基因工程基本操作程序

1、 基因工程的基本操作程序蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因毒蛋白基因蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌棉花細(xì)胞棉花細(xì)胞 基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定一、一、目的目的基因基因的獲取的獲取主要是主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因獲取方法：獲取方法：1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因、從基因

2、文庫(kù)中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成、化學(xué)方法人工合成外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因補(bǔ)充補(bǔ)充:1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因、從基因文庫(kù)中獲取目的基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片斷，導(dǎo)入到片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為同基因，稱為基因文庫(kù)基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)基因文庫(kù) 基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部

3、分基因文庫(kù)(CDNA文庫(kù)文庫(kù))某生物體內(nèi)某生物體內(nèi)全部全部DNADNA 許多許多DNADNA片段片段受體菌群體受體菌群體1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因、從基因文庫(kù)中獲取目的基因限制酶限制酶與運(yùn)載體連接與運(yùn)載體連接 導(dǎo)入導(dǎo)入基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAmRNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體受體菌群體與運(yùn)載體連接與運(yùn)載體連接 導(dǎo)入導(dǎo)入部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）文庫(kù)）概念：概念：原理：原理：PCRPCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定物體外復(fù)制特定DNADNA片段的核酸合成技術(shù)片段的核酸合成技術(shù) 。

4、體外體外DNADNA復(fù)制復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。根據(jù)這一序列合成引物。（1 1）模板）模板DNADNA( ( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) （2 2）四種脫氧核苷酸）四種脫氧核苷酸(dNTP)(dNTP) （3 3）耐高溫的）耐高溫的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）2、利用、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、通過(guò)、通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成合成儀用化學(xué)方法人工合成推推測(cè)測(cè)推推測(cè)測(cè)合合成成 當(dāng)當(dāng)基因比較小基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷核苷酸

5、序列已知酸序列已知時(shí)，可采用此種方法。時(shí)，可采用此種方法。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建-核心核心基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+目的基因目的基因+終止子終止子+標(biāo)志基因標(biāo)志基因基因表達(dá)載體的組成三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和

6、動(dòng)植物細(xì)胞等。酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.1.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法2.2.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)3.3.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞Ca2+處理處理1.1.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：顯微注射技顯微注射技術(shù)術(shù)提純基因表達(dá)載體提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵體外顯微注射入受精卵受精卵移植受

7、精卵移植2.2.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱?dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞3.3.將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞常用原核生物作為受體細(xì)胞的原因：常用原核生物作為受體細(xì)胞的原因： 原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺原核生物特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等傳物質(zhì)相對(duì)較少等方法方法:Ca2+處理處理四、目的基因的檢測(cè)與鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插上是否插入了目的基因入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定

8、、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNADNA分子雜交分子雜交分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）（注意與上不同之處）抗原抗原抗體雜交抗體雜交基因探針：目的基因片段用放射性同位素標(biāo)記基因探針：目的基因片段用放射性同位素標(biāo)記基基因因工工程程的的基基本本操操作作程程序序目的基因的獲取目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn) + +

9、 目的基因目的基因 + + 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 + + 終止子終止子 + + 標(biāo)記基因標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法處理法DNADNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定鞏固練習(xí)鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該該抗性基因的主要作用是抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中

10、的耐藥性B.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C.增加質(zhì)粒分子的分子量增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中在遺傳工程技術(shù)中,限制性內(nèi)切酶主要用于限制性內(nèi)切酶主要用于 ( )A.目的基因的提取和導(dǎo)入目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測(cè)目的基因的提取和檢測(cè)C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合目的基因的提取與載體結(jié)合BD3.在遺傳工程技術(shù)中在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得離的方法獲得 ( )A.人的胰島素基因人的胰島素基因 B.蠶的蠶絲蛋白基因蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因 D.菜豆儲(chǔ)藏蛋白基因菜豆儲(chǔ)藏蛋白基因4.1976年年,美國(guó)的科學(xué)家首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放美國(guó)的科學(xué)家首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達(dá)并獲得了表達(dá),此文中的此文中的表達(dá)是指該基因在大腸桿菌表達(dá)是指該基因在大腸桿菌 ( )A.能進(jìn)行能進(jìn)行DNA復(fù)