除MBP融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用MBP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。第17頁/共23頁 GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶

14、) GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個，一個是因為它是一個高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。GST融合表達系統(tǒng)廣泛應用于各種融合蛋白的表達，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。 在大多數(shù)情況下G

15、ST融合蛋白是完全或部分可溶的。純化：該表達系統(tǒng)表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和樹脂進行純化。GST標簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。第18頁/共23頁 eGFP 增強型綠色熒光蛋白 激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長507nm eYFP 增強型黃綠色熒光蛋白 激發(fā)波長5

16、13nm，發(fā)射波長527nm eCFP 增強型青色熒光蛋白 激發(fā)波長433nm或453nm，發(fā)射波長475nm或501nm 優(yōu)點 不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，被譽為活細胞探針。 其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在細胞中的定位等情況。 同時細胞內(nèi)的其它產(chǎn)物不會干擾標簽蛋白檢測，從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。 其低消耗、高靈敏度檢測，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn)eGFP 表達標簽被廣泛地應用于基團表達調(diào)控、轉(zhuǎn)基因功能研究、蛋白在細胞中的功能定位、遷

17、移變化及藥物篩選等方面。第19頁/共23頁 SNAP-Tag SNAP-Tag是新一代的蛋白標簽技術(shù)，不僅專一性極高而且穩(wěn)定，最大的優(yōu)點是適用于多種環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測與純化，如活細胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相(如SDS-PAGE gels)等。SNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine -DNA-alkyltransferase）獲得。無論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價結(jié)合，使蛋白標記上生物素或熒光基團（如熒光素和若丹明）。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使

18、SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。苯甲基鳥嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒有其他蛋白會和這類物質(zhì)作用，所以SNAP標簽反應是高特異的。 檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進入細胞，方便快捷地進行活細胞內(nèi)SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 將純化的或未純化的SNAP-Tag融合蛋白與表面固定了苯甲基鳥嘌呤的基質(zhì)混合，蛋白即可特異與底物作用，形成共價鍵，融合蛋白間接被固定在了基質(zhì)表面上，可以達到更方便快捷地研究蛋白功能或純化蛋白的目的。第20頁/共23頁 Halo Tag HaloTag標簽蛋白是一種脫鹵素酶的遺傳修飾衍生物，可與多種合成的HaloTag配基有效地共價結(jié)合。這個分子量為33KDa的單體蛋白能融合在重組蛋白的N端